全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(6)：628— 630 2006年 11月
长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生
曾建军1，肖宜安1，孙 敏2
(1．井冈山学院 生命科学学院，江西 吉安 343009；2．西南师范大学 生命科学学院 ，重庆 400715)
摘 要 ：以长柄双花木当年生嫩梢上的叶柄、嫩茎、嫩叶为外植体，对影响长柄双花木愈伤组织诱导和继代、分
化主要因素进行研究 。结果表明：在培养基 MS+NAA 0．5 mg／L+2，4-D 2．0 mg／L上 ，三种外植体均可诱导出
愈伤组织，其中叶片愈伤组织诱导率最高。该培养基还可作为愈伤组织继代培养基，但继代培养周期不超过 2
周。愈伤组织接种在 MS+BA 2 mg／L上分化不定芽，根的诱导在 1／2MS+IBA 0．5 mg／L培养基上进行。
关键词 ：长柄双花木；愈伤组织 ；诱导 ；继代培养
中图分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：i000—3142(2OO6)O6—0628—03
Callus induction and plant regeneration 0f
Disanthus cercidifolius var．1ongipes
ZENG Jian-j un1，XIAO Yi—an1，SUN Min2
(1．College of Biology，Jinggangshan College，Ji’an 343009，China；2．College of Li
Sciences，Southwest China Normal University，Chongqing 400715，China)
Abstract：The stems，leaves and petioles explants from Disanthus cercidifolius Maxim．var．1ongipes H．T．
Chang were cultured on M S medium with BA，NAA，2，4-D，IBA of different concentration tO induce regenera—
tion plant．The results indicated that leaf was the best explant for calus induction，and the best suitable medi—
um was MS+NAA 0．5 mg／L+2，4-D 2．0 mg／L，it also could be used as the medium for callus subculture．
MS medium only supplemented with BA mg／L could obtain higher frequency of differentiation．When studying
root regeneration culture，1／2MS medium supplemented with IBA 0．5 mg／L had better root regeneration．
Key words：Disanthus cercidifolius var．1ongipes；callus；induction；subculture
长柄 双花木 (Disanthus cercidifolius Maxim．
var．1ongipes H．T．Chang)为金缕梅科双花木属
(Disanthus)，我国特有种。仅零星分布于湖南、江
西和浙江等省的部分县 ，分布区局限 ，且个体数量稀
少 ，每年形成的种子数 量少 ，目前 已处 于濒危状态，
被列为国家二级重点保护的濒危物种(傅立 国，
1992)。有文献报道了长柄双花木的形态、数量及林
学特征(李根有等，2002；肖宜安等，2002)，而利用现
代生物技术对其种质资源保护尚未见报道。我们利
用组织培养对长柄双花木的愈伤组织诱导及继代培
养、植株再生进行了初步研究，旨在比较不同培养基
和外植体对长柄双花木愈伤组织诱导率的影响，选
出利于长柄双花木愈伤组织诱导和生长、植株再生
的最佳培养基，以期对长柄双花木保护生物学、引种
驯化及育种提供理论和工作基础 。
1 材料与方法
1．1材料
长柄双花木采自井冈山国家自然保护区内。
收稿 日期：2005—03—14 修回 日期：2005一lO一20
