全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(2)：139— 143 2004年 3月
水稻几丁质酶基因导入芥菜型油菜的研究
骞 宇，王健美，游大慧，吴 俊，罗 勤，李旭锋
(四川大学生命科学学院，四川成都 610064)
摘 要 ：以芥菜型油菜 (Brassica juncea L．)下胚轴为转化材料 ，通过根癌农杆 菌(Agrobacterium tumefa—
ciens)介导将水稻的几 丁质酶基因(Rice chitinase gene)导入“泸洲 四陵”油菜品种 中，获得抗潮霉素的再生转
基因植株，并讨论了影响油菜再生及转化效率的几个因素。对部分经潮霉素筛选得到的再生植株进行了多次
重复PCR检测，发现其中4o 以上的潮霉素抗性植株均表现出较强的阳性反应，初步证明几丁质酶基因已整
合到油菜细胞核基因组 中。
关键词 ：几丁质酶基 因；转基 因油菜 ；农杆菌介导法
中图分类号：Q943 文献标识码 ；A 文章编号：1OOO一3142(2OO4)O2—0139—05
‘
一‘ ‘ ‘ ’／n ‘ tudies On trans~enic rapeseed 11rassica
● 、 ● J l ● l ● J ● l
， C a Wltn rlCe CnlntlnaSe gene by
Agrobacterium tumefacien
QIAN Yu，WANG Jian-mei，Y0U Da-hui，
W U Jun，LU0 Qin，LI Xu—feng
(College of Life Science，Sichuan University，Chengdu 610064，China)
Abstract：In an experiment with the hypocotyls of rapeseed(“luzhousiling”Brassica juncea L．)as explants in
invitr‘o culture．a transformation of introducing rice chitinase gene into“luzhousiling”by Agrobacterium tume—
faciens was established．Some Hyg—resistant green shoots were obtained．PCR test of the resistant plants indi—
cated that 4O of the Hyg-resistant plants showed strong positive reaction，suggesting that chitinase gene had
been integrated into the genome of rapeseed．
Key words：chitinase gene；transgenic oilseed rape；Agrobacterium tumefadens—medisted transformation
芥菜型油菜是我国重要的经济作物之一，但由
于受到多种病害特别是菌核病的危害，其产量和品
质受到严重影响。多年来，尽管育种工作者们试图
采用传统的育种手段来获得抗病油菜良种，但进展
却十分缓慢。因此，利用植物基因工程，转人外源抗
真菌基因使油菜获得对菌核病的抗性无疑成为油菜
抗病育种的一条可行的新途径。几丁质酶是现今研
究得最多且应用最广泛的抗真菌蛋白之一，它能催
化真菌细胞壁的重要物质之一几丁质(聚乙酰胺基
葡萄糖 Chitin)水解 ，从 而抑制真菌的生长和增殖 。
利用分子生物学手段将带有强启动子的几丁质酶基
因转人某些作物，转化植株组成型超量表达几丁质
酶，可有效增强其抗病性，此方面成功报道在国内外
已日益增多(单丽波等，1998；Grison等，1996)。因
此，我们利用根癌农杆菌介导的转化方法将抗真菌
病的水稻几丁质酶基因(Rice chitinase gene)导人
芥菜型油菜品种““泸洲四陵”中”，以期获得抗病转
基因植株。
收稿 日期 ：2003—10—31 修订 日期 ：2003—12—26
作者简介：骞字(1976一)，女 ，四川成都人，硕士生，从事油菜育种研究。 为通讯作者
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1 材料与方法
1．1实验材料
1．1．1植物材料 遗传转化所用的油菜品种：芥菜
型油菜“泸洲四陵”为本实验室所有。
1．1．2质粒与 茵株 根癌农 杆 菌 (Agrobacterium
tumefaciens)LBA4404为农杆菌受体菌，为本实验
