全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(3)：297— 299 2006年 5月
金秋梨和新高梨的分子遗传学对比分析
吕金海1，伍贤进1，周书伟2
(1．怀化学院 生物工程系，湖南 怀化 418008}2．湖南农业大学 生命科学学院，湖南 长沙 410128)
摘 要：金秋梨和新高梨的形态性状、生物学性状以及酯酶同工酶、过氧化物酶同工酶、细胞色素氧化酶同工
酶酶谱均产生了变化。利用异源 DNA探针-JJ,麦 rDNA克隆 pTA71，与四种核酸内切酶 Pst I、BamH I、
EeoR I及 BglⅡ酶切消化的金秋梨和新高梨叶片总 DNA杂交，结果表明，pTA71一Pst I和 pTA71 BamH I二
种探针一酶组合可在金秋梨和新高梨中检测到 RFLP差异。
关键词：RFLP；同工酶；金秋梨；新高梨
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：i000—3142(2006)03—0297—03
Molecular genetic comparison analysis of
Jinqiu Pear and Xingao Pear
LV Jin—haiI，WU Xian-j in1，ZHOU Shu—wei2
(1．Department of Bioengineering，Huaihua University，Huaihua 418008．China；2．College of
Lfe Sciences．Hunan Agricultural University。Changsha 410128，China)
Abstract：The results of esterase，peroxidase and cytochromeoxidase isozyme showed that there were distinct
differences between Jinqiu Pear and Xingao Pear in morphological and biological traits．The total genomic
DNA digested with four restriction enzymes(Pst I、BamH I、EcoR I and Bgl 1)WaS hybridized with a heter—
ologous probe-pTAT1 clone of wheat rDNA．Results showed that pTA71一Pst I、pTA71一BamH I revealed
some RFLP differences between J inqiu Pear and Xingao Pear．
Key words：RFLP；isozyme；J inqiu Pear；Xingao Pear
金秋梨是日本梨新高(天 川×今村秋)的芽变
株系，属砂梨系统，果实的经济性状优良。该品种曾
获“全国星火科技精品金奖”(1994，成都)和“星火科
技实施 1O周年暨八五农业科技攻关成果博览会优
秀项目金奖”(1996，北京)。现已推广至湘、黔、川、
桂等 8省(区)。为这些地区的农业结构调整和农业
产业化作出了较大贡献(黄渊基，l996；吕金海等
2002)。同工酶作为一种有效手段可以从分子水平
鉴别许多从外部形态上难以区别的遗传变异，试图
通过酶谱分析，研究金秋梨和新高梨的酯酶同工酶、
过氧化物酶同工酶、细胞色素氧化酶同工酶的差异。
RFLP (Restriction Fragment Length Polymor—
phism，DNA限制性酶切片段长度多态性)是一种比
同工酶更为基本的、在 DNA水平上的多型性现象。
近年来，RFLP作为遗传标记，已广泛应用于生物各
研究领域(Beckmann等，1986)，不少果树上也开展
了 RFLP的研究 (萧顺元等，l995；Crowhurst等，
1990；Furnier等，1990；Balfourier，等，2000；李林林
等，2002；李健仔等，2003；黄宏文等，2000)。本文试
图从 RFLP分析人手，研究金秋梨和新高梨之间的
分子差异，为分析金秋梨和新高梨突变的分子机制
提供基础资料。
1 材料和方法
金秋梨和新高梨均采自湖南省怀化职业技术学
