全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(1)：69— 73 2006年 1月
铁皮石斛快速繁殖和离体
种质保存的研究
罗吉凤，程治英，龙春林
(中国科学院 昆明植物研究所，云南 昆明 650204)
摘 要 ：对铁皮石斛种子发芽 、原球茎增殖、丛芽分化和壮苗培育进行 了试验 、观察和分析 ，研究了培养基、植
物激素、光强和添加剂等对其分化 和生长的影响。结果显示 ：种子在 1／2 MS+蔗糖 2 的培养基上，30 d萌发
95 以上。原球茎在 1／2 MS+椰子汁 25 +蔗糖 3 的培养基上，45～60 d原球茎增殖速度可达 1：10。丛
芽分化较适宜的培养基为 1／2 MS+BA 2 mg·L0+NAA 0．2 mg·L一 +IBA 0．1 mg·L一 +蔗糖 3 ，45～
60 d芽丛增殖速度为 1：4～5。试管苗在 MS+香蕉泥 2O +蔗糖 2 培养基上 ，大约 60 d苗快速长高，茎粗
壮且根系发达 。离体保存材料可采用试管丛芽和原球茎两种方式 ，以保持其遗传多样性。保存方法是 ：在 15
℃左右条件下 ，保存离体材料 ，继代间隔期为 12～18个月；也可以采用室温保存，在 1 ，2 MS+蔗糖 1 培养基
上，继代间隔期可延长至 10～12个月。
关键词：铁皮石斛 ；快速繁殖；离体种质保存
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)01—0069—05
Studies on the rapid propagation and in vitro
storage of Dendrobium candidum
LUO Ji—feng，CHENG Zhi—ying，LONG Chun—lin
(Kunming Institute of Botany，Chinese Academy of Sciences，Kunming 650204，China)
Abstract：The seed germination，protocorm multiplication(PLBS)，differentiation of cluster buds and produc—
tion of intact vigorous plants of Dendrobium candidum were examined，observed and analyzed
． The impacts of
basic medium ，different exogenous hormones，light intensities，and complex complements on the induction and
growth of multiple shoots were studied respectively
． The results obtained from the present Study were as fol—
lows：(1)The seed germination rate was about 95 on 1／2 MS+S 2 in 30 d：(2)The proliferation rate of
PLBS could be 1：10 in 1／2 MS+CM 25 +S 3 in 45～60 d；(3)It was the ideal medium for cluster shoot
formation in 1／2 MS+BA2+NAA 0．2+IBA 0．1．The proliferation speed reached to 1：4～5 per 45～60 d：
(4)The plantlets transferred in M S+ banana puree 20 +S 2 to help the production of vigorous plant。could
be about 5 em high in 60 d．
The cluster buds and PLBS were used as materials for in vitro storage
． Their genetic diversitv could be
maintained．The slow growth method to culture shoot tips or PI BS under room temperature condition and 1／
2 MS+S 1 ，could reduce the subculture generation and be extended to 10～ 12 months
．