基金项目：江西教育厅科技项 目(赣教[z005Jz3z)；国家 自然科学基金(30560025)资助[Supported by Science and Teehnology
Foundation of Education Department of Jiangxi Province([2005]232)；the National Natural Science Foundation of chjna(3o56oo25)]
作者简介：曾建军(1973一)，女，江西井冈山人，硕士．讲师，主要从事植物生物技术研究。
’通讯作者(Author for correspondence，E-mail：whooi@sina．com)
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6期 曾建军等：长柄双花木愈伤组织诱导及植株再生 629
1．2试验方法
基本培养基为 MS，蔗糖为 30 g／L，另加 8 g／L
琼脂进行固化。根据不同培养阶段附加不同激素，
灭菌前将 pH调至5．8。每种外植体接种 5瓶，每瓶
6个外植体，培养温度 25士2℃，每天连续光照 1O
h，光照度 1 000 lx。
选取当年萌发嫩茎、叶柄剪成 0．5 cm长、嫩叶
剪成 0．5～1 cm见方小块，置于自来水中冲洗干净，
1 洗衣粉浸泡 30 rain，流水冲洗 2 h。无菌条件下
7O 9，6的酒精表面消毒 3O S，无菌水冲洗一遍。再用
0．1 升汞对侧芽、嫩叶、嫩茎分别消毒 3、4、5、8、10
rain，然后进行培养。无菌水冲洗 8次，一周后统计
污染率。
愈伤组织诱导：三种外植体分别接种到 l～13号
不同培养基中；愈伤组织继代培养：将生长良好、质地
疏松的愈伤组织接种到 2、3、6、12号四种培养基中，
培养20 d后，按下式计算褐化率：褐化率=褐化愈伤
组织的块数／接种愈伤组织块数×100 9，6(表 1)。
愈伤组织再分化及生根培养：将经继代培养得
到的愈伤组织置于表 4分化培养基上，分化的不定
芽移至生根培养基 ：1／2MS+IBA 0．5 mg／L。
2 结果与分析
2．1消毒剂与消毒时间
结果分析表明，不同外植体对 0．1 9，5升汞敏感
性不同。侧芽消毒 8 rain、嫩叶 4 rain、嫩茎 6 rain
时，外植体的杀伤程度和灭菌程度综合效果最好，污
染率最小，成活率最高，消毒时间过长导致外植体在
培养中褪绿死亡，尤其是嫩叶应严格控制消毒时间。
2．2愈伤组织的诱导
2．2．1不同激素种类对叶片愈伤组织诱导的效应
将无菌叶片接种到表 l不同培养基中诱导愈伤
组织 。接种约 1O～15 d，除 4、13号培养基外 ，其 它
培养基上的外植体切口处膨大，开始形成愈伤组织。
叶片切口处初始分化的愈伤组织为黄绿色颗粒状，
随后逐渐长成黄白色较大颗粒状(图版 I：1)。培养
基激素组合与浓度配比不同，对叶片愈伤组织的诱
导效果有较大差异，由表 l可见，当NAA 0．5 mg／L
和2，4一D 2．0 mg／L配合使用时，叶片愈伤组织诱导
率为 100 ，并且生长迅速，质地疏松。与之相比，
添加了 BA的培养基上诱导的愈伤组织有致密和疏
松二种，在这种培养基上长期培养愈伤组织易导致
其结团、质地不够松散，不利于增殖。
2．2．2不同外植体愈伤组织的诱导 将消毒叶柄、
嫩茎、嫩叶接种到 MS+NAA 0．5 mg／L-4-2，4-D
2．0 mg／L培养(表 2)。培养 12 d后茎段及腋芽切
口处逐渐诱导出黄白色、颗粒状愈伤组织，叶片切口
尤其是叶脉明显膨大，15 d后所有外植体均诱导分化
出愈伤组织，其中叶片四个切面均能诱导出黄绿色和
黄白色愈伤组织，愈伤组织生长良好。因此，我们认
为叶片为长柄双花木愈伤组织诱导最佳外植体。
表 1 不同激素浓度对叶片愈伤组织诱导的影响
Table】 CaIlUs indUCtio1 with various concentrations
of hormones from Ieaves
0．1
0．2
0．5
0．1
0．2
0．5
0．05
0．2
0．5
0．05
0．2
0．5
O．5
2．3不同植物生长调节剂对长柄双花木愈伤组织继
代培养的影响
愈伤组织接种到 2、3、6、12号四种培养基 。在
培养初期，四种培养基上培养的愈伤组织都有较显
著的增殖。20 d后结果分析表明(表 3)，在附加 2．0
mg／L 2，4-D培养基上，愈伤组织增殖最明显，呈乳
白色、疏松、颗粒状，将近 1／3出现轻微褐化。与之
