全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(3)：410—413 2007年 5月
桔梗 RAPD反应体系的优化
孙丽娜，严一字 ，吴基 日，吴松权 ，金东淳，王立平
(延边大学 农学院，吉林 龙井 133400)
摘 要：以通化桔梗为材料，用改进的cTAB法提取桔梗叶片的总 DNA，通过对不同镁离子浓度、dNTP浓
度、模板DNA含量、引物浓度、DNA聚合酶量条件下的RAPD扩增反应的效果，建立了一个适合桔梗的比较
稳定的RAPD反应体系，用于桔梗遗传多样性分析。结果表明，桔梗 RAPD扩增反应的最佳体系为：模板
DNA 2O ng，dNTP 150／zmol／L，引物 0．3／~mol／L，Mg2+浓度 2．0 mmol／L，TaqDNA聚合酶 1 Unit，10×Buff-
er 2．0 L，PCR反应总体积为 2O L。按此优化 RAPD条件进行实验，重现性良好。
关键词：桔梗 ；体系优化 {CTAB；RAPD
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2007)03—0410—04
Optimization of RAPD conditions
of Platycodon grandflorus
SUN Li-Na，YAN Yi-Zi ，WU Ji—Ri，WU Song-Quan，
JIN Dong—Chun，WANG Li—Ping
(Colege of Agriculture，Yanbian University，Longing 133400，China)
Abstract：The total DNA in young leaves of Platycodon grandifton,s from Tonghua was successfully extracted by U—
sing the developed CTAB method．The optimum reaction system of RAPD for the P．grandifloFu$was established
by RAPD analysis of the different M +，DNA templates，primers and DNA polymerase．The results show that the
most optimal reaction system of RAPD is：20 ng template DNA，dNTP concentration 150 L，0．3 tmol／L primer，
MgClz 2．0 mmol，1 U Taq polymerase，10×Taq polymerase buffer at 2．0 tL in the 2O L reaction volume．A high
reproducibility was obtained with the optimized experiment condition．
Key words~Platycodon grandifloru$；system optimation；CTAB；RAPD
桔梗(Platycodon grandiflorus)系桔梗科桔梗
属植物，它既是一种资源植物，又是一种药、食、观赏
兼用的经济植物(刘德军等，2001)。国内外对桔梗
的化学成分和组织培养方面研究较多，而在分子水
平上对桔梗进行分类的研究还未见报道(舒娈等，
2001)。随机扩增多态 DNA是运用随机引物扩增
寻找多态性 DNA片段，用以作为分子标记的一种
分子生物学研究手段，具有快速、简便等优点(赵喜
华等，2005)。运用 RAPD技术对桔梗进行遗传多
样性分析时，首先要建立稳定的反应体系，以保证
RAPD结果的可靠性与重复性。为此，本实验就桔梗
RAPD反应中的 dNTP浓度、镁离子浓度、Taq酶用
量、模板 DNA浓度、引物浓度等因素对实验结果的影
响进行探讨，建立了重复性好、稳定的桔梗 RAPD反
应体系，对桔梗运用 RAPD技术进行探讨，为进一步
分析桔梗遗传多样性打下基础。
收稿 日期：2006—03—30 修回日期：2006-12-03
基金项目：吉林省科技厅资助(20040553)；延边大学校课题[延大科合字(03)第07号][Supported by Science and Technology Department of Jilin
Province(20040533)；Yan~an university((o3)07)]
作者简介：孙丽娜(1979-)，女，吉林镇赉县人，在读硕士，研究方向：桔梗种质资源的比较研究。
通讯作者(Author for corespondence，E-mail：yiziyan@yahoo．conL cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