The D drobi“铆
candidum was stored under the temperature of 15℃ and its growth cycle could be as long as 12～ 18 months
收稿 日期：2004—11-01 修回日期 ：2005—06—15
基金项目：国家科技基础条件平 台项 目(2004DKA30430)；中国科学院知识创新工程重要方 向项 目(KSCX2一SW一117)资助[sup—
ported by National Facilities and Information Infrastructure Foundation for Science and Technology(2004DKA30,t30)；Knowledge
Innovation Program of the Chinese Academy of Sciences(KSCX2一SW一117)]。
作者简介：罗吉凤(1963一)，女 ，云南昆明人，实验师 ，主要从事植物种质资源离体保存研究。
通讯作者(Author for correspondence)，E—mail：．
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70 广 西 植 物 26卷
for one generation．
Key words：Dendrobium candidum ；rapid propagation；in vitro germplasm storage
铁皮石斛 (Dendrobium candidum)又称 吊兰、
铁皮兰、铁皮吊兰、云南铁皮 ，是兰科石斛属多年生
草本植物 。铁皮石斛有重要 的药用价值 ，是名贵的
传统中药 ，有西枫斗 、铁皮斗等之称 ，有滋阴清热 、生
津益胃、止咳润肺之功效。尤其对嗓子沙哑的防治
有特效。
近年来 ，随着研究 的深入发现它含有石斛多糖
(黄民权等，1994)、石斛碱 、石斛苷 、石斛胺和石斛次
碱等 (张 明等 ，2000)，以及 18种 氨基酸 (阮金 月，
1997)和多种微量元素等物质 ，具有显著提高免疫力
功能 ，抑制肿瘤生长和扩张肠 系膜动脉血管(包正声
等，2001)等作用，颇具市场开发价值。
铁皮石斛是石斛类药材的上 品，但它 自然繁殖
率低，分布区域相当狭窄，仅在我国云、贵 、川和广西
等地海拔 6OO～2 500 m 的林下古树和水沟旁陡峭
的岩壁上生长，且生长缓慢 ，分枝少，生物量低(王立
安，199O)。近年来 ，由于人们对其过度采挖 ，导致其
野生资源急剧减少 ，日趋濒危，现 已被列为国家重点
保护植物。为保护这一物种 ，扩充药源，我们进行了
繁殖技术和保存方法的研究，以期今后实现其工厂
化生产 ，满足社会经济发展的需要。
1 材料与方法
1．1材料
采 自云南广南县，为野生未开裂的铁皮石斛果
实。
1．2方法
1．2．1外植体消毒 用 95 酒精棉球仔细擦果实表
面，再在 70 乙醇中浸透 ，然后在酒精灯上烧 ，待果
实稍冷却 ，将种子全部放入无菌水中，接种时用无菌
吸管吸上来 ，放入诱导种子萌发的培养基即可。
1．2．2培养备件 将种子分别接入 MS、1／2MS、1／2
N6、1／3 N6和 White培养基上，30 d后统计种子萌
发数(萌发标准以种子露白为准)，萌发率，并比较了
光培养和暗培养对种子萌发的影响。原球茎增殖培
养基为 1／2 MS十CM 25 十S 2 。丛芽分 化实
验，我们采用了不同植物激素种类 (如 BA、KT、ZT、
NAA、2，4一D、IAA和 GA。)及其不 同组合(1／2 MS
+2，4一D 1 mg·L (单位下 同)与 1／2 MS十BA2十
NAA 0．2+IBA 0．1)。壮苗培养基 比较了 1／2 MS
+Kt2、1／2 MS+BA 2+NAA 0．2，并试验了天然
添加物 (2O 香蕉泥 ，10 番石 榴泥和 LH 500 mg
· L。)和光强(3 000 lx和 7 000 Ix)对试管苗生长的
影响。培养基 pH5．5-5．8，培养温度 27±1℃、15
℃和室温，光照强度根据铁皮石斛生长发育需要，分
别采用 2 000 lx、3 000 lx和 7 000 lx。光照时间 12
h／d。糖浓度 1％、2 和 3 三种设置(每种处理 10
瓶，8苗／瓶)。
1．3三种移植炼苗基质
栽苗用具用 0．2 多菌灵液消毒 3O S，栽苗基
质采用0．5-1 em的粗砂粒和苔藓，用 0．1 百菌
清液消毒 2O min，备用。
2 实验结果
2．1种子培养
2．1．1种子的构造和发 芽过程 铁皮石斛种子 (在
光学显微镜下)外形为长纺锤形 ，种子大小为长 0．4
