全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(2)：125—128 2005年 3月
根癌农杆菌介导库拉索芦荟
遗传转化因素优化
潘颖南1，蒙 平 ，何铁光1，苏 宾 ，陈廷速1一，李杨瑞
(1．广西农业科学院生物技术研究所，广西南宁 530007；2．广西作物遗传
改良生物技术重点开放实验室，广西南宁 530007)
摘 要：以美国库拉索芦荟的横切薄片(transverse thin cel layer，tTCL)作为转化外植体，初步研究了以根癌
农杆菌介导的多种因子对芦荟遗传转化的影响。结果表明：菌株 EHA105比LBA4404及 AGI 1转化率高；
除了乙酰丁香酮(acetosyringone)外，菌液的预处理和重悬液的pH值也是影响转化的主要因子；菌液的预处
理和适合的蔗糖浓度对转化也有促进作用；感染时间为 12～18 min．共培养的温度和时问分别以 25℃及 5 d
为佳。
关键词：芦荟；根癌农杆菌；遗传转化
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3l42(2005)02—0125—04
Factors optimization for genetic transformation
ln oe arborescens mediated by
robacterium tumefaciens
PAN Ying—nan ，MENG Ping ，HE Tie—guang ，SU Bin1，
CHEN Ting—SU 一．LI Yang—ruie
(1．Biotechnology Research Institute，Guangxi Academy of Agriculture Sciences。Nanning 530007。China
2．Guangxi Cropgenetic Development and Biotechnology Laboratory，Nanning 530007，China)
Abstract：Transient expression of口一glucuronidase(Gus)gene were used to determine the optimized conditions
for transformation of transverse thin cell layer(tTCL)of Aloe arborescens mediated by Agrobacterium tumefa—
ciens．The results showed that EHA105 was more efficient than I)oth LBA4404 and AGL1 in the genetic
transformation．Besides acetosyringone(AS)，pretreatment of the Ag robacterium liquid and the pH value of
the suspension liquid(1／2MS)were also important in the genetic transformation．An appropriate concentration
of sugar accelerated the transformation．The optimum infection time was 12 to 18 minutes
．
The best tempera—
ture and CO—CUltivation time were 25℃ and 5 days．respectively．
Key words：Aloe；Ag robacterium tumefaciens；genetic transformation
芦荟(Aloe spp．)属多年生百合科多浆常绿草
本植物，具有广泛的药理活性，可做药用、饮料、化妆
品等，是一种很有开发前途的经济植物新资源；开展
芦荟的生物技术研究具有重要的理论和应用价值。
目前对于芦荟的遗传转化尚未见报道。我们在用库
拉索芦荟表达人表皮生长因子的研究中(陈廷速等，
2002a)，以横切薄片外植体建立了较理想的再生体
系(陈廷速等，2003)，并对影响以根癌农杆菌介导的
收稿 日期：2003一l2一l9 修订 日期：20O4—05—18
作者简介：潘颖南(1 966一)，女，广西武呜人．副研究员，从事植物组织和细胞培养等工作 。
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l26 广 西 植 物 25卷
库拉索芦荟遗传转化的一些条件进行了初步研究，
旨在建立根癌农杆菌介导的高效转化体系，为用库
拉索芦荟作为生物反应器表达药物积累工作经验。
