全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(3)：275—277 2004年 5月
高效液相色谱法检测发酵液中木糖和木糖醇
方 宏，曾健智，张厚瑞
( 墓广西植物研究所。广西桂林54106)
摘 要：建立高效液相色谱检测发酵液中木糖和木糖醇含量的分析方法。色谱柱为 Hypersil NHz柱(4．6
mm i．d．×250 mm，5 vm)，柱温 35℃，流动相为乙腈一水(80：20)，流速 1．o mL．minq，示差折光检测器检
测。木糖和木糖醇在 3．0～60 mg．mL- 范围内，峰面积与其浓度线性关系良好(r=0．9995)；平均回收率分别
为 96．07 (n=5，RSD=0．51％)和 97．47 (n-5，RSD=1．13 )。方法简便、快速、准确。
关键词；木糖；木糖醇；发酵；高效液相色谱
中图分类号：’Q946 文献标识码；A 文章编号；1000—3142(2004)03—0275—03
～ 』 ■ 』■ n ■ 1 l●· _ ● Determ inatiOn OtXV10Se and xy itolin
fermen
．
tation broth by high performance
liquid chromatography
FANG Hong，ZENG Jian-zhi，ZHANG HOU—rui
(Guangxi Institute of Botany，Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and Academia Sinica，Guilin 541006，China)
Abstract：A method for the determination of xylose and xylitol in fermentation broth by high performance liq-
uid chromatography is described．The operating conditions were Hypersil NHz column(4．6 mm i．d．×250
mm，5~tm)at 35℃ and differential refractive index detector．Mobile phase was acetonitrile-water(80：20；vol—
ume ratio)and the flow-rate was 1．0 mL．min-1．The linear range was 3．0 mg．mL-1 tO 60．0 mg．mL-1，the cor—
relation coefficient was 0．999 5．The corresponding average recoveries were 96．07 (n-5，RSD=0．51％)and
97．47％(n=5，RSD=1．13 )respectively．The method is simple，rapid and accurate．
Key words：xylose；xylitol；fermentation process；high performance liquid chromatography
木糖醇为白色结晶粉末，易溶于水，其甜度相当
于蔗糖，热量相当于葡萄糖。木糖醇在人体内代谢
无需胰岛素参与，不会引起血糖水平波动，可作为糖
代谢异常患者的糖代品(郑建仙，1995)；木糖醇还有
特殊的防龋功能，应用于口香糖、果汁、糕点和冰淇
淋等食品中，受到了消费者的欢迎。
微生物发酵工艺生产木糖醇，已经取得了许多
重要的研究进展(孙昆山等，2001)，但距工业化应用
还有一段距离，在大量的实验工作 中，快速、准确地
测定木糖及其转化产物木糖醇的含量，对于木糖醇
高产菌株的筛选 ，发酵工艺的优化都十分必要。有
关含量测定中的比色法(Deschatelets和 Yu，1986；
Song和Amold，1977)，专属性差，准确度低；气相色
谱法(中国食品添加剂生产应用工业协会，1999)选
择性高，灵敏度也高，但糖类分子问引力较强，挥发
性弱，遇热又不稳定，不能直接用气相色谱分析，必
须制成易挥发的衍生物，操作繁琐。液相色谱分析
糖类化合物已有许多报道(刘云惠，2000；Clement
收稿日期：2003—06—20 修订 日期 ：2003—09—24
基金项目：广西自然科学基金资助项目(9811015)
作者简介；方宏(1957一)，女，浙江黄岩人，实验师，应用化学专业。从事植物化学分析。
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等，1992)，但同时测定糖和糖醇的报道较少。本文
