全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(3)：406—409 2007年 5月
广西地不容种质资源的 ISSR分析
覃 艳，黄宁珍 ，赵志国，李 锋
(； 墓广西植物研究所，广西桂林54106)
摘 要：采用简单序列重复区间扩增(ISSR)分子标记技术对广西地不容 3个野生居群和 1个引种居群共 92
个个体进行了遗传多样性研究。1O个引物共扩增出 61条带，其中 6O条具多态性，多态性位点百分率为
98．36 。4个居群多态性百分率在73．77 ～86．89 。Nei’S基因多样性指数(H)为0．337 9，Shannon信息
多样性指数(I)为0．505 5。3个野生居群Nei’S遗传分化系数(Gst)表明：83．87 遗传变异分布在居群内，
16．13 的遗传变异分布在居群间。引种居群与 3个野生居群间的遗传一致度达 0．884 6。引种居群有效地
保护了广西地不容的遗传多样性。
关键词：广西地不容；遗传多样性；ISSR；种质资源
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：100O一3142(2007)03一O4O6一O4
ISSR analysis on the germplasm resources
of Stephania kwangsiensis
QIN Yan，HUANG Ning-Zhen ，ZHAO Zhi-Guo，LI Feng
(Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and the
ChinvseAcademy of Sciences，Guilin 541006，China)
A~tmct：The genetic variations among the introduced population and three wild populations of Stephanis kwangsien-
sis were analyzed by ISSR marker．Ten primers gave rises to 61 disemibles DNA bands，of which 61(98．36 )were
polymorphic，indicating a considerable genetic variation at specific leve1．At the population level，the percentage of
polymorphic bands(PPL)was from 73．77 to 86．89 ．Genetic diversity analysis showed that Nei’S gene diversity
(H)was 0．337 and shannon’S genetic diversity index(I)was 0．505 5．Based on Nei’S Gst value of three wild pop-
ulations，a large proportion of genetic variance(83．87 )was among individuals within population，while only a small
proportion(16．13 )genetic variance was among populations．Genetic identity between the introduced population
and three wild was 0．884 6．The introduced population effectively protected the genetic diversity of S．kwangsiensis．
Key wordst Stephania kzoangsiensis；genetic diversity ISSR；germplasm resource
广西地不容(Stephania kwangsiensis)属防己
科千金藤属多年生草质落叶藤本植物，产于广西西
北部至西南部、云南东南部，生于石灰岩地区的石山
上(中国科学院中国植物志编辑委员会，1996)。在
广西主要分布于百色地区靖西、凌云、那坡等县，是
广西壮族等少数民族民间常用草药，其块根是生产
中药颅痛定的重要原料，在临床上用于镇痛、镇静、
解热等(王宪楷等，1990)。近年来广西地不容受到
人为的乱采滥伐等因素的影响，生存受到威胁，个体
数量变得稀少。而物种的遗传多样性是物种长期进
化的产物，也是其生存和发展的前提。对稀有濒危
植物遗传多样性和遗传结构的研究，是探讨其适应
性、生存力的基础，也是分析致濒机理的基础，从而
帮助制定科学有效的保护策略和措施(李海生等，
收稿日期：2005-10—19 修回日期 ：2006-03—11
基金项目：广西科技攻关项目(0322024-3B)[~ppond by Key Teehnologies Research and Devdopment Program of GIlang (0322024-3B)]
作者简介：覃艳(1976一)，女，广西柳州人．礤士生，研究方向为保护生物学
通讯作者(Author for c0rresp0ndence．E-mail：huangnz@gxib．cn)
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3期 覃艳等：广西地不容种质资源的 ISSR分析 407
2004)。由于广西地不容资源及地理分布的局限性，
以往的研究集中在分类、有效成分的分离与鉴定以
及药理活性的初步研究(闵知大等，1980；成桂仁等，
1981)，缺乏在分子水平上遗传多样性方面的研究报