3期 孙丽娜等：桔梗 RAPD反应体系的优化 411
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1实验材料 模板 DNA制备材料取 自吉林省
延边大学农学院桔梗试验田，取干净的通化桔梗嫩
叶，迅速放入封口袋密封，置于一7O℃低温冰箱中保
存备用。
1．1．2试 剂 琼 脂 糖；CTAB、EDTA、dNTP、
MgCI2、Taq酶、Tris、10×Taq酶配套缓冲液、引物、
p一巯基乙醇等。以上药品均由上海华美生物工程公
司提供。
1．1．3仪器 凝胶成像系统；紫外分光光度计(U一
3010)；三恒多用电泳仪(北京六一仪器)；台式离心
机(HERMLE2383K)；PCR仪 (PCR System9700)；
超低温冰箱等。
1．2方法
1．2．1 DNA模板的制备与定量 基 因组总 DNA的
提取，采用改进的 CTAB法(张吉宇等，2004)称取
0．1～O．3 g幼叶，在液氮中研磨至粉末状，置于 1．5
mL离心管中，加入650 L预热到65℃的 2×CTAB
提取缓冲液(2 ；2O mM EDTA；100 mM Tris—
HCI(pH8．O)；1．4 MNaCI；1 pvp)和 1O 巯基乙
醇，65℃水浴45 min，取出在室温下冷却。加入等体
积的氯仿／异戊醇(24：1)，剧烈振荡。室温下 12 000
rpm离心 10 min，取上清液置于1．5 mL离心管中，再
加入等体积的氯仿／异戊醇(24：1)振荡混匀，在室温
下 12 000 rpm离心 5 rain。取上清液置于新离心管
中，加入 2／3体积一2O℃预冷的异丙醇，置一2O℃冰箱
中放置30 rnjn至出现絮状沉淀，弃去上清液，用 7O
的酒精洗涤沉淀两次，将离心管倒置于吸水纸上干
燥。加入 100 p．L l×TE缓冲液溶解DNA，加入2 L
RNase 37℃保温 1 h去除 RNA。紫外分光光度计检
验 DNA的浓度及 纯度。将 DAN浓度定为 10 ng／
L，于一2O℃冰箱中保存、备用。
1．2．2体系优化的试验设计 首先确立基本反应条
件，即 PCR反应总体积为 2O L体系，其中含模板
DNA 20ng，引物 0．2 tLmol／L，TaqDNA聚合酶 1 u—
nit，dNTP 200 p．mol／L，MgC1 2 1．5 mmol／L，10×
PCR缓冲液 2．0 L，其余 以重蒸馏水补充至 2O
L，在上面覆盖一薄层矿物油。在保持其它因素一
致的条件下改变单一因子，以 UBC320(CCG GCA
TAG A)为引物对反应体系中的模板 DNA、引物、
dNTP、MgCI。、Taq DNA聚合酶分别设置不同浓度
梯度(表 1)进行优化并筛选出最优参数(张吉宇等，
2004；常爱霞等，2004)。
表 1 RAPD反应体 系中的各成分用量
Table 1 Amount of components
in RAPD reaction system
1．2．3 PCR程序与参数设定 PCR反应在 System
9700 PCR仪上进行，反应程序为预变性 94℃ 5
min，94℃变性 1 rain、40℃退火 1 rain、72℃延伸
90 S共循环4O次，最后 72℃延伸5 rain。扩增产物
用 1．4 (含有 0．5／~g／mL溴化乙锭)的琼脂糖凝胶
进行电泳，用 Dolphin凝胶成像仪照相。
2 结果与分析
2．1桔梗 DNA的提取及分析
按照上述方法进行桔梗的 DNA抽提，经紫外
分光光度计检测，结果 OD230、OD260、OD280分别
为 0．452、1．092、0．587，其 OD260／OD280为 1．86，
说明所提取 的 DNA较纯、不含有蛋 白质和酚；
OD260／OD230为 2．4，说明 DNA中没有残存的盐
和核苷酸、氨基酸、酚等小分子杂质。
2．2体系优化的分析
2．2．1模板浓度筛选 模板DNA浓度对 RAPD反应
影响极大(图 1)。DNA用量在 5 ng和 5O ng之间均
能扩出谱带，但在5 ng和 1O ng下扩增出的带不太清
晰；3O、4O ng和 5O ng时缺失部分带；DNA用量在 2O
ng时可得到好的扩增结果，模板 DNA用量少且清
晰。因此，将模板 DNA的用量定为2O ng比较理想。
2．2．2引物浓度筛选 引物浓度对 RAPD反应影响
也较大(图2)。随着引物浓度的增加，扩增出的带较
多且清晰，但从 0．3 tLmol／L以后带型基本一致，引物
用量在 0．3 tLmol／L时，带型清晰且引物用量少。因
此，本研究的引物用量以0．3 tLmol／L为最适值。
2．2．3 Taq聚合酶浓度 筛选 Taq聚合酶浓度对
RAPD反应影响很大。Taq聚合酶浓度过高或过低
都出现缺失的带，图 3中可以看出 Taq聚合酶浓度