mm 宽 0．09 mm。种子构造十分简单 ，由疏松透明
的一薄层细胞组成的种皮 ，种皮表面呈现网状纹饰 ，
种子 中央有一胚，卵型 ，无胚乳(图 1)。种子接种后
7～10 d，可见胚长大(图 2)；15 d左右，胚几乎充满
整个种子 ，呈球形 (图 3)；约 2O d胚 突破种 皮 (图
4)；约 25～3O d长出假根 1～2条 (图 7)；球形胚的
表层细胞分裂加速(图 6)；原球茎大量形成(图 8)。
2．1．2光和暗培养对种子发芽的影响 种子在光照
和黑暗条件下培养均能萌发 ，但在光下培养的种子
15 d后胚 呈绿色 ，2O d胚 长大逸 出种 皮并出现假
根。而在黑暗条件下培养 的种 子 15 d时胚呈黄 白
色 ，25 d胚才开始膨大 ，5O d胚长大溢出种皮，并长
假根 。这说 明光照条件下种子萌发比黑暗条件下大
大提前 ，光更利于种子萌发。
2．1．3基本培养基对种子萌发的影响 种子在各种
培养基上均能萌发在 MS、1／2 MS、1／2 N6和white
培养基上 ，3o d种子发芽率均达到 95％，差异表现
在原球体的直径上 ，分别是 1、1．2、0．5 mm 和 0．5
mm。说明 1／2 MS更有利于种子萌发。1／3 N6培
养基上培养的种子 ，3O d仅 70 萌发 ，原球茎大小
为 0．5 mm，表现最差 。
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罗吉m等 ：铁皮石斛的 瞻速 繁殖干几离体种质保存的研究 7
2．2原球 茎的增殖
腺球 茎分别 拄种 在 1／2 MS千fl 1／2 MS+CM
25， 培养基 ．后 暂 j～6一r d愿球 茎增殖速度 1：
l0左 右．且隳球茎颜色更绿 、更亮 ．个 犬 前 者增 殖
速鹰还不到它的一半．所以我们认为后者更适宜于
棘球茎 的增照 =
⑦
慨 ～，～
～ 一
㈣
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26卷
霉
1 掣 一z 一 4
A
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图8 1(I 8原球茎；9丛芽；10．完档 管苗
Figs．8一I cI 8 f I()1．f]C(I rnlN；9 Clu~t cr buds；10．Plantle：s A：1．BAi；2．ZI1；3．IAA ；4 GA I；5．2， D1 B：1
2， 【)2+【、M 2 ；2 2． D II i 3 2．1 D2：4．2． D1一l Kf 0 2
2．3芽的分化
为丁|，解植物礅素种类和组台刘丛芽分化的影
响 ．我“1做了以下实验 (表 1) 从表 l可以看 出 l 2
MS一13A 2 NAA 0 2+lt3A 0．1的培养基较适宜
丛芽分化．其次为1／2 Ms+2，4 D1和 !／2 Ms一2，
{一D1一Kt 0．2 60 d丛芽增殖率可达 l：3～ 。
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l期 罗吉凤等：铁皮石斛的快速繁殖和离体种质保存的研究 73
2．4壮苗的培养
2．4．1植物激素和添加物对培育壮苗的影响 我们
实验了①MS+Kt2；②MS+2，4一Dl+CM 10 ；③
MS+香蕉泥 2O ；④MS+香蕉泥 2O 十NAA2；
⑤MS+2，4一Dl+ LH 500和 ⑥ MS+ 番石 榴 泥
lO 。这 6组实验均培养 60 d，观察表明(表 2)：第
⑥组最差，表现为叶色淡绿 ，苗高仅 l crn左右 。第
5组培养基有利根生长 、增粗 和根毛发生，苗高约 3
crn。第③④组培养基较利壮苗，第③组培养基上的
苗根系发达 ，苗高达 4～5 crn，第④组培养基上苗高
可达 5～6 crn，但苗基部易产生丛芽 ，不利试管苗的
移栽 ，因此，我们选用 MS+香蕉泥 2O 的培养基作
壮苗培养基。
表 1 植物激素对不定芽分化和生长的影响
Table 1 The impact of plant hormones on the
diferentiation and growth of cluster buds
激素类型
Hormone
types
丛芽分化状况
C：luster
budS
differentiation
叶片大
，I、1)
I eaf size
(mm)
培养时间60 d；测量叶片大小时取最大叶；基本培养基为 1／2MS。
The culturing time was 60 d；The biggest leaf was selected for meas
