全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(5)：594— 600 2010年 9月
甘蔗属不同种及优良甘蔗栽培品种
的 SSR标记遗传多样性分析
梁 俊1，2～3 4，PAN Yong-Bao6，李杨瑞 ，2，4，5*，
方锋学2，3，4，吴凯朝1’2，u，3 4，游建华2，u，3 4
(1．广西大学 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁 530004；2．中国农业科学院甘蔗研究中 6／广西
甘蔗研究所 ，南宁 530007；3．农业部甘蔗品质监督检验测试中心，南宁 530007；4．国家糖料改良中心广西
甘蔗品种改良分中心，南宁 530007；5．广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007；
6．USDA-ARS，Sugarcane Research Unit，5883 USDA Road，Houma，LA 70360，USA )
摘 要：应用21对SSR引物与毛细管电泳技术，分析了52个甘蔗属品种的遗传多样性。共检测出327个 SSR
标记，平均每对引物检测 15．6个。选择 141个共显性标记构建 SSR标记指纹图谱数据库，利用DNAMAN软件
与UPGMA统计方法分析参试材料遗传多样性。DNAMAN软件同源分析显示，新台糖 16号与台优 1号之间
的同源性最高(87 )，品种之间最小的同源性为55 ；利用UPGMA统计方法可把参试材料分成4个遗传相似
性较高的类群。结果表明，SSR标记与毛细管技术的结合，可构建甘蔗种质资源 SSR标记指纹图谱、分析甘蔗种
质资源遗传多样性。聚类分析显示参试甘蔗材料的遗传基础相近，为了提高甘蔗选育种效率，应拓宽甘蔗选育
种亲本的遗传基础，提高杂交栽培品种的抗虫、抗病等特性。
关键词 ：简单重复序列(SSR)；甘蔗属 ；指纹图谱 ；毛细管电泳；遗传多样性
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)05—0594—07
一 ‘‘ 一‘ ‘ n一 ’ ● Genetic diversity assessment 0=【5acchaJP． 7 SpeCleS
and elite cultivars from China using SSR Markers
LIANG Jun1，2，3，4，PAN Yong-Bao6，LI Yang-Rui ，2，4， ，
G Feng-Xue2，3，4，WU Kai-Chao1，2，3一，YOU Jian-Hua2，3，4
(I．Cruangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization，GuangM University，Nanning 530004，
China；2．Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sclences／Guangxi Sugarcane Research Institute，
Nanning 530007，China；3．Sugarcane Quality Inspection and Test Center in Nanning，Ministry of AgHc~ture，
Nanning 530004，China；4．Guangxi Sugarcane Variety Branch，National Sugar Crops Improvement CeT~er，
China；5．Guangxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology Lab，Nanning 530007；6．USDA-ARS，
Sugarcane Research Laboratory，5883 USDA Road，Houma，LA 70360，USA )
Abstract：Genetic diversity amongst 52 sugarcane clones including Saccharum species and cultivars(used for breeding
收稿日期：2009—08—21 修回日期 ：2010—08-30
基金项目：国家科技支撑计划(2。O7BAD3OB00)；广西基本科研专项(02009001)；广西区回国基金(桂科回0991011)；广西自然科学基金(桂科基
0639009)；广西农业科学院科技发展基金(201002Z)[Supported by the National Science and Technology R＆D Program of Ch；na(2007BAD3OB0o)；
Special Fund for Basic Scientific Research of Guangxi(G2009001)；Science Foundation of Guang】ci(O991O11，0639009)；Foundation for Scientific and
Technological Development of Guangxi Acadency of Agricultural Scienees(201002Z)]
