全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(4)：357— 363 2002 年 7月
一 种新的抗真菌几丁质酶基因的分离及
其植物表达载体的构建
陈崇顺 。，斯琴 巴拉。，
(1．南京师范大学生命科学学院分子医学生物技术实验室，江苏南京 210097；2．南京农业大学 园艺
学院，江苏南京 210095；3．南京农业大学理学院 ，江苏南京 210095)
摘 要 ：以西瓜尖镰孢菌诱导、提纯的豇豆抗真菌 I类几丁质酶 N端前 10个氨基酸序列测定的基础上 ．设计
合成了引物 ，运用 PCR等分子生物学技术．从豇豆基因组 中分离克隆了该特异几丁质酶成熟蛋白基因 ．测定
分析 了其全序列。该新基因全长 894 bp．无内含子；具 Aat I、Aat II、Bgl I、Dpn I、Dpn II、EcoR II、Hae I、Hae II、
Hae III、Hinf I、Hpa II、Mac II、Mac III、Nba I、Oxa I和 Sst IV 酶切位点 43个；豇豆、Vigna unguiculata、菜豆、
豌豆、烟草、小麦、水稻的同源性依次递减 。扩增克隆 了菜 豆几丁质酶信号肽基因，并将其与豇豆几丁质酶成
熟蛋白基因连接 ，再与 pBI 121重组．成功构建 了特异几丁质酶基 因的植物表达载体 ．为进一步培育抗真菌病
转基因西瓜新品种打下了坚实基础 。
关键词：抗真菌 ；几 丁质酶 ；基 因分离 ；基 因克隆；基因序列分析 ；植物表达载体构建
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2002)04—0375—07
Isol ation of a novel gene encoding the chitinase
．
with antifungal activity and construction
of the pl ant expression vector
CHEN Chong—shun · ．Si—qin—ba—la。·
(1．Molecular＆Medical Biotechnology laboratory，College of Life Sciehces。Nanj&g Nmmal University．
Nanjing 210097·China；2．Colege of Horth：ulture。Nanj&g Agricultural University。Nanjing 210095，
China；3．College of Sciowes，Nanjing Agricultural UniversRy，Nanjing 210095。China)
Abstract：On the basis of the sequence of the first ten N—terminal amino acids from the Vigna sesquipedalis anti—
fungal chitinase Class I，induced with Fusarium oxysporum f．niveum ．purified and determined by our laboratory．
certain primers for PCR had been designed and synthesized．With PCR and other techniques used in molecular
biology，the gene encoding the specific chitinase mature protein was isolated from V．sesquipedahs genome，trans—
ferred into Escherichia coli and cloned．And the complete sequence for the specific gene was analyzed
． The full
length of the novel gene covers 894 bp，and there are no introns in it．It contains 43 restriction sites for Aat I，
Aat II，Bgl I，Dpn I，Dpn II，EcoR II，Hae I．Hae II，Hae III，Hinf I，Hpa II，Mae II，Mac III．Nba I，Oxa I and Sst
