全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(6)：499— 502 2002年 11月
濒危植物七子花 DNA的提 取及分析
李钧敏 ，柯世省 ，金则新
(台州师范专科学校生化系 ，浙江临海 317000)
摘 要：用不同的方法抽提濒危植物七子花嫩叶 DNA，利用紫外分光光度法对其质量进行鉴定，以紫外分光
光度法及琼脂糖凝胶电泳一溴化乙锭染色法对其含量进行双重测定，显示适合七子花 DNA抽提的最佳方法
是改进的 SDS法，该法适合 RAPD分析 用此法对七子花植株不同器官的 DNA进行抽提，其含量分别是 ：嫩
叶>枝芽> 老叶>嫩茎 >老茎 。
关键词 ：七子花 ；DNA；含量
中图分类号 ：Q946．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-3142(2002)06-0499—04
Extraction and determination of DN A from
Hep tacodium m icon ioides
LI Jun—rain，KE Shi—sheng，JIN Ze—xin
(Department of Biology and Chemistry，Taizhou TeachersCollege，Linhai 317000，China)
Abstract：DNA was extracted from tender leaves of Heptacodium miconioides by using different methods．
The quality was determ ined hy UV spectrom eters and the quantity was doubly determ ined by electrophoresis
and spectrom eters．The best methods for the DNA extraction of Heptacodium m iconioides was improved SDS
method，which was suitable for PCR analysis．DNA was extracted from different organs of H eptacodium mi—
conioides using this method．It showed that the maximal DNA content was in tender leaves，and followed by
older leaves，twig，older stem，side-bud．
Key words：H eptacodium miconioides；DNA ；determination
七 子 花 (Heptacodium miconioides)属 忍 冬科
的单种属植物 ，为落叶小乔木 ，现资源极少，列为国
家首批二级保护植物(1]。为了研究七子花的致濒
机理，有必要对其遗传多样性进行分析，而获得高质
量的 DNA是进行分子生 物学研究 的前提。植 物
DNA抽提方法多种 ，针对不同的植物应采用不同的
方法。国内对七子花的研究很少，尤其是对七子花
的生理生化及分子生物学方面的研究未见报道。我
们综合文献报道 ，结合实验改进，利用不同的方法抽
提七子花嫩叶的 DNA，从 中筛选出最适方法，所抽
提 DNA适合 于 RAPD(random amplification poly—
morphism DNA，随机扩增多态 DNA)分析 ，并用此
方法对七子花植株不 同器官的 DNA进行抽提，为
七子花分子水平遗传多样性研究的进一步开展奠定
基础 。
1 材料与方法
1．1实验材料
于 2001年 5月下旬，将分布在浙江省天台山国
家森林公园狮子岩坑七子花林林缘的七子花 3年生
幼苗 ，分嫩叶(枝的最上面叶片)、老叶(枝的最下面
收稿 日期 ：2001-07—27
作者简介：李钧敏(1973一)，女，浙江临海市人 ，硕士 ，讲师 ，分子生物学专业，主要从事分子生物学教学与科研工作。
基金项 目 ：浙 江省 自然科 学基 金项 目(399203)；浙 江省教 委科研 计划项 目(1990367)。
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5OO 广 西 植 物 22卷
叶片)、嫩茎(当年生茎)、老茎(去年生茎)、枝芽 5个
部位进行采集 ，用湿 布包裹 ，塑料 袋 封装 ，立 即带 回
实验室 ，洗净，晾干，冻于一7O℃超低温 冰箱 中，备
用 。
1．2植物 DNA提 取方法
1．2．1方法一 根据刘康德等(2]的方法改进 ，将一7O
。C冻存叶片研磨 成 粉状 ，取 0．1 g转入 1．5 mL离
心管 中 ，加入 500 L提取缓 冲液 (3 可溶 性 PVP，
20 mmol／L 口一巯 基 乙 醇 ，20 mmol／L EDTA
(pH8．O)，8 000 rpm 离心 5 min，弃 上清 ，取沉 淀重