The work was conducted at the USDA-ARS，Sugarcane Research Laboratory，Houma，LA，U．S．丸 under a Non-funded Cooperative Agreement between
the Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007 and the USDA-ARS，Sugarcane Research Laboratory，Houma，
LA 70360。U & A．
作者简介；梁俊(1976一)，男，广西兴业 县人 ，博士，副研究员 ，从事甘蔗育种研究。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：liyr@gxaas．corn)
5期 梁俊等：甘蔗属不同种及优良甘蔗栽培品种的SSR标记遗传多样性分析 595
and commercial production since the beginning of 20th century)had been assessed using 21 Simple Sequence Repeat
(SSR)markers and capillary electrophoresis(CE)technique．Use of 21 SSR primers resulted in amplification of 327
disting uishable SSR markers with an average of 15．6 bands per primer．A total of 141 distinctive SSR alleles were
scored,which have been used for construction of fing erprinting database and assessment of the genetic diversity using
DNAMAN analyzing software and UPGMA algorithm methods．The highest genetic homology was 87 ，observed
between ROC 16 and TY 1，the lowest genetic homology was 55 ．The UPGMA algorithm with SSR markers
showed four distinguishable clusters of genetically similar species and varietal clones．The results indicated that using
SSR markers in combination with CE is an efficient tool for fing erprinting database construction and assessment of ge—
netic diversity．Occurrence of most cultivated clones in just 4 clusters indicated the exploitation of similar genetic da—
tabase for the breeding purposes．The breeding programs should be tailored to exploit the wide range of germplasm
using Saccharum species to get good varieties especially for disease or insect-pest resistance．
Key words：Simple sequence repeat(SSR)；Saccharum；fingerprinting；Capilary Electrophoresis；genetic diversity
公元前几百年，中国人开始利用甘蔗产糖或作
为园艺作物 ；2O世纪 3O年代之前 ，中国的主要甘蔗
品种 有 竹 蔗、芦 蔗，均 属 中 国 种 (Saccharum
sinense)。20世纪初在关岛等太平洋岛屿上，利用
甘蔗属割手密 (Saccharum spontaneum)与热带种
(Saccharum officinarum)进行“甘蔗高贵化育种”
(Stevenson，1965)。之后，中国引进了此次杂交的
一 些后代材料 ，并在中国大面积种植 ，如 POJ2878，
POJ2725等；这些材料也成为了各地甘蔗研究机构
的主要杂 交亲本 。2O世纪 5O年 代末 ，台湾 品种
F134成为中国的主要甘蔗栽培 品种 ，7O年代之后 ，
各省陆续推 出适应 本地 种植 的甘 蔗 品种 ，如 粤糖
63—237、桂糖 l1、闽糖 70—611、川蔗 13、桂糖 21等
(邓重焘，1990)。目前，在中国种植的主要甘蔗栽培
品种遗传胞质基本来 自“甘蔗高贵化育种”过程的后
代，导致品种间生物学特性差异小、遗传多样性狭窄
等问题 。因此 ，如何应用适 当的技术进行鉴定甘蔗
品种、分析遗传多样性等研究 ，已成为当今甘蔗研究
的主要任务之一。