IV．The sequence homology for the chitinase(Class I)mature protein genes between V．sesquipedalis and V． f 一
guiculata．Phaseolus wdgaris，Pisum sativum ，Nicotiana tabacum，Triticum aestivum and Oryza sativa is decreased
收稿 日期 ；2001—08—17
作者简介：陈崇顺(1958一)．男 ．江苏江都市人，生物学博士，主要从事生物工程及分子生物学等方面的研究与教学 。同为第一作者 。
基金项 目：国家 自然科学基金资助项 目(39670515)
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358 广 西 植 物 22卷
respectively．Equally，the Phaseolus vulgaris chitinase signal peptide gene was amplified and cloned，and com—
bined with the V．sesquipedalis chitinase mature protein gene，and further recombined with pBI 121 vector．Fi—
naly．the plant expression vector with the specific chitinase gene was successfully constructed，which enables re—
searchers tO create novel antifungal germ plasm by transferring the recombined gene encoding the specific chiti—
nase into CitruU螂 lanatus．
Key words：antifungi；chitinase；gene isolation；gene cloning；gene sequence analysis；construction of plant ex—
pression vector
几丁质酶(EC 3．2．1．14)是一种以几丁质 (聚
乙酰氨基葡萄糖)为底物的水解酶。植物几丁质酶
具有抑制真菌菌丝生长和孢子萌发、释放信号分
子、参与发育调控、参与共生固氮调控、抑制细菌生
长和虫类消化及发育等生物功能“ 。然而 ，就抑菌
作用而言，几丁质酶似乎只对一部分真菌(尤其是
绿木霉、立枯丝核菌和一些镰刀菌)具有抑菌活性，
而对另一些真菌无效或结果不一。 。同时 ，并非所有
几丁质酶都有抗真菌活性“ 。因此，为了充分发挥作
为 目的基因 的几 丁质 酶基 因在抗真菌病 基 因工程
中的作 用，在分 离、克 隆、制备该 目的基 因前 ，首先
必须 了解其 编码 的几 丁质 酶的抗真菌 活性及其 它
相关特性。本研究室率先开展了豇豆几丁质酶抗西
瓜枯萎病基因工程的研究。笔者首先从豇豆幼苗中
诱导、纯化出了一种对 Fusarium oxysporum等指示
真菌具强抑制作用的新的几丁质酶 ，并研究了该
酶的等电点、分子量以及 N端氨基酸序列等重要的
生化特性”m。本论文所报告的是在前期工作 的基础
上进行的该抗真菌几丁质酶新基因的分离克隆、序
列分析及其植物表达载体的构建。具体在本研究室
以西瓜尖镰孢菌诱导表达的豇豆特异几丁质酶 N
端氨基酸序列测定的基础上，设计、合成了有关引
物 ，从豇 豆基 因组 中分离 、克隆 了该特异 几丁质 酶
成熟 蛋白基 因，测定、分析 了该基因的全序列 ；同时
分离、克隆了菜豆几丁质酶信号肽基因，并将其与
上述豇豆特异几丁质酶成熟蛋白基因拼接，进而将
此两种基因嵌合体与双元载体重组，构建了该特异
几丁质酶基因的植物表达载体，为进一步开展培育
抗真菌病的转基因西瓜新品种等基因工程研究打
下坚实基础 。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1 植 物 材 料 “早 熟 二 号 ”豇 豆 (Vig．a
sesquipedalis)种子 (江西省赣州 地 区群力种子公 司
产品)；“长白七号”菜豆(Phaseolus vulgarL~)种子(江
苏省扬州市蔬菜种子公司产品)。
