全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(2)：204— 208 2006年 3月
棕榈 ISSR反应条件的筛选与优化
李文表 一，周先叶 ，李 勇 ，张寿洲
(1．华南师范大学 生命科学院，广东 广州 510631；2．深圳市仙湖植物园，广东 深圳 518004)
摘 要：应用 ISSR技术对棕榈(Trachycarpus fortunei)进行分析研究，对影响 ISSR反应 的各 因子进行探
讨 ，确定 了该研究的最佳反应条件 ，建立了棕榈 ISSR反应的最佳反应 体系 ，为进行棕榈居群遗传多样性的研
究奠定了基础。
关键词：棕榈 ；ISSR标记 ；条件优化
中图分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2006)02—0204—05
Discussion on the ISSR reaction condition
of Trachycarpus fortunei
LI W en-biaoa，2，ZHOU Xian—ye ，LI Yong ，ZHANG Shou-zhou
(1．College of Life Sciences，South China Normal University，Guangzhou 510631，China；
2．Shenzhen Fairy Lake Botanical Garden，Shenzhen 518004，China)
Abstract：Inter-Simple Sequence Repeat(ISSR)is a good molecular marker for revealing genetic diversity．Re—
action system differed in different species，SO optimization of ISSR—PCR reaction is very important．The study
discussed mainly the factors impacting the banding patterns of PCR．To optimize the reactions，several param-
eters were tested，including the concentration of DNA template，MgCIz，dNTP，primer and Taq polymerase
with different annealing temperature．Optimal PCR(20 L)mix for Trachycarpus fortunei contained 10．6 tzL
double deionized water，2．0 L 1O×stock buffer，0．1 mmol／L of each dNTP，3．0 mmol／L primer，1．5 mmol／
L MgCIz，1 unit of DNA polymerase and 25 ng DNA template．
Key words：Trachycarpus fortunel；ISSR marker；Optimization
SSR是广泛分布于真核生物基因组的简单重
复序列(Simple Sequence Repeat)，由于其可以呈现
极高的多态性而被广泛应用。在 SSR基础上，Ziet—
kiewicz于 1994年提出一种新的分子标记——In—
ter-Simple Sequence Repeat(ISSR)(Zietkiewicz，
1994)，ISSR技术以在 SSR引物的 3 端或 5 端锚定
1～4个简并碱基作为扩增引物，对两侧具有反 向排
列 SSR的基因组 DNA序列进行扩增 (张维铭，
2003)。其优点是在基因组上只有那些与锚定的核
苷酸匹配的才能被靶定，可以避免 SSR在基因组上
的滑动，提高了扩增的专一性，而且不需预先知道其
序列信息。目前 ISSR标记已被迅速应用于居群遗
传学、品种鉴定、物种分类与系统学比较以及物种的
进化关系等研究(张维铭，2003)。
ISSR技术操作简单，其原理与 RAPD相似，但
比RAPD更稳定，多态性更高。就不同植物类群而
言，ISSR的最佳反应条件会有所差别，主要的影响
因子有模板 DNA浓度、Mg抖用量 、dNTP浓度 、退
火温度、热循环数及不同厂家生产的药品与仪器。
目前，对于ISSR反应体系的某些影响因子已有一
些初步的研究(余艳等，2003；张志红等，2004)。
棕榈(Trachycarpus fortunei)分布于中国，日
收稿 日期：2004—12—27 修回日期 ：2005—05—16
作者简介：李文表(1977一)，女 ，河北武邑人，硕士研究生，从事棕榈居群生物学研究。