DNA分子技术广泛应用之前，人们主要借助形
态学和农艺性状 、细胞 核型分析 、同工酶标记、染色
体分析等技术，进行鉴定甘蔗品种、遗传多样性分析
等(Chandra等，2001；Glaszmann等，1992；Srivas—
tava等，2002)；这些技术受环境、甘蔗的遗传特性等
因素制约，难 以广泛推广 。 目前 DNA 分子标记 已
被广泛应用于甘蔗的品种鉴定、遗传多样性分析、基
因定位和辅助育种等方面。相比之下，SSR分子标
记技术具有多态性丰富、共显性遗传、分析方法简
单 、重复性好等优点。 目前 ，SSR标记 的 PCR产物
检测方法主要采用聚丙烯酰胺电泳、毛细管电泳、同
位素标记引物等；毛细管电泳具有准确性高、重复性
好、费用较高等特点。Cordeiro等(2000)开始利用
毛细管电泳检测甘蔗 SSR标记的 PCR产物，Pan
等(2006，2007)利用毛细管电泳与 SSR标记建立了
甘蔗种质资源数据库，应用于鉴定甘蔗品种、检测甘
蔗杂交成功率等育种工作 。
本试验选择了52个从 2O世纪初至今在中国广
泛种植的甘蔗栽培品种与甘蔗选育种主要亲本，利
用 21对 SSR引物与毛细管电泳技术来构建它们的
指纹图谱，分析遗传多样性。
1 材料
选用 52个甘蔗属材料(表 1)，材料由广西甘蔗
研究所种质资源圃提供。
1．I DNA提取方法
从甘蔗植株取 3片+1叶，去中脉后用剪刀剪
取中间部分 ，剪碎混匀后称取 2 g用于提取 DNA。
DNA提取采 用改 良 CTAB法 ，液 氮研磨 ，加 1
CTAB缓冲液 ，65℃水浴 1 h，加氯仿／异丙醇混合
液 ，12 000 rpm离心 10 min，用冷乙醇沉淀提纯，最
后用 TE溶液稀释到工作浓度。
1．2 PCR扩增与毛细管电泳
采用 21对引物，引物序列由国际甘蔗微卫星协
会 (International Sugarcane Microsatelite Consor—
tium，ISMC)提供(Cordeiro等，2000)，正向引物 5
端以磷荧光染料标记 ，引物相关信息见表 2。
PCR总反应体系为 10 L，其 中含 DNA 样 品
10 ng，10 mmol／L Tris—HC1(pH8．3)，50 mmol／L
KC1，2．5 mmol／L MgC12，dATP、dTTP、dGTP和
dCTP各 80 mmol／L，正反向引物各 0．2 mmol／L，
Taq DNA聚合酶 1 U(试剂购 自罗氏生物药剂公
596 广 西 植 物 3O卷
司)。PCR反应在 ABI-9700型基因扩增仪(美 国应
用生物系统公司)上按以下程序运行 ：首先 95℃预
变性 5 min；随后的 30个循环为：94℃变性 30 S，退
火 3O s(不同引物的具体温度见表 1)，72℃延伸 3O
S；最后 7r2℃下延伸 2 min，4 oC保温。
PCR产物在 ABI-3730XL基因分析仪(ABI应
用生物公司)上利用毛细管 电泳法(Capilary Elee—
trophoresis，CE)检测。每个 CE样 品中含有 1 L
PCR产物、0．4 L Genescan-500分子量标准品和
2O L去离子 甲酰胺。在毛细管电泳过程中，PCR
产物与 Genescan-500分子量标准品的荧光信号均
由基因分析仪自动检测保存。
表 1 甘蔗属种质的编号及其来源
Table 1 A list of Saccharum clones and their origins
1．3 SSR标记数据分析与遗传分析
用 GeneMapper-V3．0软件对 ABI-3730XL基
因分析仪收集到的数据进行分析 ，通过人工分析与
软件统计得出不同SSR引物对不同甘蔗属材料扩
增得到 的 SSR标 记片 段。参 照前人 的研 究方法
(Clark，1988；Levinson等 ，1987；Pan，2006；Schlot-
terer等，1992；Weber等，1989)，软件可以通过将
SSR标记片段与Genescan-500分子量标准品比较，
得到不 同片 段 长度 大 小；有 SSR 标记 片 段记 为
“A”，无 SSR标记片段记为“C”，并进行二维数据统
计。参照 Pan(2007)的方法 ，利用 DNAMAN软件
绘制 同源 关 系 图 (Homology tree)。按 Jaccard
(1908)的方法计算两个甘蔗材料之问的Jaccard遗
传相似系数，用 UPGMA法进行聚类分析并绘制遗
传树状图，所有计算及绘图均在 NTSYS-PC统计软
件下完成。
2 结果与分析
2．1基因组 DNA的遗传多态性
21对引物在参试甘蔗材料共扩增 出 327个
SSR标记，平均每对引物扩增到 15．6个 SSR标记；
引物 SMC703BS扩增到的 SSR片段最多 (24个)，
mSSCIR74扩增的 SSR片段最少(7个)。SSR片段
大小范围为 92~254 bp，绝大部分 SSR片段大小集
中在 10O～200 bp之间。52个甘蔗栽培品种共扩
5期 梁俊等：甘蔗属不同种及优良甘蔗栽培品种的SSR标记遗传多样性分析 597
增到 4 359个 SSR标记，每个甘蔗材料扩增到 83．8
个；桂林竹蔗(GLZZ)扩增到 109个 SSR标记 ，多态
性最高 ；桂糖 1号只扩增到 64个 SSR标记 ，多态性
最低。
2．2甘蔗栽培品种指纹图谱构建