维普资讯 http://www.cqvip.com
412 广 西 植 物 27卷
1 400
8OO
60O
400
图 1 模板 DNA浓度对 RAPD反应的影响
Fig．1 Efect of template DNA concentration
on RAPD reaction
M：200 bp的DNA分子量标记；数字为DNA浓度梯度(表1)。下同。
2OObp DNA ladder~lanes 1 tO 6 correspond to concentration
grades for template DNA listed in table 1．The same bellow．
1 400
8OO
6OO
4OO
图 2 引物浓度对 RAPD反应的影响
Fig．2 Efect of primer concentration
for RAPD reaction
1 400
8OO
6OO
400
图 3 Taq聚合酶浓度对 RAPD反应的影响
Fig．3 Effect of Taq DNAse concentration
on RAPD reaction
在 1．0 U和 2．0 U时扩增出较多、清晰的DNA带，
扩增产物数量没有变化，从扩增效果和节约实验费
用考虑，认为Taq聚合酶浓度以 1U为宜。
2．2．4 dNTP浓度筛选 图 4表明，dNTP浓度在
1OO～250／lmol／L之间扩增产物条带清晰明亮。浓
度过低和过高均有缺失的带，浓度过高时缺失 1 050
bp和 l 600 bp DNA带(泳道 5、6)。从扩增效果和
1 400
8OO
600
4OO
图 4 dNTP浓度对 RAPD反应的影响
Fig．4 Effect of dNTP concentration
on RAPD reaction
节约实验费用考虑，dNTP浓度在 150~mol／L时是
较合理的。
2．2．5 MgC1z浓度 筛选 由图 5看出，除了 0．5
mmol／L时没有扩增产物外，在 1．0～3．0 mmol／L
内均有较清晰的谱带，为避免 MgC1 浓度过低影响
聚合酶活性而过高造成非特异性扩增，MgC1 浓度
选择 2．0 mmol／L。
1 400
8OO
6OO
4OO
图 5 MgCI2浓度对 RAPD反应的影响
Fig．5 Effect of MgCh concentration
on RAPD reaction
2．3优化后反应体系的扩增结果
采用优化后的反应体系，用引物 OPD19对 24
种桔梗种质资源进行扩增(图 6)。可以看出，扩增
谱带清晰，说明优化后的反应体系均适合于桔梗的
RAPD分析(陶钧等，2005)。
3 结论
不同的材料，不同的实验方法，所需要的扩增条
件也很不一样，会对 RAPD的图谱产生较大的影
响，从而影响 RAPD分析的准确性，而 RAPD带谱
的准确性与稳定性是利用 RAPD标记进行遗传多
样性分析的前提条件，而有关 RAPD报道的文献非
常多，但没有统一的反应物用量尺度，因此有必要对
维普资讯 http://www.cqvip.com
3期 孙丽娜等：桔梗 RAPD反应体系的优化 413
图 6 优化后反应体系的 RAPD结果
Fig．6 The result of optimized reaction system on RAPD analysis
RAPD进行优化，而本实验经过多次重复，都能很好
地反映以上结果。利用 UBC公司(加拿大)引物优
化的体系在对于华美公司合成的引物(如 OPD19)
扩增时得到很好的 RAPD图谱(图 6)，这说明不同
公司的引物可用于本文优化的RAPD体系。
因此本实验得出桔梗 RAPD扩增反应的最佳体
系为：在 20 L PCR反应体积中，模板 DNA 20 ng，
dNTP 150／~mol／L，引物 0．3／~mol／L，Md 为 1．5
mmol／L， FaqDNA聚合酶 1 Unit，10×Bufer 2．0 L。
按照优化的 RAPD条件进行实验，重现性 良好。
参考文献：
刘德军，冯维希．2001．桔梗EM]．中国中医药出版社
舒娈，高山林．2001．桔梗研究进展EJ]．中国野生植物资源，20
(2)：4—6，23
Chang Ax(常爱霞)，Qu YS(瞿永 生)，Jia XH(贾 兴华)．2004．
Optimalization of tobacco RAPD reaction system and studies on
polymorphic marker of tobacoo varieties(烟草 RAPD反应体系
优化及品种多态性标记研究)[J]．China Tobacco Sci(中国烟
草科学)，(2)：9—13
Tao J(陶钧)，Luo ZY(罗志 勇)，Liu SP(刘水平)，el a1．2005．
Optimizing of RAPD amplifying condition and analysis of genetic
