全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(4)：367—372 2004年 7月
硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展
张 涛1，陈 云2，谢 虹2，梁建生2
(I．扬州大学农学院，江苏扬州 225009}2．扬州大学生物科学与技术学院，江苏扬州 225009)
摘 要：氮素是农业研究的重点，硝酸还原酶是氮代谢中的一个关键酶。有关硝酸还原酶的研究一直是植物
生理生化研究的重点。该文就近年来有关硝酸还原酶活性调节的可能机制的研究进展作了简要的综述。
关键词：硝酸还原酶；蛋白激酶；磷酸酯酶；14-3-3蛋白
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号：1ooo一3142(2oo4)o4—0367-06
The research progress 0f the regulation 0f nitrate
reductase activity and the possible mechanism
ZHANG Tao1，CHEN Yun2，XIE Hong2，
LIANG J ian-sheng2
(1．College of Agriculture，Yangzhou University，Yangzhou 225009，China；2．Colege of Biological
Science and Technolog，Yangzhou tiniversity，Yangzhou 225009。China)
Abstract：Nitrogen is an emphasis in the study of agriculture．The study of nitrate reductase，which is a key·
enzyme in the metabolism of nitrogen，is always important in life science．This article summarizes the research
progress of the regulation of nitrate reductase activity and the possible mechanism in recent years．
Key words：nitrate reductase；protein kinase；phosphorylation；14-3-3 protein
硝酸还原酶(nitrate reductase，NR，EC．1．6．6．
1／2)是氮代谢过程中的一个重要的调节酶和限速
酶。在植物的根和叶中都有该酶的存在，它是一种
可溶性的钼黄素蛋 白，由黄素腺嘌呤二核苷酸
(FAD)、细胞色素 b 和钼等辅助因子组成。研究
表明，NR催化的反应不是唯一的，它能够催化 2个
电子从 NAD(P)H+H 至 NO。一，使后者转变为
NOz一；还可以催化一个电子从 NAD(P>H+H 至
NO2一生成 NO(Yamasaki等，1999)；还有报道 NR
能催化 1个电子从 NAD(P)H+H 至0 生成超氧
自由基(图 1)(Barber和 Kay，1996；Yamasaki和
Sakihama，2000)。
在正常情况下，还原 NO。一为 NO 一的反应是
硝酸还原酶催化反应的主流，反应在细胞质中进行。
NR催化 NOz一生成 NO的反应只占催化 NO。一还
原能力的很小百分 比(约 1 )，尽管产生 NO的量
很少，但其对植物的一些生理活动有着重要的调节
及影响，Radhika Desilan等发现，NR催化 NO 一产
生的 NO在 ABA诱导气孔关闭的过程中有重要的
作用，通过对 ABA钝感型等突变体的研究发现，
NR催化的 NO的生成是 ABA诱导气孔关闭所需
的。但是NO在其他生理活动中的作用机理尚不清
楚(Kaiser和 Huber，2001)。
硝酸还原酶的组成
研究发现，高等植物的 NR似乎是由相同亚基
组成的二聚体，每个亚基含有 3个辅助因子，即
收稿日期：2003·03—24 修订 日期：2003—09—24
作者简介：张涛(1979一)，男，山东威海人，硕士研究生．植物学专业。 *为通讯作者
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FAD、血红素(细胞色素 b。 )和钼辅因子(MoCo)。