参考 Pan等(2007)的方法 ，在扩增产物 中只统
计 141个多态性较高的 SSR标记 (表 3)，有无这些
特异 SSR标记构成特定甘蔗材料的指纹图谱数据
库。此数据库可用于鉴定种质资源、检测杂交种纯
度等甘蔗育种工作。表 3是桂林竹蔗与桂糖 19号
的 SSR标记指纹 ，两者 只有 引物 SMC486CG扩增
的 SSR标记一致 ，其 它引物的扩增均不一致。通过
此方法 ，本实验建立 52个甘蔗栽培品种的指纹图谱
数据库 ，利用遗传软件对此数据库进行分析，绘制 出
这些甘蔗品种的同源关系图与遗传聚类图(图 1，图
2)。
表 2 弓l物编号及引物扩增信息
Table 2 Primer pairs’name and polymorphic markers’information
引物名称 扩增总带数
Name No．of bands
条带大 小 (bp)
Fragment size ．
引物 火温度 (℃ 引物序列 Prime sequence
／-knneahng tem perature
SMC7CUQ
SMC18SA
SMC22DUQ
SMC24DUQ
SMC31CUQ
SMC36BUQ
SMCl19CG
SMC278CS
SMC334BS
SMC336BS
SMC486CG
SMC569CS
SMC597CS
SMC7O3BS
SMC851MS
SMC1604SA
SMC1751CI
mSSC1R3
roSSCIR43
mSSCIR66
mSSCIR74
158～ 171
130～ 165
14O～ 163
121～ 142
138～ 185
104～ 254
1O5～ 131
140～ 182
132～ 165
141～ 185
224～ 245
165～ 233
144～ 179
203～ 229
127～ 152
92～ 127
134～ 154
169～ 187
168～ 252
122～ 146
214～ 229
GCC AAA GCA AGG GTC ACT AGA(正向)
AGC TCT ATC AGT TGA AAC CGA(反向)
ATT CGG CTC GAC CTC GGG AT(正向)
AGT CGA AAG GTA GCG TGG TGT TAC(反向)
CCA TTC GAC GAA AGC GTC cT(正向)
CAA GCG TTG TGC TGC CGA GT(反向)
CGC AAC GAC ATA TAC ACT TCG G(正向)
CGA CAT CAC GGA GCA ATC AGT(反向)
CAT GCC AAC TTC CAA TAC AGA CT(正向)
AGT GCC AAT CCA TCT CAG AGA(反向)
GGG TTT CAT CTC TAG CCT ACC(正向)
TCA GTA GCA GAG TCA GAC GCT T(反向)
TTC ATC TCT AGC CTA CCC CAA(正向)
AGC AGC CAT TTA CCC AGG A(反向)
TTC TAG TGC CAA TCC ATC TCA GA(正向)
CAT GCC AAC TTC CAA ACA GAC T(反向)
CAA TTC TGA CCG TGC AAA GAT(正向)
CGA TGA GCT TGA TTG CGA ATG(反向)
ATT CTA GTG CCA ATC CAT CTC A(正向)
CAT GCC AAC TTC CAA ACA GAC(反向)
GAA ATT GCC TCC CAG GAT TA(正向)
CCA ACT TGA GAA TTG AGA TTC G(反向)
GCG ATG GTT CCT ATG CAA CTT(正 向)
TTC GTG GCT GAG ATT CAC ACT A(反向)
GCA CAC CAC TCG AAT AAC GGA T(正向)
AGT ATA TCG TCC CTG GCA TTC A(反向)
GCC TTT CTC CAA ACC AAT TAG T(正向)
GTT GTT TAT GGA ATG GTG AGG A(反向)
ACT AAA ATG GCA AGG GTG GT(正向)
CGT GAG CCC ACA TAT CAT GC(反向)
AGG GAA AAG GTA GCC TTG G(正向)
TTC CAA CAG ACT TGG GTG G(反向)
GCC ATG CCC ATG CTA AAG AT(正向)
ACG TTG GTC CCG GAA CCG(反向)
ATA GCT CCC ACA CCA AAT GC(正向)
GGA CTA CTC CAC AAT GAT GC(反向)
ATT CAA CGA TTT TCA CGA G(正 向)
AAC CTA GCA ATT TAC AAG AG(反向)
AGG TGA TTT AGC AGC ATA(正向)
CAC AAA TAA ACC CAA TGA(反向)
GCG CAA GCC ACA CTG AGA(正向)
ACG CAA CGC AAA ACA ACG(反向)
∞ 鼹 ∞ 弘 黯 娼 ∞ ∞ 蝎
” ¨ 9 n n w 7
598 广 西 植 物 30卷
2．3甘蔗栽培品种之间的同源关系与遗传关系
在生物学种系发生理论中，两个或多个结构具
有相同的祖先称为同源。在同源关系图中，100 同
源代表着两个参试材料为相 同的品种。图 1表明，