DNA polymorphisms of Gastrodia elata Blume(RAPD条件优
化及天麻基因组 DNA多态性分析)[J]．Li Sci Res(生命科
学研究)，9(2)：15O一155
Zhao XH(赵喜华)，Wang MY(王曼莹)．2005．Optimization of
RAPD conditions of Rhododendron(杜鹃 花 RAPD条件 的优
化)[J]．B o 如”ozog (生物技术)，15(1)：41-43
Zbang JY(张吉字)，Yuan QH(袁 庆华 )，Zhang WS(张 文淑)，el
a1．2004．Genomic DNA extraction and optimizing RAPD pro—
cedure of Lespedeza floribunda(多花胡枝子基 因组 DNA提取
与 RAPD反应体系优化)EJ]．Acta Agrectir Sin(草地学报)，
12(3)：219— 222，23O
(上接第 409页 Continue from page 409)
Li HS(李海生)，Chen GZ(陈桂珠 )．2004．Genetic diversity of
Sonneratia ovata(Sonneratiaceae)in China detected by in—
tersimple sequence repeats(ISSR)analysis(中国卵叶海桑遗
传多样性的 ISSR研究)[J]．Guihaia(广西植物)，24(1)：17
— 22
Min ZI)(闵知大)，Zhong SM(钟守 明)．1980．Studies on the
alkaloids from Stephania kwangsionsis(广西地不容生物碱
的研究)[J]．A(ta Pharm Sin(药学学报)，15(9)：532—537
Peng YT(彭云涛)，Tang SQ(唐绍清 )．2005．Genetic diversi—
ty of Siraitia grosvenorii detected by ISSR markers(野生罗
汉果遗传多样性 的 ISSR分析)[J]．Biodiversity Sci(生物
多样性)，13(1)：36—42
Qian w(钱韦)，Ge s(葛颂)，Hong DY(洪德元)．2000．As—
sessment of genetic variation of Oryza granulata detected
by RAPDs and ISSR(采用 RAPD和 ISSR标记探讨中国疣
粒野生稻的遗传 多样性)[J]．Ac ta Bot Sin(植物学报)，42
(7)：741—75O
Qiu YH(邱英雄)，Fu CX(傅承新)，He YF(何云芳)．2002．I—
dentification of M ichelin tsoi types using ISSR—PCR marker
assays(乐昌含笑不同类 型鉴定 的 ISSR-PCR分析)[J]．Sci
Silv Sin(林业科学)，38(6)：49—52
Shi LM(施立明)．1 990．Genetic diversity and convers~ition(遗
传多样性及其保护)[J]．Biosci Inform(生物科学信息)，
(2)：158— 164
Wang SQ(王水琦)，Lin YQ(林彦 铨)，Yang H(杨浩)，el a1．
2003．RAPD and ISSR analysis of germplasmic resources of
chewing cane(果 蔗种质 资源 的 RAPD和 ISSR分 析)I-J]．
Acta Agric Univ Jiangxi(Nat Sci)(江西农业大学学报 自
然科学版)，3：412—417
Wu w(吴卫)，Zheng YL(郑有 良)，Chen L(陈黎)．2003．A—
nalysis on gnentic diversity of germplasm resources of Cor—
date houttuynia by ISSR marker(利用 ISSR标记分析鱼腥
草种质资源的遗传多样性)[J]．World Sci Tech Modern
Trad Chin Medicine Mat Med(世界科学技术一中医药现代
化)，1：70—77
Zietkiewicze．Rafalskia，Labudad．1994．Genome fingerprinting
by simple sequence repeat(SSR)一anchored polymerase chai：~
reaction amplificationl-J]．Genomics，20：176—183
维普资讯 http://www.cqvip.com