每个辅因子相当于一个氧化还原中心。MoCo是一
个取代的喋呤基(又称钼喋呤)，含有由两个硫配体
结合的钼。用限制性内切酶对菠菜 NR进行酶切，
发现二聚体结构的分子具有 75 KDa含钼的区域，
血红素辅基与 14 KDa区域相联系，而 FAD辅基包
含在 28 KDa的区域，3个区域似乎通过铰链区域
(hinge regions)连接。通过对高等植物 NR的克隆
和序列分析得知：MoCo结合区域位于蛋白质 N一末
端，血红素结合区域位于蛋 白质的中心区域，FAD
结合区域位于蛋 白质的 C一末端。后来得知，NR分
子中电子的传递途径是 NAD(P)H+H 一FAD一
细胞色素 b。 一钼喋呤一硝酸盐(宋松泉等，1993；
Ahmad和 Abdin，1999)。
在大多数高等植物中，NR以 NADH为电子供
体，这种NR对 NO 一有相对低的Km值。而在水
稻幼苗、大豆等植物中，NR可以从 NADH+H 或
NADPH+H 得到电子，并且以 NADPH+H 为
电子供体时活性较高。Ahmad等(1999)发现芥菜
幼苗期，当 营养 液 中的 NO。一浓 度 较 低 时，以
NADH为电子供体的 NR催化 占主导，随着 NO。一
浓度的升高，以 NADPH为电子供体的 NR催化占
据了主导作用。
2 硝酸还原酶活性调节机制
2．1硝酸还原酶的活性状态
NR对环境条件十分敏感，光、NO。一含量、CO。
浓度等均会影响其活性。例如菠菜由光下移至暗中
几分钟后，其叶片NR便明显地失活，而NR蛋白的
合成或降解无法在如此短时间内达到这样的结果
(Kaiser和 Forster，1989)。可以设想，植物体内存
在一种机制，能快速准确地调控 NR的活性以适应
环境条件的改变。这种改变可能只是 NR蛋白自身
的改变，并没有涉及到转录或翻译水平。用凝胶柱
层析的方法除去粗酶液中的小分子化合物后，NR
仍可以保持相当的活性，这说明该酶不是变构调节
(alosteric modulation)，其活性的改变是由于 NR
蛋白的修饰而实现的，由此推测最有可能的机制是
蛋白的氧化／还原或蛋白的磷酸化／去磷酸化，由于
还原剂二硫苏糖醇(DTT)或氧化剂过氧化氢对 NR
的活性影响不大(Kaiser和 Huber，1994)，因而得知
NR活性的调节不是由蛋 白的氧化／还原引起的。
通过。。P标记技术 ，发现菠菜 NR蛋 白在 Serst。可以
被磷酸化，并引起 NR的失活。后来又发现，磷酸化
不是 NR失活唯一的原因，它还需要额外的蛋白的
参与(Kaiser和 Huber，2001)，这类蛋 白即 14-3—3
蛋白家族。在有毫摩尔每升浓度级的游离 Mg。 存
在的情况下，14-3-3蛋 白(14-3-3s)与 NR的磷酸化
位点结合，从而导致 NR失活(Aitken，1996；Moor-
head等，1999)。所 以推测细胞 中 NR可能存在 3
种状态：① 自由的 NR(具有酶活性)；②被磷酸化的
NR(pNR，具有酶活性)；③14-3-3s结合的磷酸化
NR(pNR：14—3-3s，无酶活性)(Kaiser等，2002)。
以上三种状态的 NR的比率是可变的，且主要是由
环境因素决定的，当外界条件例如光、NO。一、COz
等发生改变时，三种 NR活性状态的比率会发生可
逆而迅速的变化，现在认为这是暗处理一段时间后，
菠菜叶片中 NR快速地失活的主要原因。
NAD(P)H+H
NAD(P)
02‘
NO ’ NO，‘
NO3‘
02’
图 1 NR催化反应示图(由还原性辅酶提供电子，
NR可以催化三种不同的反应)
Fig．1 Reactions catalyzed by NR(NAD(P)H+ H+
afford electron，NR can catalyze three reactions)
1．NO3一还原成 NOz—l 2．NO2一还原成 NO,
3．02还原成超氧自由基．
1．Deoxidize NO3一 to N02一 l 2．Deoxidize N02一 to NO,
3．Deoxidize O2 to oT．
2．1．1 14—3-3蛋白家族 14-3-3s是起广泛调节作
用的一类蛋白。最先发现 14-3-3s是存在于动物中
的含量丰富、酸性的、可溶性的脑蛋白，其分子量为
25~32 kDa。但随着植物领域的进一步研究，发现
在所有的已研究的真核生物器官中均有 14—3—3s家
