全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(1)：106— 111 2010年 1月
利用 SSR标记与毛细管电泳对
甘蔗属进行的遗传分析
梁 俊1，2～3 4，PAN Yong—Bao6，李杨瑞 ，2，4，5*，方锋学2，3，4
(i．广西大学 广西亚热带生物资源保护利用重点实验室，南宁 530004；2．中国农业科学院 甘蔗研究中心，南宁
530007；3．农业部 甘蔗品质监督检验测试中心，南宁 530007；4．国家糖料改良中心 广西甘蔗品种改良分
中心，南宁 530007；5．广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室，南宁 530007；6．USDA-ARS，
Sugarcane Research Unit，5883 USDA Road，Houma，I A 70360，U．S．A．)
摘 要：为探讨甘蔗属内不同种之间的遗传多样性，利用 SSR标记与毛细管电泳技术 ，对来 自甘蔗属 3个不
同种的 12个材料 19对引物进行检测，共检测到 229个 DNA多态性条带 ，19对引物扩增的 DNA条带范围集
中在 100~260 bp之间。12个甘蔗材料的Jaccard遗传相似度，最小 0．09，最大 0．65，平均为 0．26。通过遗传
相似性系数分析，UPGMA聚类图内12个甘蔗材料可分为两个群，三个割手密种材料分为一个亚群，甘蔗栽
培品种与甘蔗热带种合为一个亚群。结果表明：热带种比割手密种具有和甘蔗栽培品种更亲近的遗传关系；
SSR分子标记与毛细管技术结合，相比别的分子标记技术或电泳技术，具有更准确、简便、自动化等优点。
关键词 ：简单重复序列(SSR)；甘蔗；毛细管电泳
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2010)01-0106—06
Assessment of genetic diversity in Saccharum usi
SSR markers and capillary electrophoresis
LIANG Jun1，2，3”，PAN Yong-Bao6，LI Yang-Rui ，2，4，5 ，FANG Feng-Xue2，3，4
(1．Guangxi Key Laboratory of Subtropical Bioresources Conservation and Utilization，Guangxi University，Nanning 530004，China；
2．Sugarcane Research Center，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007．China；3．Sugarcane Quality Inspection
and Test Center at Nanning，Ministry of Agriculture，Nanning 530004，China；4．Guangxi Sugarcane Variety Branch，National
Sugar Crops Improvement Co~er，Nanning 530007，China；5．Gua ngxi Crop Genetic Improvement and Biotechnology l ab，
Nanning 530007，China；6．USDA—ARS，Sugarcane Research Unit，5883 USDA Road，Houma，I．A 70360，U S．A．)
Abstract：This study was conducted to assess the genetic diversity amongst 1 2 Saccharum clones from 3 species using
19 SSR markers and capillary electrophoresis(CE)．A total of 229 DNA bands were generated showing a size range
between 100 and 260 bp．Based on the SSR data，the Jaccard s genetic similarity coefficients ranged from a minimum
of 0．09 between CP72—1210(cultivar)and In81—142(S．spontaneum)to a maximum 0
． 65 between GX87(S．spontane—
UTf／)to GX86(S．spontaneum)．In the dendrogram using UPGMA method，the 12 Saccharum clones were clustered in—