1．1．2引物 扩增豇豆几丁质酶成熟蛋 白基因的引
物：根据本研究室诱导、纯化、测定的“早熟二号”豇
豆特异几丁质酶 N端前 10个 氨基酸序列 和 Gen—
Bank中检索到的豇豆属植物(vig71a unguiculata)的
3’端核苷酸序列设计，P1(Vs)：5’gaa ttc gag cag
tgt gga agc caa gcg ggg ggt gc 3’；P2(Vs)：5’gga tcc
tca gac gat ggg atg gag att 3’。扩增菜豆几丁质酶信
号肽基 因的引物 ：根据菜豆几丁质酶基因。 设计 ，P1
(Pv)：5’tct aga atg aag aag aat agg at 3’；P2(Pv)：
5’gaa ttc tcc gta gct tcc tcc aac 3’。以上引物由宝生
物工程(大连)有限公司合成。
1．1．3菌株 和质粒 pMD18一T Vector，购 于宝生物
工程(大连)有限公 司；pcDNA3．1(+)，购于博彩公
司；pBI 121由中科院遗传所植物生物技术开放实验
室翟文学副研究员惠赠 ；JM109由南京农业大学动
物传染病组惠赠；大肠杆菌 DH5a、TGI由南京农业
大学动物传染病组戴亚斌博士惠赠。
1．1．4主要酶类和生化试剂 Taq DNA聚合酶，购
于上海生工生物工程有限公司 ；T4 DNA连接酶、限
制性 内切 酶、dNTP Mixture、DI 2000 DNA Marker
等购 于宝生物工程 (大连)有限公司 ；DNA快速纯化
回收试剂盒 ，购于博大科技公司 。
1．1．5序列分析软件 Goldenkey、Dnastar序列分析
软件由中国农业大学张曼夫教授惠赠。
1．2方法
1．2．1植物材料的培养 参照文献㈤。
1．2．2豇豆、菜豆DNA的提取 参考文献“”。
1．2．3豇豆几丁质酶成熟蛋 白基 因和菜豆 几丁质酶
信号肽基 因的 PCR扩增 豇豆几丁质酶基因扩增 ：
根据优化条件，在 PCR反应 管内依次加入 10×
PCR缓 冲液 10 I ，MgC1：1．5 mmol／I ，dNTP各
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4期 陈崇顺等：一种新的抗真菌几丁质酶基因的分离及其植物表达载体的构建 359
0．2 mmol／I ，引物 Pl(Vs)和 P2(Vs)各 0．2 p-mol／
I ，豇豆 DNA5．5 I ，加 入灭 菌纯水 至 终 体 积 100
I ；反应条件为：在 97 oC预变性 10 rain后，加入 5
U L Taq DNA聚合酶 0．5 I ，94。C变性 1 rain，
55。C复性 1 rain，72。C延伸1 rain，循环 35次。菜豆
几丁质酶基因扩增：参照豇豆几丁质酶基因扩增，
但其引物为 P1(Pv)和 P2(Pv)；反应条件为：97 oC
预 变性 10 rain后加 入 5 U I Taq DNA 聚合 酶
0．5 I ，94。C变性 1 rain，55。C复性 30 S，72。C延
伸 30 S，循环 40次。
1．2．4 PCR产物的克隆 豇豆几丁质酶成熟蛋 白基
因 和菜 豆几 丁质 酶信号 肽 基 因 PCR 扩增 产 物用
DNA快速纯化回收试剂盒回收，方法参照纯化回收
试剂盒说明书。回收产物分别利用 EcoR I和BamH
I及 Xba I和 EcoR I酶切位点与 pMD18一T载体连
接重组，方法参照 T载体使用说明书。大肠杆菌
JMlO9感受态细胞的制备 、重组体的转 化及转化体
的检测方法参考文献“”。
1．2．5基因序列测定 在宝生物工程 (大连 )有限公
司进行。具体测序方法参照文献“”。
1．2．6序列分析 用 Goldenkey软件对所测得 的豇
豆几丁质酶成熟蛋 白基因序列进行 酶切位点分析 ，
并将该序列与从 NCBI的GenBank中检索到的 ．
unguwu~ta、菜豆、豌豆 (P~um sativum)、烟草 (Nico-
tiana tabacum)、小 麦 (Triticum aestivum)、水 稻 (O—
ryza sativa)等植物的 I类几丁质酶成熟蛋 白的基因
序列进行比较，并用 Dnastar等分析其基因序列的
同源性。
1．2．7植物表达栽体的构建 分别利用 PCR扩增
产 物菜豆几 丁质酶信号 肽基 因的 Xba I和 EcoR I
及豇豆几丁质酶成熟蛋白基因的EcoR I和 BamH I
酶切位点，将两基因片段连接重组进 pBI 121‘质粒