族成员的存在，Rosenquist等列出在 48个品种中有
153种该类蛋白。14-3-3s有着高度的序列一致性，
即使在不同的品种内，它也可以对靶蛋 白起作用。
14-3—3s一般是通过与目标蛋白结合而起作用的，目
标蛋白通常会有磷酸化位点 ，14—3-3s可以识别该位
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点，结合后起到调节的作用。Muslin等发现 14—3—
3s识别的位点通常有 RSXpSXP序列(X表示任意
一 种氨基酸，pS表示磷酸化的 Ser。)(Muslin等，
1996)，当然 14—3—3s还可以与其他的磷酸化片断或
非磷酸化片断结合(Masters等，1999)。
在高等植物中，14-3-3s可以调节众多的生物代
谢过程，甚至在拟南芥中，由于 14—3—3s的这种广泛
调节作用，又称之为广泛调节因子(GRFs)(Rooney
和 Ferl，1995)。14—3—3s能够调节蛋白激酶 C的活
化(Toker等，1990)，通过植物质膜 H 一ATP酶调
节质子泵(Oecking等，1994)，调节植物代谢过程中
的关键酶(Bachmann等，1996；Toroser等，1998)，
如在氮代谢过程中，它可以改变 NR和谷氨酰胺合
成酶等的活性状态。
2．2硝酸还原酶活性状态转换的可能机制
有研究表明，NR可以在 MoCo区域与血红素
区域之间的铰链区域被磷酸化，从而产生了一个可
与 14-3-3s结合的位点(Bachmann等，1996)。当有
毫摩尔每升浓度级的游离 Mg抖存在时，l4—3—3s结
合到pNR上，使之失去活性。当没有Mg抖存在时
(加入 EDTA)，所有的 NR处于活性状态(i00 )，
当存在 Mg抖时，NR活性为实际活性状态 (x )。
NR活性状态的转换可以表示为图 2(Kaiser和 Hu—
ber，2001)。
2．2．1硝酸还原酶的磷酸化与去磷酸化 用阴离子
交换色谱分析菠菜的叶片提取液，可以测得数个
NR激酶 (PK)峰，这些激 酶可 以磷 酸化 NR 的
Sers 。位，并产生 14-3-3s结合位点。一种激酶是
SNFI相关酶(SnRK1)(Subden等，1999)，这种酶
本身可能被代谢物抑制。另外两种激酶属于CD—
PKs(Calcium-dependent protein kinases)。现在还
不清楚SNFI相关酶或 CDPKs是如何磷酸化 NR
或如何通过其它信号调控NR的，但暗中叶片细胞
内Ca抖浓度伴随 NR磷酸化、失活的同时而升高的
现象可能提供一条研究线索(Miller和 Sanders，
l987)。
pNR的去磷 酸化是 由磷酸酯酶 2A催化 的
(PP2A)，它主要存在于胞浆内，但现在对植物中该
酶的结构及组成所知不多，仅知道其作用于 pNR的
活性也受代谢物的调节。另有研究发现，去磷酸化
并非活化 NR的唯一途径 (Mackintosh和 Meek，
2001)，一些小分子，包括磷酸盐、EDTA和 AMP也
能活化 NR(Aguera等，1999；Kaiser等，1992)。而
l Moco
L_J U
r、＼ )l
， [／
Moco
14．3．3s
图 2 NR的活性状态及参与分子
Fig．2 NR activity state and the relevant molecules
PK催化 NR的磷酸化 ，PP催化 NR的去磷酸化。NR的
磷酸化状态并不失去活性，但由于 NR的磷酸化 ，
使得 14-3-3s能够在 Mg2 存在的条件下与
pNR结合，最终导致 NR的失活。
NR can be phosphorylated by PK and dephosphorylated
by PP．with the existence of Mg0 。14—3—3s can
combine with Phosphorylated NR．The
state of pNRl 14-3—3s has no activation．
14—3—3s与 pNR结合后会阻碍 pNR的去磷酸化，因
为 14—3—3s结合后的pNR的去磷酸化比pNR的去
磷酸化速度更缓慢 (Bachmann等，1996)。Bach—
mann等人认为 14—3—3s使NR的去磷酸化减缓的原
因是使 NO。‘的还原减慢，从而光合作用能够提供
NH 转化为氨基酸所需足够的碳骨架。还有人认
为 14—3—3s与NR结合后会稳定NR的磷酸化状态，