复洗涤 1次，再取沉淀加入 500 L裂解缓冲液(100
mmol／L Tris·HC1(pH8．0)，20 mmol／L EDTA
(pH8．O)，500 mmol／L NaC1，1．5 SDS)，65。C水
浴 30 min，不时轻轻颠倒 ，取出加入 500 L氯仿／
异戊 醇(24：1)，颠 倒成乳 浊状 ，10 000 rpm 离心 10
min，取上清加入 0．6(v／v)异丙 醇 ，置-20。C冰箱 3O
min，12 000 rpm 离心 10 min，取 沉淀 ，溶 于 100 L
TE(含 RNase 5 t-,g／mL)，37。C水浴 1 h，用等体积
的酚 、酚／氯仿／异 戊 醇 (25：24：1)、氯 仿／异戊 醇
(24：1)抽提 ，取上层 加入 1／lo(v／v)3 M NaAc，加
入无水 乙醇沉淀 ，一2O。C冰箱 30 min，12 000 rpm 离
心 10 min，沉 淀用 7O 乙醇洗 涤 ，晾 干后 ，溶 于 5O
L TE中，备用。
1．2．2方法二 根据姜玲等(3]方法改进 ，取-70。C
冻存叶片研磨成粉状 ，取 0．1 g转入 1．5 mL离心管
中 ，加入 700 L提 取缓 冲液 (500 mmol／L NaC1，
100 mmol／L Tris·HC1(pH8．O)，50 mmol／L ED-
TA(pH8．O)，1 SDS，20 mmol／L口一巯基 乙醇 ，1
可溶性 PVP)，65。C水 浴 30 min，加 入 1／3(v／v)5
mol／L KAc，冰上 放置 30 min，10 000 rpm 离 心 1O
min，取上清加入等体积氯仿／异戊醇(24：1)，其余
同方法 1．2．1。
1．2．3方法三 按照文献 [4]进行 。
1．2．4方法 四 根据尹佟 明等(5]方法改进，取一7O
℃冻存叶片研磨成粉状 ，取 0．1 g转入 1．5 mL离心
管 中，加入 500 L提取缓 冲液(100 mmol／L Tris·
HCl(pH8．3)，5 mmol／L EDTA (pH8．0)，500
mmol／L NaC1，1．5 SDS，350 mmol／L 口一巯 基 乙
醇)，65。C水浴 30 min，其余同方法 1．2．1。
1．3 DNA质与置 的紫 外分光光度法鉴 定
用岛津 UV-7401PC紫外 一可见分光光度计进
行紫外测定其 Az3o、Az6o及 A8o，以 Az6o／Azso代表
DNA的纯度与质量 ，以 Az6o／Az3o代表 DNA 中污
染杂质 的程度(z]。以 XDNA 为标准品，以 Az6o对
DNA进行定 量。
1．4 DNA的电泳分析及 DNA定量
DNA经 0．8 琼脂 糖凝胶 电泳 (1 XTAE，含 5
mg／mL溴化 乙锭)，电压 6V／cm，电泳 2～3 h，于紫
外透射反射分析仪 中 302 nm紫外光透射，Leica数
码相机 拍 照 。 电泳 图谱 经 UTHSCSA ImageTool
软件分析荧光面积 ，与标准 DNA分子量参照物 比
较定量而得 。
1．5 RAPD扩增 反应
采用 15 L PCR反应体系，内含 1XPCR反应
缓 冲 液 ，2．5 mM MgClz，0．1 mM 4 X dNTP，3U
Tag酶，2O ng模板 DNA，20 pmol引物。引物购 自
上海生工生物工程公司，其余试剂购 自上海华美生
物工程公 司 。
在上海高机公司生产的 sRX．481型 PCR仪 (6
。C循环水冷却)上进行 PCR反应，PCR反应参数
为 ：94。C 5 min 1个循 环 ，再 94。C 1 min，40。C 1
min，72。C 2 min 40个循环；再 72。C延伸 5 min。
扩增产物取 1O L在 1．4 琼脂糖凝胶(1×TAE)
上进行电泳分析，溴化乙锭染色，于紫外透射反射分
析仪观察并 Leica数码相机拍照。
2 结果与分析
2．1不 同方法抽提 七子花嫩 叶 DNA的质量与产 量
用不 同的方 法抽 提七 子 花 嫩 叶的 DNA，从
DNA溶液色泽 上来看 ，方法 一所 得 的 DNA 基本上
是无色 的；而方法 四所 得 DNA 的色 泽为浅 褐色 ，可
能污染有色素或醌类物质 ，证明污染有一定的杂质；
方法二所得 的 DNA 的 色泽 为 黄褐 色 ，污染 有 较 多
的杂质。各种方法抽提的 DNA经紫外分光光度法
分析结果如表 1所示 ，凝胶 电泳结果如图 1所示。
由表 1可知方法一所抽提 DNA 的纯度较高，含较
少的杂质。从紫外分光光度法与琼脂糖凝胶电泳双
重定量可知方法一的得率也较高，可达 51．7 t~g／g
鲜重，其次为方法四，得率为 25．1 t~g／g鲜重。按文
献所述的 CTAB法进行七子花 DNA 的抽提，在琼
脂糖凝胶电泳上只可见微弱条带的存在。通过增加
CTAB浓度至 2 ，可以抽提到如图 1所示 的结果。
从以上结果分析可知 ，方法 1最适合于七子花 DNA
的提取。另外 由图 1可知，所抽提的 DNA的分子
量都在 23 kb以上，确定是基因组 DNA。