室所有。PMD-18T载体和大肠杆菌 DH5a为本实
验室所有。植物表达载体 (pcambar．chi．11-chiti—
nase，Hygrornycinr)含有 chitinase目的基因 ，Ubiq—
uitin启动子以及潮霉素筛选标记基因，该质粒为蒋
昌顺老师构建。结构如图 1所示 。
1．1．3培养基 ①无菌苗培养基：MS；②预培养基：
RB
MS+2．0 mg／L 6-BA；③ 为了获得最佳分化效果 ，
以MS为基础配制了 14种不同的浓度的激素配比
的培养基 ：MS+6一BA(1．0，2．0和 3．0 mg／L)+
NAA(0．1，0．5和 1．0 mg／L)+2，4-D(0．5，1．0
mg／L)+羧苄青霉素 250 mg／L，在这些培养基中筛
选出最佳的激素组合 ，添加 AgNO。6 mg／L，设不含
AgNO 的培养基作对照实验组；④筛选培养基：分
化培养基+10 mg／L潮霉素 +250 mg／L羧苄青霉
素+6 mg／L AgNO ；⑤生根培养基：MS+300 rag／
L头孢 青 霉素 (cef)+ 10 mg／L潮霉 素 6-BA(6一
Benzylaminopurine)：6 一苄 基 氨 基 嘌 呤；NAA
(Naphthaleneaceticacid)：萘乙酸。
以上培养基均含 3 的蔗糖，0．8 的琼脂，
PH5．8。
LB
UbiquitinH ehitinase H CaMV35SH BARHNosHHygromycin(R)H CaMV35S PolyA
Bam H 1
Pstl Sphl Hind II Hind II Clal Sal1
图 1 植物表达载体 PCMBAR．CHI．11构建图谱
Fig．1 Chart of plants expressing vector PCMBAR．CHI．11
1．1．4酶与试剂 TaqDNA聚合酶和限制性内切酶
均购自上海生物工程有限责任公司。其他试剂均为
国产或进 口分析纯。
1．1．5 PCR引物 检测水稻几丁质酶基 因的引物：
5 端 引物 ：5 一TTGCTGAAGATCGATGCACC-3 ；
3 端 引物 ：5 一GTCGACCTGCAGGTCAACGG一3 。
引物由上海捷倍思基因技术有限公司合成。
1．2试验方法
1．2．1无茵苗的获得 选取籽粒饱满的“泸洲 四陵”
油菜种子，7O％乙醇浸泡 30 S，0．1 的升汞溶液浸
泡 8 min，无菌水冲洗 5～6次，接种于 MS固体培养
基上。置培养室中 26～28℃下、光照 16 h／d继续
萌发。取 8 d龄无菌苗下胚轴作为转化受体。
1．2．2农杆茵介导的遗传转化 取出-80℃下保存
的含有目的表达载体的农杆菌菌株 LBA4404，划线
接种于附加 50 mg／L卡那霉素、25 mg／L链霉素的
LB平板上 ，在 28℃下倒置培养 2 d。从 LB平板上
挑取一个单菌落，接种于 50 mL LB(含有 50 mg／L
卡那霉素，25 mg／L链霉素)液体培养基中，置摇床
上 170 r／min，28℃下培养过夜 (16～20 h)进行预
活化。取 1 mL菌液接种于50 mL同样 LB培养基
中相同条件下培养至对数生长期。取对数生长期菌
液室温下 6 000 r／min离心收集菌体，弃上清，用
MS(附加乙酰丁香酮 100 mg／L)液体培养基 28℃
摇床培养 2 h，备用。取 8 d龄的幼苗下胚轴(0．5
cm)，接入预培养基中预培养 2～3 d，然后浸入备好
的农杆菌菌液感染 30 S．其间不断振荡使菌液与外
植体充分接触。用灭菌滤纸迅速吸干多余的菌液，
将下胚轴平放在预培养基上，黑暗中共培养2 d。共
培养结束后，取出外植体接入分化培养基中脱菌培
养 6～7 d(25～28℃，光照 16 h／d)后 ，转入附加 10
mg／L潮霉素和 250 mg／L羧苄青霉素的筛选培养
基中进行筛选分化培养(25～28℃，光照 16 h／d)，8
d继代 1次。2～4周后即有愈伤组织的形成和芽的
分化。待绿芽长到 1～2 cm高后，切下绿芽转入含
10 mg／L潮霉素的生根培养基中，当根系发达成为
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2期 骞 宇等：水稻几丁质酶基因导入芥菜型油菜的研究 141
完整的植株后，经炼苗便可移栽至土钵中。
1．2．3植物总 DNA提取及 PCR检测 取抗性转基
因油菜和非转基因油菜植株的幼嫩叶片各 1～2 g，
采用 CTAB法(Murray和 Thompson，1980)提植物
总 DNA。转基因植 株的 PCR检测 ：取 以上制备的
总DNA为模板，采用 25 L反应体系的标准反应
程序对目的基因进行 PCR扩增。具体反应条件为：