同源性最高的为 ROC16与 TY1、ROC10与 ROC9
(为 87 )。ROC16与 TY1当前在广西都被大量种
植，两者的农艺性状除了叶子形态之外基本一致，推
断这两个品种来 自于相同亲本。本试验中最小同源
性为55 ，表明了现代甘蔗栽培品种相互之间遗传
距离较小，遗传基础较窄。
根据 21对 SSR引物所扩增得到的 141个 SSR
标记，计算它们的遗传相似系数矩阵，利用 UPG—
MA进行聚类分析，52个甘蔗品种共聚成4类(图
2)。中国种的原种芦蔗(LZ)、POJ2878、CO421等 6
个品种聚为 A类。R0C9、ROC10、GT1、GT94／116
等 17个品种聚为B类，其中ROc9与 ROC10的相
似性最大(O．88)，与 DNAMAN软件的同源性分析
结果相似。CP28／11、CP34／120、CP49／50等 19个
品种聚类为c类，其中的 ROC16与台优 1号 TY1
遗传相似性较高，与 DNAMAN软件的分析结果相
类似；此类聚集了 3个 CP品种 ，这 3个 CP品种亲
本具较高遗传相似性。D类聚集了1O个栽培品种，
包括 GT5等5个桂糖系列品种，这些桂糖系列品种
在选育过程中选择了相同或同源性较高的亲本。
表 3 甘蔗栽培品种桂林竹蔗与桂糖 19号的 SSR标记片段指纹
Table 3 SSR fingerprinting bands of GLZZ and GT19
条带 140 143 144 147 15O 151 153 173 175 177 178 180 231 233 235 237 239 247 248 250 252 127 130 132 134 144 145 146
GLZZ A C A A A C A C C C C A C A A C A C C A A A C A C C A C
GT19 A C A A C A C A A C C A C C A C A C A A A A C C A A C C
3 讨论
本研究用 21对荧光 SSR引物与毛细管电泳检
测了 52个甘蔗属 品种，平均每对引物扩增到 15．6
个 SSR标记，高于 Hemaprabha(2005)和游建华
(2008)的SSR标记研究(12．3个)。表明毛细管电
泳法与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法相比具有微量、
分辩率高、重复性好等优点。
统计了141个SSR共显性标记，构建参试甘蔗
材料指纹图谱数据库，分析品种间的遗传关系。材
料之间的同源性最高为 87％，表型最为相似的
ROC16与 TY1也可用此方法分开。与 Pan等
(2007)的结果一致，基于本研究构建的SSR标记指
5期 梁俊等 ：甘蔗属不同种及优良甘蔗栽培品种的 SSR标记遗传多样性分析 599
纹图谱数据库，可以鉴定现有的甘蔗栽培品种。
1 00j‘ 90Ii 809‘ 70I‘ 60％ 50％
图 1 52个甘蔗栽培品种的同源关系图
Fig．1 Homology tree of 52 sugarcane cultivars
based on 141 SSR loci
不同时期种植的甘蔗栽培品种表现出较高的同
源性或遗传相似性，如 POJ2878(2O世纪 3o年代)
与YT86—368(2O世纪 80年代)的同源性为 79 ；
poJ2725(20世纪 30年代)与 GT94／116(20世纪 8O
年代)等聚类在 B类群。聚类分析结果也不能反映参
试甘蔗材料的地域特征 ，如台糖、新台糖系列、桂糖系
列等未按地域特性聚类为相同类群之中。上述现象
可能因为这些甘蔗品种采用的亲本之间基本上来 自
于“甘蔗高贵化育种”后代，遗传关系相近；Nair等
(2002)利用 RAPD标记技术也提出类似观点。
O．58 o．65 0．73 0．80
Coefficient
图 2 52个甘蔗栽培品种的遗传聚类图
Fig．2 Dendrogram of 52 sugarcane cultivars
based On SSR markers
不同作物的育种实践证 明，亲本遗传差异是产
生杂种优势的原因。因此，如何拓宽甘蔗选育种亲
本问的亲缘关系已成为甘蔗研究工作中丞待解决的
问题之一。中国种桂林竹蔗、芦蔗和河口红皮与现
代甘蔗栽培品种的同源性也较高，不主张利用中国
种材料拓宽甘蔗选育种亲本亲缘关系。割手密是甘
蔗属中分布最广 、类 型最多的野生种、具有高抗逆
性、宿根性、适应性等优 良性状，可作为提高甘蔗育
种杂种优势的亲本材料，提高甘蔗选育种的效率。
本试验表明，毛细管电泳可重复性高、高多态
性、有效性高等特点，通过 SSR标记构建的指纹图
伽∞鹕 o 惶∞ 撇 ∞ ， m 富i m ％
600 广 西 植 物 30卷
谱数据库能够灵敏、可靠、稳定地反映甘蔗种质资源
的遗传特 性。本研究 中 21对核心 引物 由 Pan
(2006，2007)从 221对 SSR引物中筛选而来 ，利用
SSR荧光标记结合 DNAMAN软件、NTSYS软件，
满足了构建甘蔗种质资源指纹图谱数据库和遗传分
析的要求。在以后的研究中，随着甘蔗材料数量增
加，可筛选增加 SSR引物，使指纹图谱数据库满足
鉴定甘蔗品种与甘蔗育种的要求。
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