的 Xba I和 BamH I位点，进而构建成植物表达载
体。具体构建方法参照文献(123。
2 结果与分析
2．1豇豆几_丁质酶成熟蛋 白基因序列和菜豆几 丁质
酶信号肽基因序列的 PCR扩增
在优化反应条件的基础上，以 P1(Vs)和 P2
(Vs)及 P1(Pv)和 P2(Pv)为引物 ，分别进行 了豇豆
几丁质酶成熟蛋白基因和菜豆几丁质酶信号肽基
殷 的 PCR扩增 ，分别 获得 了 900 bp左右 的成熟蛋
白基因的特异条带(图 1)和 90 bp左右的信号肽基
因的特异条带(图 2)。
1 M 2
一
图 1 豇豆几丁质酶成熟蛋白基因的 PCR产物
Fig．1 PCR products of the chitinase mature
protein gene from V．sesquipedalis
1．2：分别为来自豇豆种子DNA和来自豇豆营养器官 DNA的
PCR产物；M：DNA 分子 量标准 DL2000．从上 至下 (bp)：
2000·l000．750·500．250·l00。1．2：PCR products from the
seed DNA ．and from the vegetative organ DNA．respectively；
M ：DNA marker DL2000．from up to down(bp)：2000．1 000．
750．500·250．100． 1 M
图 2 菜豆几丁质酶信号肽基因的 PCR产物
Fig．2 PCR product of the chitinase signal
peptide gene from P．vulgaris
l：信号肽基因的 PCR产物；M：DNA分子量标准 DL2000．从
上至下(bp)：2000，l000．750．500，250．100。l：PCR product
of the signal peptide gene；M ：DNA marker DL2000，from up
to down(bp)：2000，l000．750，500．250．100．
2．2豇豆几丁质酶成熟蛋 白基 因和菜豆几丁质酶信
号肽基因的克隆及其鉴定
挑选阳性克隆进行限制酶切分析鉴定。豇豆几
丁质酶成熟蛋白基因重组转化阳性克隆(pMD18一
T一成熟蛋 白基 因)用 EcoR I和 BamH I双酶切 ，结
果得到分子量为 900 bp和 2 500 bp左右的两条电
泳条带(图 3)；菜豆几丁质酶信号肽基因重组转化
阳性克隆(pMD18一T一信号肽基因)用 Xba I和EcoR
I双酶切 ，结果得到分子量为 90 bp和 2 500 bp左
右的两条电泳条带(图 4)。
2．3克隆基因的序列测定
该从豇豆基因组 PCR扩增分离到的特异抗真
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360 广 西 植 物 22卷
图 3 EcoR I和 BamH I双酶切 pMD18一T一豇豆
几丁质酶成熟蛋 白基 因‘
Fig．3 pMD 1 8-T-mature protein gene for
the chitinase from V．sesquipedalis
digested by EcoR I and BamH I
l：酶切结果。从上至下：第一条带为 T载体；第二条带为成熟
蛋白基因M：DNA分子量标准 DL2000．从上至下(bp)：2000，
l000． 750，500。250。lOO。 l：digestion result． from up to
down：the first band is T—vector；the second band is mature pro—
tein gene：M ：DNA marker DL2000，from up tO down (bp)：
2000 1000 75O．500．25O 100．
图 4 Xba I和 EcoR I双酶切 pMD 18一T一菜豆
几丁质酶信号肽基因
Fig 4 pMD 18一T—signal peptide gene for the chitinase
from P．vulgaris digested bv Xba I and ECOR I
l：对照(Xba I和 EcoR I酶切的T载体)；2：酶切结果。从上至
下：第一条带为 T载体；第二条带为信号肽基因；M：DNA分子
量 标 准 DL2000 从 上至 下 (bp)：2000，l000．750，500．250．