94℃ ，2 min；94 ℃ ，30 S；55 ℃ ，1．5 min；72℃ ，30
S；30 cycIes；72℃ ，4 min。PCR产物以 0、8％的琼
脂糖电泳进行检测 。
2 结果与分析
2．1高效油菜农杆菌遗传转化 系统
本研究对“泸洲四陵”下胚轴预培养时间及经农
杆菌浸染后的“泸洲四陵”下胚轴在不同激素配比的
培养基 中的再生和分化 、AgNO 浓度 、农杆菌浸染
浓度及时间等方面进行了优化，建立了一种适合“泸
洲四陵”油菜的高效转化体系。
2．1．1预培养对下胚轴遗传转化的影响 “泸洲四
陵”油菜下胚轴在被农杆 菌感染 前用含较高浓度 6一
BA的培养基进行短时间的预培养，能提高转化率；
因为 6-BA对芽器官发生具有很强的诱导作用。本
实验采用表 1的实验后发现：适当浓度的 6一BA(1．5
～ 2．0 mg／L)对下胚轴进行 2～3 d的预培养可明显
地提高抗性芽率。6-BA浓度高于 2 mg／L或预培
养时间超过 4 d外植体两端切面会呈现疏松状，且
切面创伤逐渐愈合致使农杆菌难以感染进去，从而
使再生频率和转化效率降低。而 6-BA浓度低于 1
mg／L或预培养时间少于 1 d时下胚轴分化不明显，
感染后也会产生较严重 的褐化和死亡现象，转化率
较低。
表 1 预培养时间对转化效率的影响
Table 1 The influence of pre-culture to
transformation efficiency
2．1．2培养基激素配比的调整 经农杆菌感染的
“泸洲四陵”油菜的下胚轴在分化中用了 14种激素
表 2 NAA、6-BA与 2。4-D配比对诱导不定芽的影响
Table 2 The influence of hormone to shoot differentiation
培养基序号
Number
激素组合 Hormone(mg／L) 接种下胚轴数 25 d后再生出绿芽 诱导率(％)
Inoculation 的下胚轴数(个) Inducement
number(个) Shoot number effieieney
配比，在实验中发现 当 NAA~0．5 mg／L，6-BA~2
mg／L时，不定芽的玻璃化 程度严重 ，在含 MS+6一
BA 2 mg／L+NAA 0．1 mg／L+2，4一D 1 mg／L的
培养基中，2O d后外植体的愈伤组织和不定芽的分
化率最高，达 35 (表 2)。
2．1．3 AgNO。对下胚轴再生的影响 AgN03作为
乙烯抑制剂，是油菜组织培养中常用的添加剂，它可
以促进外植体分化、防止褐化，从而可以较大幅度地
鹊 髂 盯 鹊
3 口； ＆
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1 2 3 4 5 6 7 8 9 n n M
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142 广 西 植 物 24卷
提高油莱再生频率及再生芽数(Palmer，1992；Rad—
ke等，1992)。
AgNO。对离体培养物的再生具有直接的促进
作用，它不仅可以促进具有再生潜力的细胞数目增
加并促进下胚轴芽原基的产生，还能促进芽原基的
伸长加快，提高芽原基的成芽比例(Radke等，1992
张鹏等，1997)。
本实验在 MS+6-BA 2 mg／L+NAA 0．1 mg／
L+2，4一D 1 mg／L的培养基中添加了 AgNO。6
mg／L，与不添加 AgNO。的对照组 比较 ，发现添加
AgNO。的培养基上的子叶愈伤组织的褐化率大大
降低，其再生频率相对于对照(未加 AgNO。)提高了
约 30 。
2．2农杆菌介导的遗传转化
2．2．1共培养时间对转化的影响 在外植体与农杆
菌的共培养中，将完成外源基因向受体细胞转移并
整合到受体细胞核基因组中的整个过程，一般认为
这一过程需要 16 h以上。因此，共培养时间对转化
效率有着很大影响，而且不同的物种和受体材料，农
杆菌的最佳共培养时间不同。由于油菜下胚轴与农
杆菌易发生过敏反应，故适宜短时间共培养。在本
试验中，共培养 2 d可较好的完成外源基因的整合
过程。继续延长共培养时间达 3 d以上，农杆菌会
过度生长，外植体将受到过度的感染使褐化现象严
重，再生困难，且后继培养中抑菌困难，转化率大大
降低 。
2．2．2农杆菌茵液浓度及浸染时间对转化的影响
建立适宜的农杆菌感染浓度和时间是影响遗传
转化成功与否的重要因素。试验证明，当农杆菌菌
液浓度(OD6。)在 0．5时处理下胚轴 30 S左右 ，对培
养切段的感染结果较好，得到了较高的抗性芽率。
采用 OD 。=0．5进行短时间感染(<30 s)，尽管褐