道。ISSR(inter-simple sequence repeat)是由 Ziet—
kiewicze等(1994)创建的一种简单序列重复区间扩
增多态性分子标记。该技术具有 DNA样品用量
少、操作简单无需预先知道受试基因组 DNA序列、
结果记录方便、实验成本低、能提供丰富的关于基因
组的信息等优点，是比较理想的分子标记技术。IS—
SR分子标记已用于小麦、水稻等大田作物和苹果、
柑橘等果树的遗传分析研究，在中草药中的应用报
道较少。本研究采用 ISSR分子标记来研究广西地
不容遗传多样性水平和遗传结构，为寻找、保护和利
用优良的种质资源提供基础资料和科学依据。
1 材料和方法
1．1植物材料
根据广西地不容的地理分布情况，选取分布较
集中的广西靖西、凌云、那坡等三个地区为采样点，
引种居群是从广西靖西、凌云、那坡等县引种，栽培
于桂林植物园中。随机选取居群内的个体作为样
本，凌云居群和引种居群分别取样 24个个体，靖西
居群和那坡居群分别取样 22个个体，每株采取 5～
6片嫩叶，用硅胶干燥保存。各居群的产地及生境
特点等见表 l。
1．2 DNA提取
用 CTAB法 (Doyle等，1987)提取植株的总
DNA，以北京鼎国生物技术有限责任公司生产的
DNA片段快速纯化／回收试剂盒纯化总 DNA，用
1．0 琼脂糖电泳检测 DNA质量。
1．3 ISSR反应条件及程序
ISSR—PCR扩增反应 条件确定 为：25 L的
PCR反应液内含：模板约 6O ng，1UTaq酶，2．0
mmol／L MgCI2，10 mmol／L Tris—HCI pH8．3，
5．0mmol／L KCI，4种 dNTP各 0．2 mmol／L，引物
0．3／~mol／L。PCR扩增条件：94℃预变性 5 min，
然后进行 4O个循环：94℃变性 l min，52℃复性 45
S，72℃延伸 2 min，循环结束后 72℃延伸 5 min。
PCR产物在 1．5 琼脂糖上电泳，溴化乙锭染色，凝
胶成像仪上观察照像、记录。
1．4引物筛选
ISSR引物序列是根据加拿大British Columbia
大学公布的序列设计，由上海 Sangon公司合成，从
9个引物中选出 lO个扩增条带较多、信号强、背景
清晰的引物用于 ISSR—PCR反应(表 2)。
表 1 广西地不容样品的产地和生境
Table 1 The localities and habitats of the
samples of Stephania kwangsiensis
居群 产地 S采
am
样
pl
数
inPopulation Locality g
生
Ha
境
bitat
。 ；，6
6
表 2 ISSR引物序号与引物扩增情况
Table 2 List of ISSR primers and their
sequences and amplification
引物 序列(5 一3 ) 统计位点数 多态位点数
Primer Sequence(5-3 ) No．of loci No．of polymorphie loci
808 (AG)8C 7 7
811 (GA)8C 7 7
815 (CT)8G 5 5
817 (CA)8A 7 7
818 (CA．)8G 7 7
825 (AC)8G 6 5
827 (AC)8G 7 7
855 (AC)8YT 6 6
857 (AC)8YG 6 6
866 (CTC)5 4 4
Note：Y=C orG．
1．5扩增产物和差异带的分析方法
根据各分子标记的迁移率及其有无统计所有的
二元数据，有带记作 l，无带记为0，强带和弱带的赋
值均为 l。对于多态位点，选取在重复实验中能稳
定出现的差异带用于数据分析。
用POPGENE32软件统计下列参数(1)多态性
位点百分率(PPL)；(2)Nei’s基因多样性指数(H)
(Nei，1973)；(3)Shannon信息多样性指数 (I)；(4)
总居群基因多样度(Ht)和各居群基因多样度(H )；
(5)基因流(Nm)和基因分化系数(Gst)；(6)Nei’S
遗传距离(D)(Nei，1972)和遗传一致度。
用 NTSYS—PC2．1软件计算单株间的Nei’S遗
传距离(Ne)，并用 UPGMA法进行聚类分析。
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408 广 西 植 物 27卷
2 结果与分析
2．1广西地不容的 ISSR遗传多样性
筛选的 1O个引物对 92个样品进行 PCR扩增
(图1)共检测到 61个位点，其中多态性位点 6O个，
占总位点数的98．36 ，每个引物扩增的位点数 4～
7个。扩增的条带在 300～2 500 pb之间。4个居
群的 Nei’S基因多样性指数为0．337 9，4个居群的
Shannon信息多样性指数为 0．505 5。
2．2广西地不容三个野生居群遗传变异的分析
POPGENE分析结果(表 3)，广西地不容 3个野
生居 群 总 PPL为 98．36 ，居 群 内 的 PPL在
73．77 ～86．89 之间；Ne’S基因多样性指数为
0．305 0：Shannon信息多样性指数为 0．489 9(表
3)。基因多样度为 0．271 4；基因分化系数为0．161
3，表明居群间遗传变异占总遗传变异的 16．13 ，
居群内的遗传变异占遗传变异的 83．87 ，遗传变
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M 13 14 15 16 17 18 19 20 21 23 24
图 1 引物825对凌云居群(LY)样品扩增产生的谱带
Fig．1 ISSR bands of Lingyun(LY)population samples amplified with primer 825
