全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(2)：142— 144 2005年 3月
影响农杆菌介导玉米愈伤组织
遗传转化因素的研究
农友业 ，何勇强 ，覃 燕 ，Rachid Loukehaich2，吴子恺
(1．广西大学农学院，广话南宁 530005；2．广西大学生命科学技术学院，广西南宁 530005)
摘 要：用农杆菌介导玉米愈伤组织的转化，其筛选的结果得到的抗性愈伤组织受玉米愈伤组织的继代时
间、浸染的农杆菌菌液浓度、共培养的温度以及其共培养时间等因素的影响。玉米愈伤继代后 7～9 d，农杆菌
浓度为 OD600值0．3左右、共培养温度约 22℃、培养时间 3 d时，抗性愈伤的获得率最高。
关键词：玉米；愈伤组织；农杆菌；转化；影响因素
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)02—0142—03
Study of influence factors on transformation
n ● 一 ‘ 一 一 ’
0t malze embryogenic callus by
Agrobacterium tumefaciens
NONG You—ye ，HE Yong—qiang ，QING Yan ，
Rachid Loukehaich2．W U Z i—ka i 1
(1．Agriculture College of Guangxi University，Nanning 530005．China；2．Li，f S Ⅲ “，f
Technology College of Guang．z i UniversitY，Nanning 530005．China)
Abstract：Embryogenic calUS of transformation of maize was generated by Ag robaczerium uTnefaciens．The
result showed that resistant calUS regenerated was influenced by the length of time of calus continuing cul—
ture，concentration of infecting A．tumefaciens，CO—culture temperature and the length of CO—culture time．The
percentage of resistant calUS regenerated was the highest when calUS continuing culture time was 8——10 d，in-
fecting A．thine faciens concentration was 0Dooo一0．3，the CO—culture temperature was about 22℃ and the CO—
CUlture time was 3 d．
Key words：maize；callUS；Agrobacterium futilefaciens；transformation；inflHence factors
玉米(Zea?nays L．)是一种重要的经济作物，具
有多种遗传特性，其遗传转化的研究一直受到重视。
到目前为止，己建立 1i’多种外源基因导人玉米受体
细胞的遗传转化方法。其中农杆菌和基因枪在玉米
遗传转化中担任着重要角色。大多数单子叶植物不
是农杆菌的天然宿主(De等，1976)。因此，农杆菌
介导的转化法长期未能在单子叶植物上得到应用。
自从 Gould等(1991)用根癌农杆菌与玉米茎尖培
养获得了转基因植株以来，农杆菌介导的禾谷类作
物的转化研究取得了很大的进展。Koziel等(1993)
培育出了抗虫的转基因玉米。农杆菌介导的遗传转
化有可以转移相对较大的 DNA片段，获得较多的
单拷贝转基因植株，转化效率高等优点(李新征等，
2000)，目前已成为研究的热点，在近年玉米的遗传
转化研究中得到广泛应用。但在农杆菌介导的玉米
遗传转化过程中，各种因素影响其转化效率(杨秀荣
收稿日期：2004—05—3l 修订 Et期：2004一lO—l8
基金项目：国家转基因植物研究与产业化专项项目(J00—003—03)
作者简介：农友业(1 966一)．男，广西宾阳人，在读博士生．讲师，植物基因工程专业。E—mail：younong@gxu．ed
． cn
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2期 农友业等：影响农杆菌介导玉米愈伤组织遗传转化因素的研究 143
等，2002；张艳贞，2003)。本研究就农杆菌介导玉米
遗传转化的几个影响因素进行探索，以寻找最佳的
转化条件，提高转化牢，为农杆菌介导玉米的遗传转
化研究提供参考。
1 材料与方法
1．1材料
玉米自交系农大 S 由广西大学农学院提供，农
杆菌 LBA4404携带的植酸酶基因为我们从米曲霉
中克隆 的 目的 基 因 (在 GeneBank的注 册 号为
AY603416)，构建植物表达载体 pCAM—phyA后转
化到农杆菌 LBA4404而得。基本的筛选培养基为
MS培养基无机盐，外加葡萄糖30 g／L，琼脂 7．5 g／
L，2，4一D 1．0 mg／L，水解酪氨酸 0．2 mg／L，脯氨酸
0．5 mg／L，头孢霉素 100 mg／L，潮霉素 2O mg／L。
1．2方法