1 材料和方法
1．1实验材料
材料为美国库拉索芦荟(Aloearborescens)的无
菌试管苗。在超净工作台上将试管苗的叶片去除，
参考周根余等(1999)的方法，沿两边对称叶片的中
央纵切(LC1)和沿叶片的中心线纵切(LC2)，再横
切成约 1 mm的薄片得到两种薄片(分别为TCL1，
TCL2)，作为实验材料。
1．2农杆菌菌株与质粒
根癌农杆菌菌株为 EHAl05、LBA4404和
AGL1，植物表达载体 pl3OlEGF(含有 Gus基因、
nptlI基因、hpt基因、人表皮生长因子基因hEGF、
35S启动子)。
1．3培养基及培养条件
(1)薄片芽诱导培养基(AM。)：改良的 MS+
BA 3．5 mg／L(单位下同)+IBA 0．3；(2)丛芽增殖
培养基(AM2)：改良的MS+BA 2．5+IBA 0．2；(3)
生根培养基(AM )：改良的MS+NAA 0．5；(4)重
悬菌液的培养基(AM )：1／2改良的MS+AS(ace—
tosyringone)l50／xmol／L十蔗糖 l00 g／L十l／4V
YEB，不加琼脂，pH 5．0；(5)共培养阶段的培养基
(AM5)：AM +AS l00 b~mol／L，培养温度为26℃；
(6)筛选培养基(AM“)：AM1+Cef(cefotaxime)400
+Hyg(hygromyein)5。以上培养基如无特别说明
均附加蔗糖 3 ，琼脂 0．56 ，pH5．8，培养温度为
25℃；除壮苗生长和生根在光照下培养外，其余均
进行暗培养。
1．4农杆菌在转化前的预处理
取菌液接种于YEB+Kan(kanamycin)25 rag／
L的培养基中，在28℃和 l80～250 rpm的条件下
振荡培养至OD。。为0．8～1．0。将培养好的菌液在
4 500 rpm条件下离心 10 min，然后将菌体重悬于
AM 培养基中(1：1)，28℃条件下振荡培养8～l0
h用于转化。
1．5库拉索芦荟横切薄片与农杆菌共培养
将准备好的库拉索芦荟横切薄片移入准备好的
菌液中，在27℃、l2 L rpm条件下振荡 l5 min，取出
薄片转入AM。培养基中培养 4 d，再转入AM。进
行筛选。
1．6 Gus报告基因的检测
外植体转化 4 d后，参考改进的 Jeferson
(1987)的方法，将外植体置于 X—Gluc染色液(X—
Gluc 0．89 mg／mL，chloramphenical 250 mg／mL，
NaH 2PO4 1．0 mol／L，methano 120 ，pH7．0～
8．O)中，37℃水浴 4～8 h，镜检观察。瞬时表达率
( )一(Gus基因瞬时表达的外植体数／总外植体
数)×l0O 。每个处理检测的外植体数量为2O个，
3次重复，结果为平均值，对照为未进行转化的薄
片。
2 结果与分析
2．1农杆菌菌株、菌液浓度及外植体侵染时间对
Gus基因瞬时表达率的影响
不同农杆菌菌株和菌液浓度对库拉索芦荟薄片
的Gus基因瞬时表达率的影响如图l，在所供试的
三个菌株中以 EHA105的侵染能力最强，AGL1的
侵染能力最差；并以稀释一倍的菌液浓度效果为最
好。本实验主要使用菌株EHA105来进行转化。
在一系列侵染 时间的实验 中，外植体在
EHA105菌液中侵染时间长达 120 min仍可检测到
Gus基因瞬时表达，但由于农杆菌长得过于旺盛会
对筛选不利，侵染时间以 15 min为好(图2)。另外
还发现侵染菌液预处理时间对 Gus基因瞬时表达
率有影响(图 3)。当农杆菌振荡培养到 OD值为
0．8时，经离心后用 BM 培养基进行悬浮。在重悬
液中加入 1／4 YEB的培养基能使库拉索芦荟的薄
片周围长出农杆菌，G“ 基因的瞬时表达率也提高
了；而用不加 YEB的重悬液来侵染材料时，仅有部
分薄片周围长有农杆菌；这可能与库拉索芦荟本身
含有抑制细菌生长的物质有关系。
2．2农杆菌重悬液pH值及蔗糖浓度对 Gus基因瞬
时表达率的影响
从图4可知，重悬液pH值过高或过低对 Gus
基因瞬时表达率影响很大，以pH值在5．2～5．5之
间Gus基因的瞬时表达率为高，而且相当稳定。而
农杆菌重悬液中的蔗糖浓度对库拉索芦荟的转化也
有影响( 5)，在 lO0～l2O g／L蔗糖浓度时其Gus
基因的瞬时表达最好。但蔗糖 lO0 g／I 时对其芽分
化较好，因此采用此蔗糖浓度。
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2期 潘颖南等：根癌农杆菌介导库拉索芦荟遗传转化因素优化 127
0 1 2 3 4
菌株及稀释倍数
K1 nds of AgrobacterIum and its
di I uti on soI uti on
图 1 菌株及稀释倍数对( s基因瞬时表达率的影响