表 3 广西地不容居群遗传变异统计
Table 3 The genetic variation statistics among
populations of Stephania kwangsiensis
表 4 广西地不容居群间 Nei’s(1972)遗传一致度
(右上角)和遗传距离(左下角)
1’able 4 Nei’s(1972)genetic identity(top right
corner)and genetic distance(bottom left
corner)of Stephania kwangsiensis
异主要分布在居群内的个体间；基因流为 2．599 2。
居群间的遗传距离矩阵和遗传一致度(表 4)，引种
居群与3个野生居群的平均遗传一致度达0．884 6。
2．3聚类分析
根据个体间的遗传距离(Nei，1979)对靖西、凌
云、那坡三个野生居群共 68个个体进行 UPGMA
聚类分析，基于相似性系数(Nei和 Li的系数)得到
的聚类树状图见图 2。除了凌云居群聚在一起，那
坡和靖西2个居群没有按各 自居群聚在一起，这进
一 步表明居群间的遗传分化较小。
3 讨论
利用简单重复序列 ISSR标记对不同物种基因
组 DNA进行扩增，其多态性表现不同，如果蔗种质
资源 PPL为 61．35 (王水崎等，2003)，大蒜种质
资源的 PPL为 5O．21 (陈听等，2005)，鱼腥草种
质资源 PLL为 92．3 oA(吴为等，2003)，本研究结果
表明广西地不容种质资源 PLL为 98．3 ，靖西、凌
云、那坡三个野生居群的 PPL分别为 86．89 、
83．61 、73．77 ，引种居群的 PPL为 85．25 ，表
现了较高的遗传多样性水平。3个野生居群的 Gst
为 0．161 3，表明居群间的遗传变异占总遗传变异的
16．13 9，5，83．87％的遗传变异分布在居群内的个体
间。居群内的遗传多样性水平较高，但居群问的遗
传分化不明显。
广西地不容为多年生草质藤本植物，单性、雌雄
异株，异交，这样的生物特征使广西地不容有较高的
遗传多样性水平，3个野生居群问的基因流高达
2．599 2，由于地不容长期生长在特殊的地理环境，
为石灰岩地区特有植物，主要靠风力、昆虫、鸟等动
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3期 覃艳等：广西地不容种质资源的 ISSR分析 409
0．63 0．73 0 83
Coeffi ci ent
图2 广西地不容个体 UPGMA聚类图(居群代号同表 1)
Fig．2 UPGMA dendrogram of the 68 samples of
Stephania kwangsiensis
物载体传播花粉及种子，造成较大的基因流动。3
个野生居群的Gst仅为 0．161 3，显示出高水平的居
群内变异而低程度的居群间分化。影响居群遗传结
构的因素很多，如繁育系统、分布范围、种子传播机
制等(Hamrick，1987)。靖西和那坡两个居群间的
距离较近，且立地及气候条件较相似，两居群的植物
个体问有很近的亲缘关系。用 UPGMA法对野生
居群 68个个体之间进行聚类分析，结果表明除了凌
云居群外，其他 2个居群中的个体并非单独聚为一
类，也表明了这一点。远交降低了结合配子问的一
致性，提高重组率，加上远交能促进花粉运动和远距
离基 因流，从而避免居群 出现分化 (Brown等，
1989)，因而检测到的遗传变异主要分布在居群内。
在取样时，很难发现地不容的幼苗存在，原因可
能是广西地不容种子的种壳很硬，大多数情况下胚
很难冲破种壳萌发，种子贮存时间过久或过度干燥，
都会影响其活力，因此繁殖能力较差，再加上种子较
小，果实落地后易受虫子啃食或是被风吹后，生长地
可能缺乏种子萌发、幼苗生长的立地条件，所以其只
能以小群落、低数量状态存在。
根据我们的调查广西地不容已属稀有濒危植
物。保护广西地不容除应在其天然生长地实行就地
保护，保护其生境，制止乱采滥伐外，还应进一步实
施迁地保护工作。保护物种，从某种意义上说，就是
保护物种的遗传多样性或进化潜力。种内遗传多样
性或变异性愈丰富，物种对环境变化的适应能力愈
大，其进化的潜力也就愈大(施立明，1990)。从研究
结果来看，引种居群与三个野生居群遗传多样性差
异不大，平均遗传一致度高达 0．884 6。表明迁地保
护的广西地不容很大程度上保持了原生居群的遗传
多样性，引种保护较为成功。为了全面保护该物种
的遗传多样性，还应加强对其采种育苗和引种等方
面的工作，尽快让居群数量得以恢复，这方面的工作
近年来广西植物研究所已取得了一定的进展。
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3期 孙丽娜等：桔梗 RAPD反应体系的优化 413
图 6 优化后反应体系的 RAPD结果
Fig．6 The result of optimized reaction system on RAPD analysis
RAPD进行优化，而本实验经过多次重复，都能很好
地反映以上结果。利用 UBC公司(加拿大)引物优
化的体系在对于华美公司合成的引物(如 OPD19)
扩增时得到很好的 RAPD图谱(图 6)，这说明不同
公司的引物可用于本文优化的RAPD体系。
因此本实验得出桔梗 RAPD扩增反应的最佳体
系为：在 20 L PCR反应体积中，模板 DNA 20 ng，
dNTP 150／~mol／L，引物 0．3／~mol／L，Md 为 1．5
mmol／L， FaqDNA聚合酶 1 Unit，10×Bufer 2．0 L。
按照优化的 RAPD条件进行实验，重现性 良好。
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