阻止去磷酸化。
蛋白激酶的作用与其底物 ATP水平有关，缺
氧条件下，组织中ATP水平下降，NR被活化，这可
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能是 NR磷酸酯酶的作用超过 NR激酶的作用
(Glaab和 Kaiser，1993)。总之，在一般情况下，蛋
白激酶和磷酸酯酶的共同作用使得 NR和 pNR处
于动态的平衡，该平衡会被外界因素快速地调节。
2．2．2 14—3—3蛋白与硝酸还原酶的结合 现在我们
已经清楚 14—3—3s在植物及真菌等生物体中起重要
的调节作用(Aitken，1996)。天然存在的 NR分子
与 14—3—3s结合的位点是在第一铰链 区域可被磷酸
化的Ser543附近的序列(Bachmann等，1996)。14—3—
3s与pNR结合后引起 NR失活的原因可能是使
NR的空间结构发生改变，进而导致 MoCo区域与
血红素区域间的电子传递无法进行(Kaiser和 Hu—
bet，2001)。Weiner和 Kaiser(1999)利用突变体的
研究发现，每个 NR分子可以与 2个 14-3-3s结合，
于是推测 NR分子上可能存在另外一个 14—3-3s结
合位点(Pigaglio等，1999；Weiner和 Kaiser，2001)，
14-3-3s与该位点结合的作用可能是稳定 NR的磷
酸化状态，另外还有研究证明除了 Ser 。位点，NR
的 N末端也参与了 14-3-3s的结合。
当有二价阳离子存在时，14-3-3s与磷酸化片段
的连接会得到促进(Athwal等，1998)。Provan等
发现，要想分离出 14—3—3s结合的烟草 pNR，必须要
有游离 Mg抖的存在(Sugden等，1999)，这进一步证
实了只有毫摩尔每升浓度级的游离 Mg抖时，14-3-
3s才会与 pNR结合并使之失活的说法。在光／暗
转换的条件下，Mg抖的存在会明显改变 NR活性。
Kaiser等(2001)推测金属阳离子在 NR活性调节中
可能起以下几个作用：(1)蛋白激酶本身是一个 Ca
离子依赖酶；(2)蛋白激酶的底物是 Mg抖-ATP；
(3)金属阳离子是使 pNR-14-3-3s复合体失活所必
需的。但至今仍不清楚金属阳离子是在 14-3-3s与
pNR结合中所必需的，还是 pNR-14-3-3s复合体失
活中所需的，或者起 到以上二者作用 (Weiner和
Kaiser，1999)。
由上文所述，NR的三种活性状态中只有 14—3—
3s结合 pNR态无活性，所以 14-3-3s的结合与否很
重要。有试验证明，营养条件、激素均可能对 14—3—
3s进行翻译后调节，从而改变 14-3-3s与 pNR的结
合比例，进一步调节 NR的活性(Maekintosh和
Meek，2001)。另外，14-3-3s是一类起广泛调节作
用的蛋白家族，pNR不是它们的唯一受体，细胞内
14-3-3s含量远高过 NR的量，二者要想结合，pNR
必须要和可与 14—3—3s结合的磷酸化片段竞争，该
竞争也在 NR的活化／去活化过程中起一定的调节
作用(Camoni等，1998)。
在 NR参与磷酸化失活的位点的研究中，早先
发现马铃薯 NR的 N一末端参与了该酶磷酸化失活
的过程。Pigaglio等(1999)发现 NR蛋白的 N一末端
氨基酸去除后，较野生型对热更为敏感，但是相应的
对黑暗条件下的磷酸化去活不敏感，而且缺失 N一末
端的突变体不会受光／暗交叉处理的影响。在菠菜
中，当蛋白质水解 NR使之失去前 45个氨基酸时，
NR活性不再因 14-3-3s的结合而失活尽管它仍会
被磷酸化。这表明，NR的 N一末端区域在一定程度
上参与其磷酸化失活的过程。Provan等的研究结
果与Pigaglio有所不同，在有 Mg抖和磷酸酯酶抑制
剂存在的条件下，NR与内生 14-3-3s通过层析可以
共分离。NR活性的测定与蛋白质杂交表明内生
14-3-3s可以与野生型 NR和突变体 NR共同分离。
突变体 NR的电子传递在亚铁血红素结合区域被
Mg抖／14-3-3s抑制，而在野生型NR中不存在这种
现象，这可能是 14—3—3s与野生型 NR和突变体 NR
的结合形式不同。而且认为 NR的不稳定性与钼喋
呤所在的部位有关，N末端的 56位氨基酸可能与钼
喋呤的稳定性有关(Bachmann等，1996)。
2．3蓖麻Ridnus communis中硝酸还原酶活性调节