1OO。 l：Control(T—vector digested by Xba I and EcoR I)；2：di—
gestion result．from up to down：the first band is T—vector；the
second band is signal peptide gene；M ：DNA marker DL2000
from up to down (bD)：2000．1000，750 500，250．100．
菌 I类几 丁质酶成熟 蛋 白新基 因的序列 测定结果
(已在 GenBank登 录 ，Accession：AF307511)(图 5)
表明，该基因长 894 bp。经与其它相关基因序列 比较
分析及根据笔者对该基因所编码的几丁质酶蛋 白
分子量的测定结果 (33 kD) 可推测 ，该基 因没有内
含子 。
从菜豆基因组 PCR扩增分离到的抗真菌 I类
几丁质酶信号肽基因的序列测定结果与文献(93所
报 告的相 同，具体 为：5’ATG AAG AAG AAT
AGG ATG ATG ATT ATG ATA TGC AGT GTA
GGA GTG GTG TGG ATG CTG TTA GTT GGA
GGA AGC TAC GGA 3’。
2．4克隆基因的序列分析
2．4．1酶切位点分析 用 Goldenkey软件对上述豇
豆几丁质酶成熟蛋白基因序列酶切位点分析结果
表明，该基因序列上具 43个限制性内切酶酶切位点
(数字为开始碱基位置)：Aat I：735；Aat I：643；Bgl
I：247；Dpn I：139，306，483，543，556，805；Dpn II：
139，306，483，543，556，805；ECOR II：37，158，251，
494，700，738；Hae I：456，735；Hae II：145，415；Hae
III：162，312，353，457，736；Hinf I：663；Hpa II：127，
278，344，364，689；Mae II：328，644；Mae III：386，
715；Nba I：126；Oxa I：265；Sst IV ：542。
2．4．2与几种主要植物 I类几丁质酶成熟蛋白基 因
序列的同源性 分析 用 Dnastar软件对上述测得的
豇豆 I类几丁质酶成熟蛋 白基因序列与从 NCBI的
GenBank中检 索 到 的 Vig,a unguiculata、菜 豆 、豌
豆、烟草、小麦、水稻等植物 的 I类几 丁质 酶成熟蛋
白的基因序列进行同源性 比较分析的结果 (表 1)表
明，豇豆与 Vigna unguiculata两者之间的 同一性最
高(98．3 )，而烟草 与水稻两者之间的同一性 最低
(44．3 )，其它彼此之间 的同一性则介于上述二者
之间。该分析结果在一定程度上反映了上述各植物
种间的系统进化亲缘关系 ；上述六种植物按 与豇豆
亲缘 关系 由近 及 远 的排列顺 序 依次 为 ：Vigna Un—
guiculata、菜豆、豌豆、烟草、小麦、水稻。
2．5植物表达载体 的构建及其鉴定
分别利用 PCR扩增产物菜豆几丁质酶信号肽
基因的 Xba I和 EcoR I及豇豆几丁质酶成熟 蛋 白
基因的EcoR I和 BamH I酶切位点，将两基因片段
连接重组进 pBI 121质粒的Xba I和 BamH I位点，
进而构建成植物表达载体。用Xba I和BamH I双酶
切该重组表达载体，得到 1 kb左右片段；而同样用
Xba I和 BamH I双酶切对照 pBI 121载体 ，则没有
该片段(图 6)。该酶切结果表明了菜豆几丁质酶信
号肽基 因与豇豆几 丁质 酶成熟蛋 白基 因组 成的几
丁质酶嵌合基因植物表达载体的构建成功。该植物
表达载体部分序列测定结果进一步证明了这一点。
3 讨 论
3．1植物材料总 DNA的提取
笔者预备性试验结果表明，以豇豆(菜豆)营养
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4期 陈崇顺等：一种新的抗真菌几丁质酶基因的分离及其植物表达载体的构建 361
器官(例 如：根 、茎、叶)和种子分别为试材提取的总
DNA作为模板进行 PCR扩增的效果基本相同。由
于一般豆科种子蛋白含量较高，在以其为试材提取
总 DNA时，用酚 ：氯仿 ：异戊醇(25：24：1)抽提
5～6次后仍含有蛋白；而以营养器官为试材，用相