采用氨基键合分析柱，用高效液相色谱检测发酵液
中的木糖和木糖醇，获得了良好的分离，方法简便、
快速、准确。
1 实验部分
1．1仪器与试药
美国Waters高效液相色谱仪：410示差折光检
测器，510高压泵，U K手动进样器，Baseline 810色
谱工作站。【)-木糖(D-xylose，生化试剂，上海试剂
二厂)；木糖醇 (xylitol，SIGMA公司)；乙腈(色谱
纯，o．5／zm滤膜过滤)，甲纯(分析纯)，重蒸水(O．5
／zm滤膜过滤)d
1．2色谱条件
检测器：Waters 410示差折光检测器；色谱柱：
a
0 2 4 6 8
t／min
b
Hypersil NHz(4．6 mm i．d．×250 mm，5 ln，大连
依利特公司)；柱温 ：35℃；流动相：V(乙腈)：V(水)
=80：20；流速：1 m L．min- ；进样量：1O L。
1．3样品的制备
菌种：热带假丝酵母菌(Candida tropicalis AS
2．177 6)。种子培养基：1 葡萄糖，2 木糖，1．5
KH2PO4，0．3 NH4H2PO4，0．1 MgSO4·7H2O，
1 酵母膏，3O℃恒温，200 r／min摇床培养 12 h。
发酵 培 养 基：15 木 糖，1．5 KH：PO。，0．3
NHtHzPO ，0．1 MgSO ·7H2O，1 酵母膏，在
250 mL锥形瓶中装入 25 mL发酵培养基，灭菌后
接人 1 mL种子液，3O℃，200 r／rain摇床培养 间
隔 6 h取一次样 、每次取 2 mL发酵液(至木糖消耗
完停止取样)，离心去除菌体，上清液加入 2 mL甲
醇，再离心去除沉淀，将上清液移至 5 mL容量瓶
中，用5O 甲醇定容至刻度。供高效液相色谱检测。
2
10 0 2 4 6 8
t／mjn
10 0 2 4 6 8 10
t／min
图 1 标准品和样品的色谱图
Fig．1 Chromatogram of the standard and the samples
a．标准品·b．样品(发酵)·样品(未发酵)·1．木糖·2．木糖醇．
a．Standard!b．Sample(fermentation broth)，c．Sample(no fermentation broth)I 1．xylose 1 2．xylito1．
2 结果与讨论
2．1分析条件的选择
2．1．1色谱条件的选择 在高效液相色谱分析中，
用于糖类检测的糖分析专用柱，价格昂贵；普通氨基
键合分析柱，也能用于单糖和双糖的检测，价格较为
便宜。因此我们采用氨基键合分析柱，对甲醇一水、
乙腈一水二元溶剂系统的分离情况分别进行考察，
结果前者木糖和木糖醇的组分峰重叠，较难分离；后
者分离情况较前者为好，以流动相乙腈：水=80：20
(V／V)时，达到了较好的基线分离效果(图 1)。
2．1．2柱温对分离的影响 柱温对分离的影响(图
2)，从图 2可见，在选定的条件下，以柱温 3O℃时分
离最佳，达到基线分离；35℃时接近基线分离，其分
离度接近理想测定要求。考虑到南方春、夏、秋季节
气温较高，为了便于在室温的环境下操作，我们选择
35℃进行检测。
∞
髓
25 3O 35 40 45 5O 55 60
柱温 Cloumn temperature／C
图 2 柱温对分离度的影响
Fig．2 Effect of column temperature on resolution
2．1．3制样溶液的选择 木糖和木糖醇易溶于水，
微溶于甲醇、乙腈。以木糖做溶解试验，2O℃时，在
1 mL 8O 乙腈水溶液中JnA 20 mg木糖，可完全
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3期 方 宏等；高效液相色谱法检测发酵液中木糖和木糖醇 277
溶解；若加入 3O mg木糖，会因溶解不完全使溶液
呈现上、下层的分层现象，故不宜用流动相配制样
品。若以水溶液直接进样，发酵液中的水溶性杂质
也同时进人分析色谱柱，滞留在柱中，污染柱子，影
响柱寿命。因此必须选择合适溶剂来配制样品，经
实验，2O℃时，l mL 5O 甲醇水溶液中加人 250
mg木糖，可完全溶解，以此溶液配制样品，发酵液
中的部分水溶性杂质可沉淀除去。另外，木糖醇在
5O 甲醇水溶液中的溶解能力稍大于木糖，故我们
选择 5O 甲醇水溶液制样，可有效地保护色谱柱，
延长柱寿命。
2．2线性关系试验
准确称取 I)-木糖，木糖醇对照品各 3．000 0 g，
置于5O mL容量瓶中，用 5O 甲醇溶解并稀释至刻
度，摇匀。精密吸取 0．5、1．0、2．0、4．0、6．0、8．0、