to two groups．The three S．spontaneum clones formed a single group，while the three S．offfcinarum clones elus一
收稿日期：2009—04—20 修回日期：2009—10-l4
基金项目：国家科技支撑计划项目(2007BAD30B00)；广西区回国基金(桂科回0991011)；广西自然科学基金(桂科基0639009)；广西甘蔗分子遗传与
品种改良研究重点实验室建设项目[Supported by the National Scienee and Technology Supporting Program of China(2007BAD3OBO0)：the Science
Foundation of Guangxi(0991011，0639009)]
作者简介：梁俊(1976一)，男，博士生 ，从事甘蔗育种研究，(E-mail)jliang@gxaas．net。
通讯作者(Author for correspondence，E—mail：liyr@gxaas．corn)
‘The work was conducted at the USDA—ARS，Sugarcane Research Laboratory，Houma，LA，U．S．A
． under a Non—funded Cooperative Agreement
(USDA Control No．410334)between the Sugarcane Resea rch Center，Chinese Academy of Agricuhural Sciences．Nanning 530007 and the USDA—
ARS，Sugarcane Research I aboratory，Houma，I A 70360，U．S．A
l期 梁俊等 ：利用 SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析 107
tered with the six cultivars，which demonstrated that S．officinarum had a closer genetic relationship with cultivars
than S．spontaneum．The SSR markers data generated based on capilary electrophoresis are more accurate，simpler
and automatic as compared tO other molecular markers or electrophoresis．
Key words：Simple Sequence Repeats(SSR)；sugarcane；capillary electrophoresis
甘 蔗属 (Saccharum)系 禾 本 科 中的 Andro—
pogoneae族，主要有 ：热带种 (S．officinarum)、割
手密(S．spontaneum)、大茎 野生 种 (S．robustum)、
印度种(S．barber)、中国种(S．sinense)、野生肉质花
穗种(S．edule)，以及当今广泛种植的甘蔗栽培品种
(Daniel等，1987)。其个体各为遗传背景十分复杂
的异源多倍体或非整倍体 ，染色体数 目和形态特征
等相差很大(Burner，1991；Hont等，1998；Sreeniva-
san等，1987)。
20世纪 8O年代之前，人们主要利用追溯甘蔗
属的发源地、统计属内不同个体的形态特征、农艺性
状 、同功酶分析等方法，并结合数理统计法 ，来推 断
甘蔗属内种间遗传关系(Daniel等 ，1987)。之后 ，随
着分子生物技术的迅速发展 ，许多分子标记技术被
应用于研究甘蔗属内种间遗传关系。这些分子标记
包括 RAPD(Burner等，1997；Nair等，1999；Harvey
等，1 996)，RFLP(Besse等，1997；Coto等，2002；
Jannoo等 ，l999；Lu等 ，1994)，AFLP(Besse等，
1998；Cai等 ，2005；Lima等，2002)，SSR(Cai等，
2005；Cordeiro等 ，2000，2001，2003；Pan等 ，2006，
2007；Selvi等，2003)等。其中，SSR分子标记技术
具有高多态性、共显性强、操作性与分析简单等
特点。
应用 SSR分子技术进行 PCR扩增产物分析的
电泳方法，一般有琼 脂糖 电泳、聚丙 烯酰胺凝胶 电
泳、毛细管 电泳等技术 。毛细管 电泳 (Capilary E—
leetrophoresis，CE)是 2o世纪 8O年代后期在全球
范围内迅速崛起的一种分离分析技术，具有快速、高
效、高灵敏度、易定量、重现性好及自动化等优点，目
前已广泛地应用于小分子 、小离子 、多肽及蛋白质的
分离分析研究，以及药物成分分析、DNA测序、
DNA多态性分析等化学、生物技术领域之中(Kevin
等，1999)。Cordeiro等(2001)利用 21对 SSR引物