收稿 日期：2005一Ol—10 修回日期 ：2005—08—20
基金项目：湖南省教育厅资助项目(03C308)[-Supported by Educational Committee of Hunan(03C308)]
作者简介：吕金海(1968一)，男，湖南水顺人，副教授，主要从事植物生理学与分子生物学教学与研究工作。
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298 广 西 植 物 26卷
院教学园艺场。酯酶同工酶的分析：按徐玲玲等
(2002)的方法进行。过氧化物酶同工酶分析：按张
和禹等(2002)的方法进行。细胞色素氧化酶的同工
酶分析：按邵耀椿等 (2003)的方法进行。叶片总
DNA的提取：采用改 良的 SDS法提取 DNA(萧顺
元等，1995)：取 2 g叶片，在液氮下磨碎转入 5O mL
离心管中，加 l5 mL DNA提取缓冲液(100 mmol·
L Tris—HCI，pH8．0；50 mmol L EDTA，pH8．0；
500 mol L NaC1；0．5 9，6 p一巯基乙醇)，搅匀，加入 2
mL lO％ SDS，摇匀后在 65℃水浴中保温 15 min，
加入 5 mL 3 mol-I．『 KAc，摇匀，置于冰浴中 2O
min，在 12 000 r·rain 下离心 2O min，上清液加入
15 mL预冷(2O℃)的异丙醇，缓慢摇匀后，在一2O℃
下静置在 6 500 r-min 下离心 10 rain，去上清液，
加 750 L Tris—EDTA缓冲液(50 mmol-L～Tris—
HC1，pH8．0；10 mmol·L EDTA，pH8．0)溶解
DNA粗提物。用苯酚一氯仿纯化 DNA。RNase处
理后，将 DNA贮于一2O℃下备用。
分子杂交(Sambrook等，1989)：以 4种内切酶
(PstT、BamHI、EcoRI、BglI，Promega公司产)酶切消
化总DNA(5#g DNA，加 15~20酶单位)，以0．8 琼
脂糖(Sigma公司产)凝胶电泳分离 DNA片段，通过
Southern Blot将 DNA转移至硝酸纤维滤膜上，以缺
刻转移法(Nik translation Kit，Promega公司产)标记
探针(小麦 rDNA克隆 pTA71)(Gerlach等，1979)。
将转移上 DNA的滤膜和预杂液(6×SSC，5×Den—
hardt’S reagent，0．5 SDS lO0#g·ml 变性的 ssD—
NA)在 65℃下预杂交 1O～12 h，加入标记好，已变性
的探针，在65℃下继续杂交24 h，倾掉杂交液，在室温
下，用2×SSC，0．5 SDS漂洗两次，每次5 min，再用
0．5×SSC，0．1 SDS在 65℃下漂洗 15～30 min，按
常规方法进行放射自显影。
2 结果与分析
2．1形态学和生物学变化
2．1．1金秋梨和新高梨的品种对比分析 金秋梨在
树体、果实等性状上和新高梨有很多相似之处，主要
表现是；树冠直立，有两种树叶，一是长椭圆形的大
叶，另一种是小圆叶。但果实形质上，二者存在差
异，金秋梨果实平均大、果基平整、果皮薄、果心小、
味道甜、石细胞少，小、成熟期 9月 1～15日、耐贮程
度长i而新高梨果实平均小、果基突丘、果皮厚、果心
大、味道微酸、石细胞多，大、成熟期 8月 20~30日、
耐贮程度短。
2．i．2金秋梨和新高梨的正反交测验 日本梨是一
个杂合的群体，其遗传基本论点有两点值得考虑。
一 是 日本梨大多数品种 自花不实；二是偏父性不亲
和原理。金秋梨和新高梨的正反交测验结果见表
I。新高梨×金秋梨的结实率为 67 9，6，而金秋梨×
新高梨的结实率为 36 ，都不符和日本梨自花不实
原理。再经反复测试，金秋梨×金秋梨的结实率为
0，而新高梨×新高梨的结实率为 i1 ，原因就在于
新高梨本身具有一定的自花结实率，所以，新高的杂
交组合亦表现出较高的结实率。同时也可以看出，
有一定自花结实率的新高梨，其变异植株金秋梨的
自花结实率为 0。新高梨的父本是今村秋，今村秋
×新高梨的结实率为 0，今村秋×金秋梨的结实率
为 1．1 ，表现结实率很低，符合偏父性不亲和原
理。由上述测验不难看出，金秋梨和新高梨相交，不
符合日本梨大多数品种 自花不实原理，但却非常吻