同试剂抽提 1次即可将蛋白完全抽提干净，因此如
果时间允许 的话 ，那么最好待豆种发芽后 以营养器
官为试材提取总 DNA。这样 ，既简化提取过程又节
省试剂 。
3．2完整目的基因的重组及其植物表达载体的构建
本研究用于构建植物表达载体的完整 目的基
因为菜豆几丁质酶信号肽基因和豇豆几丁质酶成
熟蛋白基因连接成的嵌合基因。用嵌合基因作为目
的基因的考虑主要基于以下几点：(1)在遗传信息
1 GAGCAGTGTG GAAGCCAAGC GGGGGGTGCG CTGTGTCCAG GGGGTCTCTG TTGCAGTCAG TTCGGGTGGT 70
71 GCGGCTCCAC CGACGACTAC TGCGGCAAGG GTTGCCAGAG CCAGTGCGGG GGACAGCCGG CTCCGTCTGA 1 40
141 TCTCAGCGCT CTGATACCCA GGGCCACCTT CGACCAGATG CTCAAACATC GCAACGACGG AGCCTGCCCA 210
21 1 GCCAGAGGCT TCTACACCTA CGATGCCTTC ATCGCCGCCG CCAGGGCTTT CCCCAGCTTC GGCAACACCG 28O
281 GAGACACAGC CACTCGAAAG AGAGAGATCG CGGCCTTCTT GGGGCAAACG TCTCACGAAA CAACCGGGGG 350
351 ATGGCCCTCT GCACCGGACG GACCATACGC ATGGGGTTAC TGCTTCGTGA GAGAGCAGAA CCCAAGCGCC 420
421 TACTGCTCCC CAACCCCCCA GTTCCCCTGC GCTTCTGGCC AGCAATACTA TGGCAGGGGT CCGATCCAGA 490
491 TATCCTGGAA CTACAACTAC GGTCAGTGCG GAAATGCAAT TGGAGTGGAT TTGATCAACA ACCCTGATCT 560
561 CGTCGCCACC GACCCCGTCG TCTCCTTCAA GTCCGCCATC TGGTTCTGGA TGACCCCGCA GTCCCCCAAG 630
631 CCTTCCTCCC ACGACGTCAT CACCTCTCAG TGGACTCCCT CCGCCGCCGA TGTCGCCGCC GGGAGGCTTC 700
701 CAGGCTACGG CACTGTGACG AACATCATCA ACGGAGGCCT GGAGTGCGGC AGAGGACAGG ATAGCAGGGT 770
771 GGAGGACCGC ATCGGGTTCT TCAAGCGATA CTGTGATCTG TTTGGAGTTG GTTATGGCAA CAACCTTGAC 840
841 TGCTACTCTC AGGCCCCATT TGGAAATTCC CTGCTTAATC TCCATCCCAT CGTC 一 910
图 5 豇豆 I类几丁质酶成熟蛋白新基因的全序列
Fig．5 Complete sequence of a novel gene encoding the chitinase(Class I)mature protein from V．sesquipedalis
表 1 七种植物 I类几丁质酶成熟蛋白基因的序列同源性分析
Table 1 Sequence identity analysis for the chitinase(Class I)mature protein genes from seven species of plants( )
种类 Species V．sesquipedalis V．unguiculata P．vulgaris P．sath，urn N．tabacum T．aestivum 0．sativa
传递过程中，所形成的初级转译产物多以前体蛋白
质的形式存在，一般不具有正常的生物学功能。该
初级转译产物通常还需经过加工修饰 以及正确折
叠才能成为具有正常功能活性的成熟蛋白质。在此
过程中，前体蛋 白质 N端的信号肽是相当重要的，
因其与蛋白质的转运、定位和分泌有关。”。而直接
根据提纯的豇豆几丁质酶 N端前 10个氨基酸序列
和 Vigna unguiculata的 I类几丁质酶C端氨基酸序
列设计引物，PCR扩增分离到的基因仅为几丁质酶
成熟蛋白基因，缺少信号肽序列。(2)本研究所分离
的豇豆几丁质酶基 因是未知新基 因，只有本研究室