与毛细管电泳技术结合，结果有 17对表现出较高多
态性 ，此方法也表 明甘蔗栽培品种的多态信息含量
(PIC)较低 (0．23)。在 Cordeiro等 (2003)的研 究
中，用 6对 SSR引物对甘蔗属与其近缘属的 55个
不同材料进行遗传分析，研究结果表明了甘蔗属与
斑茅具有更亲近的遗传关 系。Pan等 (2006，2007)
的研究也表 明，SSR技术 与毛 细管 电泳技术相 结
合，可为甘蔗属的遗传分析、指纹图谱构建、杂交效
率评定等提供可靠、快速的技术方法。
本研究拟用 19对 SSR引物与毛细管电泳技术
相结合，对甘蔗属内的栽培品种、割手密、热带种进
行遗传分析，探讨此项技术对于分析甘蔗属遗传关
系的可行性 。
1 斌料与方法
1．1材料
实验共有 12材料 ，其 中包括 6个 常规 甘蔗 品
种 ，3个割手密种材料与 3个热带种材料(表 1)。
1．2 DNA提取方法
DNA提取方法采 取 Pan等 (2000)的方法，
DNA浓度与纯度分别用分光光度法(Shimadzu科
学仪器公 司生 产 的 Shimadzu UV一1601分光光 度
计)与琼脂糖电泳法检测(利用纯净水作负对照)。
1．3 PCR扩增与毛细管电泳
所有材料用 19对引物进行分析，引物序列由
ISMC(也称为国际甘蔗微卫 星协会 ，该协会由澳大
利亚的BSES、毛里求斯糖业研究所、美国佛罗里达
糖业协会等 15个研究机构与团体共同资助成立)提
供(Cordeiro等，2OOO)，正向引物 5 端以磷荧光染料
标记(引物的序列见表 1)。
PCR总反应体系为 1O L，其中 10 ng DNA样
品，10 mmol／L Tris—HCl(PH 8．3)，50 mmol／L
KCl，2．5 mmol／L MgC1 ，dATP、dTTP、dGTP和
dCTP各 80 mmol／L，正反 向引物各 0．2 mmol／L，
Taq DNA聚合酶 1U(试剂购 自罗氏生物药剂公
司)。PCR反应 在 96孔 ABI一9700型基 因扩增仪
(美国应用生物系统公司生产)上按以下程序运行：
首先 95℃预变性 5 min；随后的 3O个循环为 ：94℃
变性 30 S，退火 3O s(不同引物的具体温度见表 1)，
72℃延伸 3O S；最后 72℃下延伸 2 min，4℃保温。
PCR的产物在 ABI一3730XL基 因分析仪 (由
ABI生物公司生产)上利用毛细管电泳法(CE)检
1O8 广 西 植 物 3O卷
测。每个CE样品中含有 1 L PCR产物、0．4 L
Genescan一500分子量标准 品和 2O L去离子 甲酰
胺 (由 ABI生物公 司生产)。在毛细管电泳过程 中，
PCR产物与 Genescan一500分子量标准品的荧光信
号均由基因分析仪 自动保存。
1．4 SSR标记数据分析与遗传分析
用 GeneMapper—V3．0软件对 ABI一3730XL基
因分析仪收集到的数据进行分析，通过人工分析与
软件统计得出不同 SSR引物对 不同甘蔗属材料扩
增得到的SSR标记片段。软件可通过将 SSR标记
片段与Genescan一500分子量标准品比较，得到不同
片段长度大小；有 SSR标 记片段记为“1”，无记为
“0”，并进 行二 维数据 统计 (Clark，1988；Levinson
等，l987；Schlotterer等 ，l992；Weber等，1989)。
计算两个甘蔗材料之间的Jaccard遗传相似度
(Jaccard，1908)，由此相似系数用 UPGMA法进行
聚类分析并绘制遗传树状图，所有计算及绘图均在
NTSYS-PC统计软件下完成(Rohlf，1997)。
表 I 甘蔗属种质的编号及其来源
Table 1 List of Saccharum clones and their origins
2 结果与讨论
2．1 SSR标记分析
由表 3可知 ，引物从 12个材料 中共扩增 到 1O
个条带，条带的大小在 130～ 162 bp之间。由表 2
可知，l2个甘蔗材料通过 19对引物共检测到 229
个多态性条带 ，平均 每个 引物可检测到 12．1个条
带，每个甘蔗材料平均可检测到 l9．1个 SSR标记；
19对引物扩增 的条带范围集 中在 100～260 bp之
间。引物 SMC851MS在 12个材料 中扩增到 19个
条带，为最 多；引物 SMC36BUQ 与 SMC569CS只
扩增到 7个条带，为最小。
利用不同SSR引物对甘蔗属或其近缘种进行
遗传分析时，研究结果是有差异的。Cai等(2005)
用 10对引物对甘蔗属及其近缘属进行检测，不同甘
蔗属及其远缘种平均扩增到条带数在8．4～13．7之
间。Cordeiro等(2003)采用毛细 管电泳 方法 ，6对
引物一共扩增到 187个条带。上述研究与本研究结
果表明，毛细管电泳检测待定 SSR的长度、数量均
对传统的聚丙烯酰胺凝胶具有更高的精确性，分辨
率可高达 1 bp；还具有快速 、重复性好、易于定量和
适合自动化检测等优点。
2．2遗传相似性分析
利用 SSR标记信息，计算出 12个甘蔗材料的
