全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(2)：145— 148 2005年 3月
杜氏盐藻核基质附着区的分离及特征性分析
王天云 ，袁保梅 ，柴玉荣 ，王建人 ，薛乐勋
(1．郑州大学细胞生物学研究室 ，河南郑州 450052；2．河南中医学院生理教研室 ，河南郑州 450053)
摘 要：采用 0．5 Triton X一100破碎细胞，1 5 Percol1分离盐藻细胞核，25 mM二碘水杨酸锂(1ithium di—
iodosalicylate，LIS)抽提核蛋白，限制酶消化除去结合松弛的DNA，蛋白酶 K—SDS处理，酚 氯仿抽提，乙醇沉
淀提取核基质附着 DNA，限制酶酶切连至 pUC18载体上构建 MARs文库。随机挑选 6个克隆进行体外结合
实验筛选，筛选出一能与核基质结合的克隆，测序分析结果表明该序列具明显的MAR序列特征。
关键词：盐藻；核基质附着区；核基质；基因沉默
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)02—0145-04
Isolation and characterizati0n of matrix
attachment region from Dunaliella salina
W ANG Tian—yun1，YUAN Bao—mei ，CHAI Yu—rong ，
WANG J ian—ren2．Xue Le—xun1
(1．Laboratory for Cell Biology，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2．Department
of Physiology，Henan College of Traditional Chinese Mediczne．Zhengzhou 450003．ChiHa)
Abstract：The Dunaliella salina celIs were disrupted with 0．5 Triton X 100，purified by 1 5 Percol1．Nu—
clear proteins were removed using 25 mM lithium diiodosalicylate．After the nuclear matrices digested with re
striction enzyme，the matrix attached DNAs were treated with proteinase K and SDS，extracted by phenol，chlor—
oform and ethanC precipitated，subsequently cut with restriction enzyme and ligated tO the pUC18，transformed into
E．coli JM109 and six colonies were picked randomly and screened through in vitro binding assay．One DNA frag—
ments could specifically bind tO the nuclear matrix and the sequence had the features of MAR typically．
Key words：Dunaliella salina；matrix attachment region；nuclear matrix；gene silencing
核基质结合区 (Matrix attachment region，
MAR)又称核骨架附着 区(scafold attachment re—
gion，SAR)是染色质被限制酶消化后仍与核基质或
核骨架结合的DNA序列(Cockerill等，1 986)，长度
在 300～2 000 bp，主要由 A—box，T—box，ATATTT
(T)序列以及与果蝇拓扑异构酶 Ⅱ位点相近的同义
顺序等特征序列组成。作为真核基因特有的一种顺
式作用元件(cis—acting element)，MAR在真核细胞
的染色体包装及基因的表达调控等方面发挥着非常
重要的作用(Vain等，1 999)。外源基因在宿主中表
达受到抑制的现象称之为转基因沉默(transgene si—
lencing)。其作用机制主要有 3种：位置效应的基因
沉默、转录水平的基因沉默和转录后水平的基因沉
默(Fagard等，2000)。研究表明将 MAR连接到报
告基因的两翼在暂时及稳定表达的转基因植物中，
能在一定程度上可以克服基因沉默增强外源基因的
表达，同时还可降低转化体之间转基因表达水平的
差异(Boreyne等，1 9 94)。MAR不仅可以使外源基