合偏父性不亲和原理。
表 l 金秋梨和新高梨正反交测验
Table l Reciprocal cross examination of
Jinqiu Pear and Xingao Pear
2．2金秋梨和新高梨同工酶酶谱分析
取金秋梨和新高梨的叶片进行酯酶同工酶、过氧
化物酶同工酶、细胞色素氧化酶的同工酶电泳分析，
结果见表 2。金秋梨和新高梨酯酶同工酶的几种主
要酶带迁移率是一致的；金秋梨和新高梨过氧化物酶
同工酶共出现 3条酶带，第 1、2条基本一致，第 3条
出现变异，金秋梨的酶带迁移率略低；金秋梨和新高
梨细胞色素氧化酶的同工酶出现的酶带不同，金秋梨
为 2条，新高梨为3条，金秋梨缺失第2条酶带。
2．3金秋梨和新高梨的RFLP差异
采用小麦 rDNApTA7l克隆为异源探针，与金
秋梨和新高梨叶片总DNA的 4种内切酶消化片段
杂交，结果如表 3和图 1。结果表明，pTA71一EcoR
I、pTA7卜Bgl I二种酶～探针组合未能检测到
RFLP差异，pTA71一Pst I、pTA71一BamH I两种酶
一 探针组合能检测到RFLP差异。其中在pTA71一
Pst I组合上，凝胶前端有很强的杂交信号，分别可
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3期 吕金海等：金秋梨和新高梨的分子遗传学对比分析 299
以区分出 1条和 2条杂交带。在 pTATI—BamH I
组合上，新高梨有 2条杂交带；金秋梨前端有一条弱
杂交带，后端有一条难消化带。在 pTA71一EcoR I
组合上，两种材料前端可以看出2条杂交带，后端有
一 条难消化的带。在 pTA71一Bgl I组合上，区分不
出杂交带和难消化带。上述杂交结果说明金秋梨和
表 2 金秋梨和新高梨同工酶酶谱分析
Table 2 Isozyme analysis of Jinqiu Pear and Xingao Pear
表 3 金秋梨和新高梨的 RFLP差异
Table 3 RFLP difference of Jinqiu Pear and Xingao Pear
新高梨在 rDNA上存在 RFLP变异。
3 讨论
(1)金秋梨和新高梨相比，发生了形态学特征和
生物学特性的改变，通过继代栽培、高接鉴定和区试
鉴定表明这些变异性状是稳定的(黄渊基，1996)，属
于遗传变异。金秋梨和新高梨相交，不符合 日本梨
大多数品种 自花不实原理，但却非常吻合偏父性不
亲和原理，这种在遗传性状方面的似而不是的现象，
应该可以说是其变异之所在。
图 1 金秋梨和新高梨的RFLP差异
Fig．1 RFLP diferences of of Jinqiu Pear and Xingao Pear
1．新高梨Jinqiu Pear；2．金秋梨 Xingao Pear；A．pTA71一Pst I I
B．pTA71一BamH I；C．pTA71-EcoR I；D．pTA71-Bgl I．
(2)本文对金秋梨和新高梨进行酯酶同工酶、过
氧化物酶同工酶、细胞色素氧化酶的同工酶分析表
明，新高梨与其变异品种金秋梨的同工酶谱带数和
显色深浅相近，但不完全一样，尤其是细胞色素氧化
酶的同工酶，金秋梨比新高梨少了一条谱带，说明二
者的血缘相近，但不是同一品种。
(3)DNA的提取参照萧顺元(萧顺元等，1995)
介绍的改良SDS法，提取的 DNA适于进行 RFLP
分析，在 DNA杂交试验中，采用小麦 rDNApTA71
克隆为探针，检测金秋梨和新高梨的 rDNA变异，
植物的rDNA是前后相联的一段重复序列，它包括
rRNA结构基因编码 区和基因间隔区(Intergenic
Spacer，JGS)，在植物体内rDNA的拷贝数达 l0
基因组 (Ingle等，1972)，小麦的 pTA7l克隆包含
25S和18S核糖体 RNA基因及两者的间隔区，分子
量约为 8．8 kb，以它为探针与金秋梨和新高梨总
DNA的4种酶切消化片段杂交，在两种探针一酶组
合上检测到 RFLP差异，说明金秋梨和新高梨间存
在 rDNA变异。由杂交结果还可推测，在金秋梨和
新高梨 RNA基因中，存在有 EcoR I、Pst丁、BarnH
I和 BglⅡ四种内切酶切点。
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