Jaccard遗传相似度，最小为 0．09(甘蔗栽培品种
CP72—1210与割手密 IND81—142之间)，最 大为
0．65(两个割手密材料 GX 87与 GX86之间)，平均
为 0．26。割手密材料与甘蔗栽培品种之间的平均
遗传相似度为(O．15)小于甘蔗热带种与甘蔗栽培品
种之间的平均遗传相似度(0．33)。上述研究结果表
明，与甘蔗栽培品种相比较，割手密比热带种有着更
远的遗传距离。3个割手密材料之间的遗传相似度
为0．29，大于甘蔗热带种之间的遗传相似度(O．37)
与甘蔗栽培品种之间的平均遗传相似度(0．34)。
Cordeiro等(2003)的研究结果也表明割手密的遗传
基础比热带种更广泛，但 Cai等(2005)的研究结果
却相反。本研究认为样品的来源地影响此结论，遗
传距离最小(遗传相似度为 0．65)的两个割手密材
料 GX86与 GX87均来 自中国广西证明了此结论。
2．3聚类分析
由图l看出，所有的供试甘蔗材料可分为两群，
三个割手密材料分为一个亚群，甘蔗栽培品种与热
带种合为一个亚群。其中，甘蔗栽培品种 CP72和
LCP85，GT8、GT15和 Y57分别聚为一类，这两类
甘蔗栽培品种都来 自于相同或相近的地区，可能与
他们采用亲缘相近 的亲本杂交 有关。IN84虽然是
甘蔗热带种，但并没有与其 它两个甘蔗热带种
Green与 LA聚为一类，但是三个割手密单独聚为
一 类，证明了热带种比割手密具有和甘蔗栽培品种
1期 梁俊等 ：利用 SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析 109
表 2 引物编号及引物扩增信息
Table 2 Information of primer pairs and polymorphic markers
更亲近的遗传关系。
3 讨论
当今甘蔗栽培品种的细胞质主要来自于 2O世
纪初的“高贵化育种”的后代(Daniels等，1987)，种
质基础狭窄是当前中国甘蔗育种研究可持续发展的
首要限制因素。割手密、大茎野生种等甘蔗属的野
生资源具有抗旱、抗寒、抗不同病虫害等优良性状，
而且不少材料与甘蔗栽培品种遗传差异较大，对拓
宽甘蔗栽培品种的种质基础有极大的利用价值。了
解它们之间的遗传关系及杂种优势是有效利用甘蔗
野生资源的前提，但甘蔗属不同种及其近缘属的遗
传关 系还是一 个引 起争论 的 问题 (Daniels等，
1987)，利用新的生物技术解决此争论对于甘蔗育种
具有重要的现实意义。
在 SSR分子标记的检测技术中，毛细管电泳法
与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测法相比具有快速、微量、
分辩率高、重复性好、易于定量和适合 自动化检测等
优点(Cai等，2005；Cordeiro等，2000，2001，2003；
Pan等，2006，2007；Selvi等 ，2003)。它与 PCR和
其它技术(如 AFLP，SNP)的结合将会有逐渐取代
110 广 西 植 物 3O卷
CP72
LCP85
Green
LA
GT8
GT1 5
Y57
l N84
Y71
GX86
GX87
IND81
O．1 3 0．27 0．41 0．56 0．70
图 1 基于SSR标记数据绘制的DUPGMA聚类图
Fig．1 Dendrogram from the cluster analysis by
UDPGM A algorithm using SSR markers
传统的琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳的趋势。
本研究的结果与采用 RAPD(Nair等，1999)、
RFLP(Lu等，1994)、SSR与 AFLP(Cai等，2005)
的相类似：割手密均可与甘蔗属内其它野生种或栽
培种分开为不同的类群。甘蔗栽培品种与热带种在
进行聚类分析时，均可聚在同一类群内，这与 2O世
纪初的“高贵化育种”(Daniels等，1987)中不断采用
甘蔗热带种进行回交有一定的关系。Lu等(1994)
也用 RFLP分子标记证明了此结果。
本研究 12个甘蔗属 3个不同种的材料都能被
所用的 SSR标记完全区分 ，特别是基于毛细管电泳
的SSR荧光标记术，大大提高了精确度和效率，可
为涉及知识产权争议品种的鉴定中提供 DNA水平
的证据 。SSR标记在甘蔗种质资源 中具有丰富多
态性和可重复性等的优点可为建立甘蔗种质资源指
纹图、甘蔗属及其近缘属的遗传分析、甘蔗杂种鉴别
提供可靠的技术。总体上看，本研究中甘蔗栽培品
梁俊等：利用 SSR标记与毛细管电泳对甘蔗属进行的遗传分析 111
种的遗传相似程度较高，遗传基础相对较狭窄。为
了更有效地拓宽甘蔗栽培 品种的遗传背景，并有效
利用甘蔗属及其近缘属的的优良遗传胞质，建议利
用与甘蔗栽培品种遗传距离更大的野生资源与甘蔗
栽培品种杂交，可能会达到更佳的效果。
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