化程度减轻，但因浸染时间过短，农杆菌未能充分吸
附于下胚轴两端切面的细胞上，因而转化效率很低。
而在 OD 。=0．5时 ，下胚 轴感染 时间>1 rain就会
引起严重的褐化而死亡。而当 ODe。>0．5时 ，外植
体褐化现象十分严重，而且抑菌困难，再生率极低，
大部分外植体在共培养和筛选过程中逐渐发白死
亡。但若农杆菌浓度过低，尤其是当 OD。。<0．2
时，经过筛选几乎得不到绿芽。试验表明，以 ODs。o
20．5的菌液处理外植体 30 S，转化效率最高，实验
结果见表 3。
2．2．3转化再生植株的 PCR检测及 PCR结果测序
取抗性植株的叶片和非转基因油菜植株的叶片，
提取基因组 DNA后 ，用 PCR方法检测发现扩增出
的 DNA片段大小与阳性对照 PCAMBAR．CHI．11
一 致(1 108 bp)，而两个阴性对照均未扩增出任何
谱带，初步证明外源几丁质酶基因已经整合进抗性
油菜植株 中，电泳检测结果见图 2。
表 3 农杆菌菌液浓度和浸染时间对转化的影响
Table 3 The influence of Agrobacterium tumefaciens
concentration and infection to transform
农杆菌菌液
感染时问 浓度(OD6oo)
Infection Agrobacterium
time(s) tumefaciens
cOncentratiOn
巷 嚣 轴数(个
( ； I nocu1
．
atio“
ntlm her ，
ntim her
转化率
(％)
Transfor-
m ation
eficiency
1O
3O
60
9．26
11．34
16．17
23．O8
36．25
5．33
O
O
注：8 d龄”泸洲四凌”下胚轴经预培养 2 d后浸染。
Note：Infect 8 d luzhousiling hypoderm of pre-cuhure 2 d
M 1 2 3 4 5 6 7
图 2 转基因植株的 PCR检测结果
Fig．2 PCR analysis of transgenic plants
1．7．未转化油菜(Non-transgenic plant)；2～5．转基因
油菜(Transgenic plant)；6．质粒(Plasmid pcambar．
ehi．11)l M．DNA MarkerDL 2 000．
回收 1 kb左右的那条特征带与 PMD-18T载
体连接，转化大肠杆菌 DH5a的感受态细胞，挑阳
性克隆测序，确认该特征带是插入的几丁质酶基因。
3 讨 论
自1991年 Broglie等在 Science上报道利用几
丁质酶基因转化烟草使其表现对菌核病的抗性以
来，几丁质酶基因在植物抗真菌病研究中日益增多
n ∞ 娼 0 0 0
m卯∞m m m ％
2 5 1 3 5 1 5
c； c； c； c； c； c；
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2期 骞 宇等：水稻几丁质酶基因导人芥菜型油菜的研究 143
(Uila，1992)。目前，国内“泸洲四陵”油菜推广速度
缓慢，其原因之一是它对菌核病的抗性较差，如能获
得抗病转基因植株，并育成新品种，便可能加速其推
广与利用。本研究室用农杆菌介导的转化方法将水
稻几丁质酶基因导人“泸洲四陵”芥菜型油菜中，获
得部分抗性植株并进行了初步的 PCR分子生物学
检测 ，进一步的检测鉴定工作正在进行 中。国内 尚
未见有获得“泸洲四陵”油莱抗菌核病转基因植株的
报道。
为了获得更多的转基因抗病植株，首先要提高
下胚轴在农杆菌浸染后再生绿芽的频率，目前国内
外关于这方面的研究主要集中在如何提高外植体再
生频率这一点上。很多研究发现，激素组合和培养
条件是影响油菜外植体再生频率的因素(Jain等，
1988；Khehra和 Mathias，1992)，本 实验研究 了一
些影响油莱下胚轴不定芽再生及转化的因素，发现
预培养时间、激素组合及浓度、AgNO。、农杆菌浸染
浓度和时间对下胚轴的芽再生都有不同程度的影
响。本实验发现”泸洲四陵”下胚轴在农杆菌感染前
进行 2～3 d的预培养所得到较高的转化率明显高
于不进行预培养和预培养时间长于 3 d的下胚轴，
这与前人的报道(石淑稳等，1998；Charest等，1998)
相一致。特别值得注意的是本实验还发现最适合
“泸洲四陵”油菜下胚轴生长的分化培养基为含 MS
+6一BA 2 mg／L+NAA 0．1 mg／L+2，4一D l mg／L
的培养基，这为提高其外植体分化率及进一步的研
究提供 了基础 。
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