urement；Basic medium was 1／2 MS．
2．4．2光照强度对壮苗的影响 我们 以 MS+2，4一
Dl作为培养基 ，选取具 2～4叶，高约 1．2 CITI的芽
条，放在光强分别为 3 000 lx和 7 000 lx的条件下
培养 。经过 60 d培养，芽条上平均叶数分别为 5片
和 6片，平均株高分别 为 3．3 crn和 5．8 crn。这 表
明在培育壮苗时 ，适 当增加光强是很有利的。
2．5试管苗的移栽
将根系发达 ，茎粗壮 ，株高达 5 crn左右 的试管
苗，去掉根系上所粘附的琼脂 ，2～3苗一组用已灭
过菌的苔藓包住根系，放在填有碎砖粒的小盆内，注
意保湿，通风和遮荫 (70 荫蔽度)，控制温度为 25
±2℃，30 d后待长出新根系或叶时，可去掉保湿用
的覆盖膜。每周施 1次液肥 ，浓度 为 1／10 MS液，
随着苗的生长，施肥浓度逐渐增 加。移栽成活率最
高可达 8O 9／6。
3 离体保存
将试验所得的铁皮石斛原球茎和试管丛芽，放
人 l5℃培养条件下保存，继代间隔期可延长至 l8
个月，一旦需要取出来就可用于快速繁殖 ，几乎无不
正常现象 。我们还对离体材料在室温下保存做了一
些探索。结果显示 ：在 1／2 MS+蔗糖 l 0,4限制碳源
的培养基上 ，培养的原球茎和丛芽 ，继代周期也可延
长 lO～l2个月，由此可见 ，在没有低温设施 的情况
下 ，也可用此方法达到限制生长和离体保存 的目的。
表 2 植物激素和添加剂对壮苗的影响
Table 2 The impact of plant hormones and
organic supplement on plantlet
处理 苗状况
Treatment(mg／I ) Plantlet status
苗高(cm)
Seedling
height
①MS+ Kt2 壮 1．5
②MS十2，4一D1十CM 10 较弱 4．5
③Ms+香蕉泥 2O 壮(根系发达) 4．5
④Ms+香蕉泥 2O +NAA2 壮(苗基部有丛芽) 5．5
⑤MS+2，4 I)1+I H 500 较弱(根系发达具根毛) 3．0
⑥Ms+番石榴泥 10％ 弱 1．0
4 讨论
叶秀 等(1988)观察 了种子成熟过程中的形态
发育及其在离体培养时的表现，而我们偏重观察种
子离体培养时的萌发过程，以及快繁程序及技术。
通过多年探索，铁皮石斛组培苗的生产工艺如下：
种子 1／2MS+S2
30～ 50 d 2 000 I
原 球 茎 1／2MS+CM25 +S2
45～60 d 2 000 Ix
原球茎增殖 砉 丛芽
壮苗——移苗 — — — —’- 莆 ·耩
在铁皮石斛丛芽增殖和壮苗培育中，我们发现
芽条有开花现象，开花时间从 1月底断断续续 ，一直
延续到 8月底 ，开花最多时可达 lO 9／6，2个月后，其
花开始枯萎。这意味着需要进一步探讨成花原因以
达到人为控制的 目的，更重要的是有利于该物种的
育种和品质改良。促进开发此种花的微型培养瓶 ，
(下转第 62页 Continue on page 62)
高
芽 B
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62 广 西 植 物 26卷
sm、m、t和 st型 ；而祁 门过黄的分别是 sm、m、st、t、
st和 sm 型。诚然，在进行核型分析时 ，染色体上的
一 些 差 异 有 可 能 是 人 为 因 素 导 致 的 (洪 德 元 ，
l986b)，但本文研究 的这两种植 物，同种 的不 同居
群间核型高度一致，而种问 的核型却存在显著的差
异 ，已超出了种内分化 的水平和人为测量导致的可
能。再加上祁门过路 黄叶基部为 心形，花 常 l～3
朵 ，腋生 ，具总梗，绝不集生于茎端 ，具苞片 ，果柄伸
长达 4～8 em 等外形特征与 巴东过路黄叶基部楔
形、截形或圆形 ，花 2～4朵集生于茎端 ，无苞片 ，果
柄不伸长，仅 0．6～3．0 cm相区别 ，另立为新种处理
是恰 当的。
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(上接第 73页 Continue from page 73)
以作为旅游小商品出售。
铁皮石斛快速繁殖的目的，是减轻野生资源的
采挖压力和增加药源 ，这就要求组培苗保持野生苗
的遗传性不变。此外 ，还有研究 者比较 了铁皮石斛
野生苗与组培苗形态特征、药材性状以及有效成分
的含量，并做了药理分析，证实了组培苗可以替代野
生苗使用(冯德强 ，1999；顾慧芬等，1999)。
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