收稿日期：2004—05—31 修订日期：2004—10—2O
基金项目：国家自然科学基金(30270031)；国家高科技计划“863”资助(2002AA628050)项目。
作者简介：王天云(1968一)·男·山东梁山人．新乡医学院讲师，在渎博士．从事基因表达调控研究。 通讯作者 ：博士生导师．研究
员．研究方向为肿瘤生物工程。
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因在当代稳定表达而且可以促进外源基因在后代中
的稳定遗传(Ulker等，1999)。一般认为 MAR序列
定位于转录活跃的 DNA环状结构域的边界，从而阻
断邻近序列对基因表达的影响，使转基因能够形成一
种独立的环状结构域，从而使位置效应降低到最低限
度。迄今已有几十种 MAR从不同植物中分离出来
(Alen等，2000)，但尚没有真核藻类的相关报道。
1 材料与方法
1．1材料
盐 藻 (Dunalietla satin“ D．S VTEXi644
Teod)购自美国(University Texas)，培养条件：盐
藻培养采用改良的Ben—Amotz盐藻培养基。26℃，
光照强度 4 500 Ix，12 h光照，12 h暗培养。限制
酶、连接酶等分子生物学试剂购 自 TaKaRa公司。
pUC18，E．coli JM109等由实验室保存。杂交试剂
盒为 PIERCE公司 North2SouthHRP直接标记和
检测试剂盒。
1．2方法
1．2．1盐藻核的分 离与核基质的制备 参见 Wang
等(2004)的方法。
1．2．2核基质DNA的抽提与MAR文库的构建 参
考Nomura等(1997)Michalowski等(1999)的方法加
以改进。LIS抽提的核，加入 100 f／mL EcoRl 37℃
过夜充分消化除去结合松弛的DNA，2 400 g离心 10
rain，沉淀加入蛋 白酶 K(100 fig／mL)，RNaseA(40
fg／mL)，0．05 SDS的 TE缓冲液中，37℃过夜或
55℃消化 3 h，酚／氯仿抽提，乙醇沉淀，溶于 TE保
存。提取的核基质 DNA分别用限制酶 EcoRI，Hind
Ⅲ， qI及 RsaI消化，连接至用相应酶切的 pUC18
载体上，转化 E．coli JM109，挑选阳性克隆。
1．2．3体外结合实验 参考 Mirkovitch等(1984)加
以改进，随机挑选 6个克隆，培养提取质粒，限制酶
切出插入片段及载体 pUC18，分别用辣根过氧化物
酶标记，加入经超声波破碎的长度在 0．1～1．5 kb
的 E．coli基因组 DNA至终浓度 5O fig／L，与 A260
nm相当于3的核基质在400 fL反应体系中37℃
温育8 h，使MAR序列与核基质充分结合，离心分
离核基质沉淀，分别用蛋白酶K和SDS处理，酚／氯
仿抽提，纯化与核基质结合的 DNA及残留于上清
液中的 DNA，分别取 1／5DNA琼脂糖凝胶电泳，
TC八固定，干胶机干燥 ，X光放显。
1．2．4测序及特征性分析 将体外结合证实为阳性
的克隆抽提质粒后，测序。序列采用 primer 5．0，Bi—
oEdit等软件加 以分析，并通过 MAR—wiz(htp：／／
www．futursoft．org／MAR—wiz)进行分析。
2 结果
2．1体外结合实验
从文库中随机挑选 6个克隆，扩增后提取质粒，
酶切出插入片段及 pUC18与核基质进行体外结合
实验，从图 1可以看 出，pUC18载体不能与核基质
沉淀结合，插入片段具有明显与核基质结合的特性。
P S
pUC18
插入
试验
Fig．1 』”vitro binding assay for MAR
P：沉淀 Pellet；S： 清液 Supernatant．
2．2测序结果与特征性分析
将与核基质能够结合的片段进行测序，结果见
图 2，片段长约 600bp，其中 500bp具有 MAR序列
特征。采用软件分析后结果见表 1。从图 2测序结
果和表 1序列分析可以看出，分离出的片断具有明
显的MAR序列特征，如富含 AT(62 )，具有一些
MAR特有的模序(motifs)，如 A—box，ARS，Topo
Ⅱ，BUR，MRS，OR T，kinked等。
3 讨 论
自从 1984年 Mirkovitch等分离出第一批
MAR分子以来，迄今已有几十种MAR分子从不同
生物分离出来，并对其在染色体包装、基因表达调控
等方面作了一些研究。MAR分离方法主要分为3
种：(1)PCR扩增法 ；(2)核基质结合法；(3)MAR文
库筛选法。张可伟等(2002)首次利用 PCR从烟草
及拟南芥中扩增出4条具 MAR序列特征的 MAR
DNA片段。绝大部分 MAR序列都是通过核基质
结合法分离出来的 核基质结合法分离鉴定的往往
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2期 王天云等：杜氏盐藻核基质附着区的分离及特征性分析 147