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6期 李钧敏等 ：濒危植物七子花 DNA的提取及分析 501
2 3 4 M
— — 6800bp
一 9416bp
- 231 30bp
一 加样孔
图 1 不 同方法抽提七子花 DNA凝胶 电泳结果
Fig．1 The agarose gel analysis of Heptacodium
miconioides DNA extracted with different methods
不同方法抽提的七子花 DNA的 0．8％琼脂糖凝胶电泳
(含 5 mg／mL溴乙锭)鉴定，1×TAE缓冲液，6 V／cm
电压强度。1～4：方法一至四，抽提七子花 DNA。
M：ADNA／Hin dⅢ标准分子量参照物。
Heptacodium miconioides DNA extracted with different meth—
ods was determined by 0．8 agarose gel(including 5mg／ml
EB)，1×TAE buHer，6V／cm voltage intensity．1～4：Heptaco—
dium miconioides DNA extracted with different methods listed in
Methods．M ： DNA／Hin dⅢ molecular weight standard．
2027bp、
2322bp——
加样孔一
M 1 2 3
图 2 引物 $3O2的 RAPD图谱
Fig．2 RAPD profiles generated by primer$302
M： DNA／H抽 dⅢ标准分子量参照物。1～3：RAPD反应
成分中的 Tag酶分别为 2U、3U、4U。
M ：ADNA／Hin dⅢ molecular weight standard．1～3：The units
of Taq polymerase in RAPD was 2U ，3U and 4U for each．
为了了解方法一所抽提的 DNA是否适于分子
生物学的操作 ，我们将所提取的 DNA用 1O个碱基
的随机 引物 $302进 行 了 PCR分析，可得清晰的
RAPD谱带(图 2)。
表 2 七子花不同器 官 DNA结果 比较
Table 2 The results of Heptacodium miconioides DNA extracted from different organs
2．2七子花植株不 同器官 DNA含量 的 比较
植物不同的器官由于其结构的不同，所抽提得
到的 DNA的质量与产量都会有一定 的影响，为了
了解七子花植株不同器官的 DNA的含量，为七子
花分子生态学的研究奠定基础，我们对七子花的嫩
叶、老叶、嫩茎、老茎、枝芽 的 DNA进行了抽提与分
析 ，结果 如表 2、图 3所 示 。
由表 2及图 3可知，嫩叶抽提的 DNA产量最
高，质量最好，适合于进一步的分子生物学操作，而
其余部位所 抽提的 DNA 或多或少含有一定 的杂
质，尤其是老茎 ，其 Az6o／Az3o仅有 0．69。从得率上
看 ，嫩 叶> 枝 芽 > 老 叶> 嫩 茎 > 老茎 ，由于 RAPD
分析等所需 DNA 的量非常少，因此嫩叶是作为七
子花 DNA提取的一种理想器官。一般地叶片应越
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502 广 西 植 物 22卷
6800bp——
9416bp一
231 30bp一
加样子L—
M 2 3 4 5
图 3 七子花不同器官 DNA凝胶 电泳结果
Fig．3 The agarose gel analysis of H eptacodium
miconioides DNA extracted from different organs
七子花不同器官 DNA0．8％琼脂糖凝胶电泳(含 5 mg／mL溴乙
锭)鉴定 ，1xTAE缓冲液，6 V／cm 电压强度。M：2DNA／Hin
dlI标准分子量参照物。1～5．七子花的不同器官的DNA，分别
为嫩I1 、老叶、嫩茎 、老茎、枝芽。
Heptacodium miconioides DNA extracted with different meth—
ods was determined by 0．8％ agarose gel(including 5 mg／mL
EB)。1 X TAE bufer，6 V／cm voltage intensity．M ；2DNA／
Hin dII molecular weight standard．1～ 5．Heptacodium mico—
nioides DNA extracted from different organs，it was tender leav—
as，older leaves，twig，older stem and side-bud for each．
嫩越好，这样有利于 DNA的质量的进一步提高。
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