Fig．1 Effect of kinds and concentration of
Agrobacterium on Gus gene transi ent expression
0 5 1 2 5 8 1 2 24
处理时间 Tteat time(h)
图2 EHA105菌株侵染时间对
Gus基因瞬时表达率的影响
Fig．2 Effect of infection time of EHA105
on Gus gene transient expression
3O 6O 1 OO 1 2O 1 50 200
蔗糖浓度 (g／L)
Ooncent rat i 0n of SUC r0Se
图3 侵染菌液处理时间对G“s基因瞬时表达率的影响
Fig 3 Effect of treating time of Agrobacterium
solution on C-us gene transient expression
2．3外植体与农杆菌共培养温度及共培养时间对
Gus基因瞬时表达率的影响
在正常的培养温度(25℃)下，Gus基因的瞬时
2 5 8 1 O 1 5 3O 6O 1 2O
侵染 时间 (ml n)
I nfec t l On t}me
图4 重悬液pH值对Gus瞬时表达率的影响
Fig．4 Effect of pH value of resuspension liquid
on Gus gene transient expression
一 1 OO
斛 竺
一
75
罢
坚兰 50 ’
基 zs
醐
0
图 5 蔗糖浓度对 Gus基因瞬时表达率的影响
Fig．5 Effects of sucrose concentrations on
Gus gene transient expression
表达率较高，同时库拉索芦荟薄片不定芽分化也较
好。而温度偏高或偏低时 Gus基因的瞬时表达率
都较低(图6)。
共培养时间的长短影响到转化率和下一步的筛
选，由图7可知，受体与农杆菌共培养 4～5 d，其
Gus基因的瞬时表达率较高；随着培养时间的延长
农杆菌生长过多，在筛选时很难抑制农杆菌的生长，
检测不到Gus基因的瞬时表达。此外，由于薄片在
菌液中时间过长，因浸泡及缺氧而软腐，丧失芽分化
的能力；这与香蕉中遗传转化的情况(陈廷速等，
2002b)是一样的。
2．4 Gus基因表达检测
外植体与农杆菌共培养 4 d后，进行Gus基因
瞬时表达活性的检测，在组织中可测到 G 活性，
显蓝色(图版 I：1)。无 Gus活性者(图版 I：2)及
对照(图版 I：3)。
∞ ∞ 0
辞^一[0 ∞∞ ×∞
[∞一∞[叮L ∞[ 锄 毒
斛 莒鉴因确 毒
O 5 O 5 O
O 7 5 2
一 一[0ls∞ d×∞
1u∞一∞[∞ ∞c∞∞
附 蓝鉴因确
0 O O O O O
0 8 6 4 2
9^6一[0ls∞∞La×∞
[∞ls[叮L ∞[∞锄
斛 菖鉴因醐
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l28 广 西 植 物 25卷
22 25 28 3O
共培养温度 (_(1 j
0o—cU I tU re temDe ratU r
图 6 菌株与外植体共培养温度
G-us基因瞬时表达率的影响
Fig．6 Effects of CO—culture temperature
on Gus gene transient expression
O 2 4 5 7
共培养时间 (d)
Go—cUItU re tI me
图7 菌株与外植体共培养时间
Gus基因瞬时表达率的影响
Fig．7 Effects of CO—culture time on Gus
gene transient expression
讨论与小结
1 O
在以根癌农杆菌介导的库拉索芦荟遗传转化
中，除了必须使用 AS外，偏酸性的感染条件、适合
的共培养温度和时间、蔗糖浓度等诱导 vir基因的
表达，促进了T—DNA的转移，得到较高的瞬时表达
率。重悬液的pH值过高(大于 6．0)或过低(小于
4．0)，都很难检测到有G“ 基因的瞬时表达，只有
在适当偏酸的培养条件，才有利于农杆菌vir区基
因的表达。农杆菌重悬液 pH值对植物的转化有明
显影响，特别是在单子叶植物的转化上是一个很重
要的因素。一些研究也认为，在农杆菌与植物细胞
进行共培养时，使用较低 PH(5．2以下)的培养基有
利于转化频率的提高(Hiei等，l994)。但在水稻的
转化中，PH值在 4．8～6．2的范围内，培养基的 PH
值对转化率影响较小(刘志学等，l999)。看来不同
植物遗传转化所要求的条件有较大的差别，需要分
别进行研究。
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