就现研究的高等植物中，绝大部分 NR活性的
调节是通过 NR、磷酸化 NR、14-3-3s结合的磷酸化
NR三者之间的转换而实现的，但也有例外，Ricinus
communis的叶片和根中的 NR活性调节机制就与
其它高等植物不同。据 Kandlbinder等(2000)的研
究，在 pH7．6且有 5～10 mM Mg抖存在的条件下，
Ricinus的 NR活性极低，光下与暗中的差别也不
大，但在 EDTA存在的条件下，最大 NR活性是正
常的。但当调节 pH低于 7时，提取液中 NR活性
快速提高，调节 pH大于 7．3时，NR活性又变得极
低。其原因可能是在不同 pH值条件下，NR对
Mg抖的敏感度相差很大，在生理 pH值下，Ricinus
对 Mg抖较其它高等植物更敏感。
用免疫研究技术进一步研究蓖麻NR活性调节
的机制，发现其NR的Ser磷酸化位点和 14—3—3s结
合修饰是与其它植物相同的，所以关于RicinusNR
活性的调节机制仍然没有明确的答案。只是推测
NR分子上存在重金属离子结合位点，金属离子如
Zn抖的结合会引起 NR的失活(Campbel，1999)，
该结合位点的序列可能会发生改变，使得 M 亦
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4期 张 涛等：硝酸还原酶活性的调节及可能机制的研究进展 371
可与之结合，pH值的改变可能引起 NR重金属结
合位点序列发生改变，使得 NR对 Mg抖的敏感性
提高，从而调节酶的活化／失活。
3 硝酸还原酶的降解
NR的半衰期很短，仅为几小时，所以细胞 内
NR的含量不仅决定于 NR的合成速率，还决定于
NR的降解速率。光下 NR的合成高于暗中， S标
记的 NR在暗中的降解速率快于在光下(Weiner和
Kaiser，1999)。Kaiser和 Huber通过蛋白质杂交技
术发现，黑暗处理菠菜时，去磷酸化会减缓其叶片中
NR的降解。他们还发现，NR蛋白磷酸化酶不仅控
制NR的催化活性，而且是 NR降解过程中的信号，
磷酸化的 NR更易被降解。后来 ，有人月人工手段
使黑暗处理中的叶片 NR恢复活性后，发现 NR蛋
白量处于较稳定的状态，这表明非活性态的 NR比
有活性的NR更容易被降解(Kaiser等，1999)。由
此可以推测 NR降解的一个重要前提是 14-3-3s与
pNR的结合。Weiner等推测，14-3-3s在 NR的降
解过程中起到以下三点作用：(1)促进 NR的失活；
(2)阻止 pNR的分裂；(3)引发 NR的蛋白水解。
Cotele等(2000)却发现在缺少糖的情况下，
Arabidopsis的细胞内NR及其它蛋白失去了14-3-
3s的结合位点，如果按上述观点，则 NR实际活性
会增强，但事实与之相反，NR快速地被降解。于是
推测可能存在另一种完全不同的蛋白酶，它由于糖
缺乏而产生，其作用底物是未结合 14-3-3s的NR。
而在糖充分的条件下，并无上述情况发生。至今仍
不清楚细胞内高糖含量、高 NR活性状态、高 NR稳
定性之间是相互关联还是有因果关系。
4 结语
关于 NR活性调节的研究已由过去的生理水平
逐步深入到分子水平。随着研究的深入，人们发现
NR能催化数种反应。它催化 NO。一生成的 NO在
植物体内可能起一定的信号作用，但此反应受哪些
内外条件的调节，生成的No在植物体内又如何起
作用，其作用是在特定条件下产生还是一直有产生，
这些将是今后研究的一个重点。另外，尽管对 NR
的翻译后调节已经有一定程度的了解，但仍有许多
问题要解决：影响 NR活性的因素是否能够调节
NR降解酶、是否与 NR的降解有直接关系，NR降
解过程中是否还有其他一些物质起作用。影响 NR
活性的因素中，光是如何起作用的，其作用是直接的
还是间接的，与糖含量有无关联。我们发现干旱、氮
素浓度的高低对 NR活性有着很大的影响(待发)，
这种影响是直接的还是间接的还有待进一步研究。
在 NR翻译后调节过程中，14-3-3s本身的调节机制
与其和pNR的结合有何联系，pNR和其他磷酸化
片段与 14-3-3s结合的竞争机制如何。重金属离子
在NR活性调节过程中起何种作用等等。虽然仍有
很多问题需要解决，但随着多种突变体的得到，分子
生物学技术及免疫技术的深入应用，又将使 NR的
研究进入一个全新的领域。
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