诱导、纯化、测定的其特异成熟蛋白N端前 10个氨
基酸序列是已知的。理论上，可以根据这段已知序
列设计引物用 cDNA末端快速扩增技术(RACE)等
方法扩增 出 目的基 因的上游片段 。然而，要成功地
应用该技术是很困难的，因为该技术涉及三个连续
的酶促反应步骤(逆转录、末端脱氧核苷酸转移加
同聚尾及 PCR)，每一步骤都有可能失败；再者即使
三个 酶促反应都能顺 利进 行，也常常会产生大量的
非特异性或截短的产物“ 。(3)信号肽引导外源成
熟蛋 白质 的转运、定位和分泌在 原核表达 系统 中已
被普遍采用，例如：以来 自大肠杆菌分泌蛋白(外膜
蛋白)基因序列作为信号肽编码序列构建了分泌型
表达载体“”。研究人员将人、鼠、酵母等真核来源信
号肽与原核信号肽在引导异源蛋白质在大肠杆菌
原核系统中转运、定位和分泌等方面的能力作了比
较。研究结果表 明，编码 区密码子经优化后 的真核
信号肽也能非常有效地发挥其正常的生物学功
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图 6 Xba I和 BamH I双酶切的几丁质酶植物表达
载体(pBI 121一信号肽基 因一成熟蛋白基因)
Fig．6 Plant expression vector(pBI 121一signal peptide
gene—mature protein gene for the chitinase)
digested by XbaI and BamHI
1：对照 (Xba I和 BamH I酶切 的 pBI 121)；2：Xba l和 BamH l
双酶切 的几丁质酶植物表 达载体，从 上至下：第一条带为
pBI121；第二条带为几丁质酶信号肽基因和成熟蛋白基因的
重组体；M：DNA分子量标准 DL2000．从上至下(bp)：2000，
1000．750。500，250．100。1：control(pBI121 digested by Xbal
and BamHI)；2：plant expression vector digested by XbaI and
BamH1．from up to down：the first band is pBl1 21；the second
band is the recombinant of the signal peptide gene and the ma—
ture protein gene for the chitinase；M ：DNA marker DL2000．
from up to down(bp)：2000．1000．750．500．250．100．
能“ 。甚至随机多肽序列也具信号肽引导蛋白质转
运 、定位和分泌的功能“ 。此外 ，尚有其它许多异
源信号肽引导蛋白质有效转运、定位、分泌等的研
究报告，其中大部分是有关大肠杆菌等原核表达系
统 的，也有 一 些 是 有 关 植 物 等 真 核 表达 系统
的。 。(4)将菜豆几丁质酶信号肽基因和豇豆几
丁质酶成熟蛋白基因重组成的嵌合基因作为目的
基因构建植物表达载体进而转化植物在转基因植
物中表达，不仅避免了应用 cDNA末端快速扩增技
术等方法的困难，而且可研究蛋白质在信号肽引导
下的转运、定位等问题。因此，本研究所构建的植物
表达载体不仅可以具体应用于转化西瓜等的优良
品种，创建和培育抗枯萎病等真菌病害的优 良种
质、品种，而且还可以应用于深入研究异源信号肽
引导蛋白质在高等植物这个真核表达系统中的转
运、定位等理论问题。 ” 。
之所以选择菜豆几丁质酶信号肽基因构建嵌
合基因，是因为主要从以下几个方面来考虑的：(1)
选用的菜豆几丁质酶与豇豆几丁质酶一样属于1类
几丁质酶，其成熟蛋白基因与豇豆成熟蛋白基因的
序列同一性高达 86．1 ，仅低于几种主要植物中
Vigna unguiculata的I类几丁质酶成熟蛋白基因(但
Vigna unguiculata的信号肽序列未知，而菜豆的则
已知)。(2)菜豆几丁质酶信号肽序列完全具备一般
信号肽的所有主要特征：在氨基末端有一段带正电
荷的氨基酸序列；在中间有一个疏水的核心区，常
含亮氨酸或异亮氨酸残基；在羧基端有一个能被信
号肽酶水解的切割位点，这个位点常在丙氨酸之
后，或者在甘氨酸或丝氨酸之后 。(3)菜豆几丁
质酶基因在转基因植物中定位正确、表达高效。”。
参考文献 ：
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