i0．0 mL，置 lO mL容量瓶中，用 5O％甲醇定容至
刻度，即得混合对照品系列溶液。分别取上述溶液
lO L，注入液相色谱仪，以峰面积 A(／~V·S)为纵
座标，质量浓度 C(mg．mL- )为横座标进行线性回
归，结果表明：木糖和木糖醇在 3．O～6O mg．m 范
围内，峰面积与其浓度线性关系良好。
木糖：C(mg．mL )一0．642 7+8．697 8×10
×A，r一0．999 7。
木糖醇：C(mg．mL- )一0．934 9+6．362×10
×A，r一0．999 5。
以两倍噪音计算最小检测量分别为0．3 mg．
mL- 和 0．2 mg．mL- 。
2．3回收率试验
精密吸取供试样品溶液 1．0 mL(已知木糖、木
糖醇含量)，置于 5 mL容量瓶中，共取 5份，准确加
入混合对照品溶液 ．0 mL，5O 9／6甲醇定溶至刻度，
摇均。离心过滤，上清液按照(1．2)项的色谱条件测
定，结果见表 1。
2．4精密度和稳定性试验
取一个供测试的样品溶液，按照上述色谱条件进
样检测，重复测定5次，木糖和木糖醇的RSD值分别
为0．54 和 0．33 。将样品放置 2、6、24 h，再进样
检测，结果峰面积基本不变，表明24 h内溶液稳定。
表 1 回收率试验结果(n一5)
Table 1 Analytical results 0f recovery test(n~5)
组分 Component
发酵时问 Fementation time(h)
0 18 24 30 36 42 48 54
2．5样品含量测定
取(1．3)项下制备的待测样品溶液，按(1．2)项
下的色谱分析条件进行检测，结果见表 2。从表 2
可知，在选定的实验条件下，随着发酵时间的增加，
木糖的质量浓度逐渐下降，木糖醇的质量浓度逐渐
上升，体现了微生物发酵过程中，木糖向木糖醇转化
的实际规律。
3 结 论
示差折光检测器用于检测无紫外吸收的糖类化
合物，样品元需衍生处理，过滤后，便可以直接进样
检测。本文采用氨基分析柱分离发酵液中的木糖和
(下转第 198页 Continue on page 198)
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198 广 西 植 物 24卷
trum)、瑞香 (Daphne)、重楼属(Paris)等。东亚分
布及其变型的属共有 125个，其中典型东亚分布属
有 43个，如猕猴桃属(Actinidia)，五加属(Acan—
thopanax)、三尖 杉属 (Cephalotaxus)、蓬 莱藤属
(Gardneria)、茵 芋 属 (Skimmia)、旌 节 花 属
(Stachyurus)等。中国一喜 马拉雅分布变型有 66
个属，如射干属(Belamcanda)、南酸枣属 (Cho-
erospondias)、藤漆 属 (Pegia)、石海 椒属 (Rein—
wardtia)、扁核木属(Prinsepia)、猫儿屎属(Decals-
nea)、蓝钟花属(Cyananthus)等。中国一日本分布
变型有拐枣属 (Hovenia)、鬼灯檠属 (Rodgersia)、
枫杨属(Pterocarya)等。
中国特有属仅有 25个，如通脱木属 (Tetrap-
anax)、巴豆藤属(Craspedolobium)、牛筋条属(Di-
chotomanthes)、银 鹊树 属 (Tapiscia)、大血 藤属
(S口rge ￡0 0z口)等。
热带成分 (类型 2～7)合计 共 占总属数 的
68．2 ，构成该植物区系的主体，因此，该植物区系
仍属于热带性质的植物区系。同时该植物区系中又
含有丰富的温带成分(类型8～14)，共有406属，占
总属数的29．94％，表明了该植物区系具有热带向
亚热带的过渡性。该植物区系中热带亚洲成分是最
为优势的成分，占总属数的25．O8％，故该植物区系
受热带亚洲植物区系的渗透和强烈影响，属于热带
亚洲植物区系的北部边缘部分，在世界植物区系分
区上仍应属于热带亚洲植物区系。我们的研究结果
支持吴征镒把该地区作为古热带植物区，马来西亚
亚区中的滇一缅一泰地区(wu等，1996)。
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(上接第 277页 Continue from page 277)
木糖醇，一次进样 10 min即完成色谱分离过程，具
有分离效果好，分析速度快，操作简便的优点，最为
适合检测只需分离木糖和木糖醇的样品。
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