取玉米自花授粉后 9～ll d长约 1．5～2 cm的
玉米幼胚，于诱导培养基中培养得到Ⅱ型愈伤组织
(图版I：1)。然后于继代培养基中继代，以此愈伤
组织作材料用于侵染。侵染后的愈伤组织都用基本
的筛选培养基筛选 3次，每次 15 d，最后得到抗性的
愈伤组织(图版 I：2)。
1．2．1受体材料的影响 分别取继代后 5、7、9、ll、
l4 d的愈伤组织为受体材料用于侵染，22。C共培养
3 d后筛选。
1．2．2农杆菌浓度的影响 分别以 ()I) 值为 0．1、
0．2、0．3、0．4、0．5的农杆菌菌液浓度仪染愈伤组
织，22℃共培养3 d后筛选。
1．2．3共培养温度的影响 以 OD 。。值为 0．3的农
杆菌菌液侵染后，分别在20、22、23、26、28。C条件下
共培养 3 d，然后筛选。
1．2．4共培养时间的影响 以 OD 。值为 0．3的农
杆菌菌液侵染后，分别于22℃共培养2、3、4、5 d，观
察其共培养时间对转化的影响。通过上述不同的培
养条件，以抗性愈伤组织的获得率来确定最佳介导
的外界条件。
2 结果分析
2．1受体材料的影响
用继代后不同时期的愈伤组织进行培养，其抗
性愈伤的获得率不同(表1)。以继代后7～9 d的愈
伤组织侵染，其抗性愈伤的获得率最高，为23．0
～ 25．3 。继代时，将愈伤组织切成大小约0．4 cm
的小块进行继代。继代后，愈伤组织重新恢复生长。
经百分率差异显著性测验结果表明，继代后第 7天
浸染与继代后第5天，第 1 1天，第 14天获得的抗性
愈伤组织数有极显著差异。侵染继代后5 d的愈伤
组织相对较小，而且没有达到旺盛生长期，侵染后很
容易死亡。继代后 ll～l4 d的愈伤组织已过了旺
盛生长期，其表面也开始变褐，逐渐老化，因此转化
率较低。而继后 7～9 d的愈伤组织大小适中，而且
处于旺盛生长期 ，其转化率较高。
2．2农杆菌浓度的影响
侵染时农杆菌的浓度过高，筛选时杀菌比较困
难，愈伤组织由于农杆菌生长过旺也容易死亡。农
杆菌浓度过低，农杆菌数量过少，转化效率也随之降
低。经百分率差异显著性测验结果表明，侵染的农
杆菌菌液浓度为 OD 。一0．3时比浓度为 ()D 。一
0．1时获得的抗性愈伤组织数有显著差异。侵染的
农杆菌菌液浓度为OD ∞值达 0．2～0．3为宜。尽
管农杆菌浓度在 OD 。为 0．2～0．5时，得到的抗性
愈伤组织差异不太明显，但浓度为 oD 。一0．2～
0．3时，已获得最高抗性愈伤数，此时农杆菌菌液浓
度为OD 。。值达0．2～0．3为宜，这样在筛选时杀菌
相对比较容易，也不会由于筛选培养时农杆菌过度
生长而造成愈伤组织死亡，选择菌液浓度太高或太
低抗性愈伤的获得率都低(表 1)。
2．3共培养时温度的影响
在玉米愈伤组织的诱导、继代、分化、生根的过
程中，均使用其生长的最适温度25℃，为了确定其侵
染的最适温度，设计了几个共培养温度。当共培养的
温度为22。C时，抗性愈伤组织的获得率最高。经百
分率差异显著性测验，分析表明，共培养温度22℃时
抗性愈伤组织的获得数与共培养温度为24、26、28℃
时抗性愈伤组织的获得数呈现极显著差异(表 1)。
2．4共培养时间的影响
共培养时间过短，农杆菌没有充分侵染愈伤组
织，获得的抗性愈伤组织少；共培养时间过长，农杆
菌过度繁殖，抑菌困难，农杆菌生长过旺，愈伤组织
容易死亡。共培养时间为 3 d时获得的抗性愈伤组
织数与共培养时间为1 d时获得的抗性愈伤组织数
呈极显著差异，与共培养时间为 5 d时获得的抗性
愈伤组织数差异达显著水平(表 1)，共培养时间为3
d最佳。
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144 广 西 植 物 25卷
表 1 受体材料、农杆菌浓度、共培养的温度及共培养时间对转化的影响
Table 1 Influence of infected different calus，density of Agrobcterium guT~e faciens
temperature of CO—-culture and time of CO—。culture on transformation
3
注：百分率差异显著性测验。*；0．05水平，差异显著；一 0．01水平差异极显著。
Note：Analysis of the significant diference of the percentage*：0．05 means significant
小结
农杆菌介导玉米愈伤组织转化的影响因素有许
多，在农杆菌介导玉米愈伤组织转化的研究过程中，
我们只对影响因素的主要四个因素进行总结，并且
只对一个基因型玉米进行研究 ，不同基因型玉米的
最佳介导条件会有差异。在此得到的四个最佳介导
条件在其他基因型玉米的介导中可能有所不同，在
此得到的结果只为农杆菌介导玉米愈伤组织转化的
研究提供参考。
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NONG You ye， f“f．：Study。f influence iactors CIyI transformation of maize
embryogenic callus by A r 6df， r “，J tu,gt# t“
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1．1型愈伤维织；2．筛选后得到的抗性禽伤组 ：
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