是某一特定的 MAR片段，不利于 MAR序列一般
特征 的研究 (Nomura等，l997)。Nikolaev等
(1996)首次从人类 l9号染色体文库中选择 MAR
片段构建了一个特殊的 MAR文库。Boulikas等
(1993)用高盐抽提，核酸酶酶切从人红细胞中制备
核基质，构建了随机 MAR文库，分离纯化出了
MAR。Michalowski等(1999)用二碘水杨酸锂温
和方法抽提制备烟草核基质，构建了烟草 MAR文
库，并从中分离出l3个 MAR序列。前期的研究用
percol梯度离心分离盐藻细胞核，用 25 mM LIS抽
提制备了盐藻的核基质(Wang，2004)，本实验通过
构建盐藻随机 MAR文库，体外结合实验筛选随机
挑选的6个克隆，其中有一克隆与核基质有明显的
结合能力，测序结果表明该序列富含AT，并且包含
A—box(AATAAAYAA)，及拓扑异构酶n结合位点
等明显的 MAR序列特征(GTNWAYATTNAT—
NNR)。MAR 的 鉴定依 据 主要有 2个 (Alen，
2000)：①作为内源 DNA片段，当大多数 DNA被核
酸酶消化去除后与核基质仍紧密结合；②作为外源
加入 DNA片段，能在竞争性DNA存在情况下结合
至纯化的核基质上。我们所分离的上述 MAR片
段，首先是核酸酶消化去除后仍与核基质能紧密结
合；其次该片段在 E．coli作为竞争性 DNA情况下
进行体外结合竞争实验，与核基质有较强结合能力，
测序分析也表明序列具有明显的 MAR特征，Blast
序列比较显示该序列为新序列。
AAGGTrATrGrTAAAGCGGGGATAGGCTATAATAATATCGATGTGGAGAACGCAACAAGAAGAGGTATTGTTG
TTGCTAATGTTCCTG ATTATTGCCAGGATGAAGTAATTGACCATACATTTGGTTTGCTCTTTTCGCTAGCTAGGA
AAACTTGTTATCTlAAATfAATCAGGTTGCAAAAAAAAGGTrAAAGACGCACCCAGGCTrAAAGG
TTTGC匿委 匿圜 CTATTGGTCAACAGG匣亟垂墅圈 CTAAGCCTTT匪 雯圈
TGGTTGGcTATGATcccTTcAGcTcAccTcAAGTTTTTGAAG A警rI=n rT GAA I AATATAI ACT
AACTTTGATTCGTTTCTCAGATAGGTTGATTTTCTGTCCCTGCAAATACCTCTGAAAGACCATACA
ATACAC TAAATAAAAATCACTGTCGAAGGTAAAA．4AGCAGCTTTTGTG
—
AT
AGGAGGTCTTATCGAAGAAAACGATCTTTATTCCGCTCTTTACGAAAAAAACCTT
图 2 分离的盐藻 MAR序列
Fig．2 MAR sequence isolated from D．salina
A—box： AATAAAYAA： T—box： TTW TWTTW TT； ARS： WTTTATRTTTW ： Topoll — GT W A、tATTNATNNR： BUR —
AATATATTT；MRS TAW AW W WNNAW WRTAANNW WG or TAW AWW W + AW W RTAANNW W G：()RI— 、TTA 0r．、TTTA 。r
ATTTTA ；TG—rich— TGTTTTG or TGTTTTTTG or TTTTGGGG；Curved— AAAAN7AAAA 7AAAA or TTTAAA： KIr】kcd—
TANNNTGNNNCA or TANNNCANNTG or TGNNNTANNNCA or CANNNTANNNTG
．
杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一类可生长在
0．05～5 M NaC1无细胞壁单细胞真核藻类，盐藻作
为外源基因表达系统具备许多优点(Karni等，
l998)，目前转基因盐藻已在少数实验室开展。内源
MAR与外源 MAR作为边界元件对外源基因表达
的影响有显著的差别(Alen，l993，l996)。因此分
离盐藻的MAR无论在理论和应用实践上都具有一
定的意义。本实验分离 出了盐藻的一个 MAR片
段，为研究内源 MAR在转基因盐藻中的功能奠定
了基础。
本工作在河南省分子医学重点学科开放实验室
完成，特此感谢
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序
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● 表_垂
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