相比，添加 了 BA 的培 养基上 ，虽然 随 BA 浓度升
高，愈伤组织增殖率也逐渐增高，但增殖的愈伤组织
质地不同，有致密和疏松两种，褐化现象随BA浓度
增高也更明显。根据愈伤组织增殖率和褐化情况不
同，选用附加 2，4-D 2．0 mg／L和 NAA 0．5 mg／L
的培养基作为愈伤组织继代培养培养基，培养周期
不超过 2周可避免褐化现象，数月后得到生长旺盛、
疏松、乳白色的愈伤组织(图版 I：2)。
2．4愈伤组织再分化和不定芽生根培养
在含有 BA的培养基上，继代培养得到的愈伤
组织均能分化出不定芽(表 4)，其中在仅含 BA 2．0
口：Ⅺ O O ■ 6 ■ ， 硒 船 ¨ ∞ 8 7 他 7 8
船 ；S ；S∞
5 0 0 5 O O
L O O O L O O O O
5 5 5 O O O O O O O
O O O 1 1 1 2 2 2 5
1 2 3 4 5 6 7 8 9 m n n
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630 广 西 植 物 26卷
I一 1
表 2 不同外檀体愈伤组织的诱导
Tab【e 2 Caltus induction。f different explal~ts
注 “+ ’少揖 ； +T”较好 - +十十 最 好。下 同
N。【e -+，a litt Le； q-L”h~ter；‘H 一”the best．The m。b山 w
表 3 不同激素配比对愈伤组织继代培养的影响
Tahle 3 Efect 0f various gro,a,th
regulators。n calus subcu[ture
表巾数据为 20 d后测定 站粜 The data⋯ n_ens,~ated after∞ 山
mg／L培养基上不定芽分化频率最高 在同时添加
NAA的分化培养基上，大部分愈伤组织分化出的
是单苗。将分化的不定芽印下，继续培养在相同培
I羽 9 1广_— I『—
养基上扩繁；结果表明在含 NAA的培养基上，不
定芽基部困分化出大量愈伤组织抑制了其增殖一而
仅含BA的培养基上不定芽增殖倍率为4～7倍，且
分 化的不定芽生长健壮 。待不定芽 长至 2 cm左右 ，
接种在生根培养基上，20 d后不定芽基部分化 2～3
根不定根(翻版 1：4)
表4 不同激素配比对愈伤组织分化培养的影响
Fig d Efleet 0 various gro,．~,lh regulators
DFI ca【Ius differentiation
培养基成分tmg-I．
Supplem enl s lo M S
)
．
愈伤戢
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再生斑伤数
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3 讨论
本试验利用长牺双花东叶柄、嫩茎、嫩叶为外植
tgN~TN体培养再生体系 三种外植体中，叶片
更容易脱分化形成愈伤组织。通过对长柄积花术外
(下转第 601页 Conlinue on page 601)
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(上接第 630页 Continue from page 630)
植体叶片愈伤组织诱导、继代及再分化培养条件探
究，得到以下结论：愈伤组织诱导和继代最佳培养基
为 MIS_+NAA 0．5 mg／L+2，4一D 2．0 mg／L，在仅含
BA的 MS培养基上，愈伤组织分化大量健壮不定芽，
1／2MS+0．5 mg／L IBA培养基有利不定芽生根。
在诱导叶片愈伤组织实验中发现，较高浓度的
生长素有利于愈伤组织诱导。许多研究表明2，4一D
对外植体脱分化启动效果最好，我们也有相同的结
论，但许多文献报道，连续使用易使愈伤组织褐化。
本试验结果表明，将诱导分化的长柄双花木愈伤组
织接种在含 2，4一D培养基上继代培养，愈伤组织增
殖率最高，增殖的愈伤组织每 2O天继代一次可避免
褐化现象。
长柄双花木外植体在添加 NAA培养基中极易
诱导分化出愈伤组织，不利于愈伤组织分化，推测与
长柄双花木外植体本身内源 NAA含量高有关，因
此在不定芽增殖和诱导不定根时应避免使用NAA。
在离体再生培养过程中，不定芽和再生植株生长非
常缓慢，今后还需探索各种培养条件以促进长柄双
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