通讯作者(Author for correspondence)，E—mail：~shouzhou@msn．corn~．
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2期 李文表等：棕榈 ISSR反应条件的筛选与优化 205
本、缅甸也有分布，因其独特的外形而倍受人们喜
爱，在园林上得 到广 泛应用 (裴盛基 等，199l；刘海
桑，2002)。此外还具有较高的经济价值，与人们的
生产、生活密切相关，用其叶鞘纤维制造的棕绳、棕
毛刷等纤维产品被广泛应用 ，全身可药 用(裴盛基
等，1991)。目前已经有一些有关棕榈科植物分子系
统学方面的研究 ，如 Hahn(2002)和 Baker等(2000)
利用 atpB，rbcL，18S nrDNA 和 5S nrDNA序列研
究棕榈植物的系统关 系；Loo等(1989)用 RAPD方
法对 Licuala glabra var．glabra；Haymes等(2004)
用 AFLP和 SSR对海枣 (Phoenix dactylifera)进
行了遗传多样性研究。而用 ISSR分 子标记来研究
棕榈科植物，至今未见报道。由于棕榈类植物含有
较多的糖类、酚类等杂质(Aichit等，l993)，提取的
DNA的纯度不够高，对反应条件可能会有一些影
响，故对 ISSR反应条件进行筛选和优化是非常必
要的。
本文以棕 榈 的基 因组 DNA 为模板 ，在 2O L
反应 体 系 中，以 较 常 用 的 807(AG)8T，835
(AG)8YC，836(AG)8YA，842(GA)8YG为引物，用
宝生物工程(大连)有限公司和广州华美公司生产的
Taq DNA聚合酶探讨 ISSR反应条件优化。
1 材料与方法
1．1材料
实验所用棕榈材料来 自云南 、广西 、湖南三个省
的 12个自然居群及部分栽培个体。共采集到 260
个样本，从中随机选取 1O个样本用于本实验的分
析 。
1．2方法
1．2．1基 因组 DNA 的提 取 用 改进 的 CTAB
(hexadecyl—Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide)
法从棕榈叶中提取基因组 DNA(邹喻苹等，2001)，
融于 0．1×TE，并稀释到 25 ng／ttL，于一2O℃保存待
用 。
在 DNA提取过程通过多抽提两次，分别用
7O 和无水酒精洗涤两次来纯化。
1．2．2 PCR扩增 本文通过对棕榈 ISSR反应体系
中模板DNA的含量、Mg抖的浓度、dNTP的用量、
引物的浓度及退火温度设置不同梯度，依次对其进
行筛选优化。此外还对生产厂家的 PCR仪以及不
同生产厂家生产的 Taq DNA聚合酶扩增效果进行
比较。起始反应体系：2O L体系中含2．0 L lO×
stock buffer。0．2 mmol／L dNTP，0．3／~mol／L引
物 ，1．75 mmol／L MgC12，50 ng DNA模板，1．0 U
Taq聚合酶，以双蒸水补足体系至 2O L。dNTP和
引物是由上海生工生物公司生产的，Taq DNA聚合
酶由宝生物公司和华美公司提供 ，反应在 eppendorf
梯度PCR仪和 MJ Research PTC一100TM仪上进行。
扩增程序为 ：95℃ 3 min；94℃ 25 S，50℃ 45 S，72
℃ 1．5 min，35个循环 ；72℃最后延伸 7 min。扩增
结果用 1．5 的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，紫外光
uV凝胶自动成像系统成像。
2 结果与分析
2．1模板 DNA浓度对 ISSR反应体系的影响
模板 DNA量设置了 6个梯度 ：12．5、25、37．5、
5O、62．5 ng和 75 ng。研究结果表 明，在一定范 围
内模板 DNA含量对棕榈 ISSR扩增结果的影响较
小，以上均能看到扩增条纹，但 l2．5 ng的模板扩增
出的条带较弱 ，当模板含量高于 5O ng时 ，出现成片
产物 ，而 且反应 不稳 定 。考 虑棕榈类 植物基 因组
DNA中含有的酚类等杂质较多(Aichitt等，l993)，
在实验 中用普通方法提取的 DNA和经过纯化处理
的 DNA作为模板，比较其扩增结果。发现模板
DNA纯度对扩增结果 影响不大 ，最终采用较低 的
DNA模板含量 25 ng。
2．2 Me 对棕榈 ISSR的影响
本研究设置了终浓度为 0、1．5、1．25、2．5、2．75
mmol／L和 3．0 mmol／L五个 Mg外浓度梯度 。试
验结果表明，没有 Mg抖不能扩增出任何条带；当
Mg 浓度为 1．5 mmol／L时，扩增效果最佳(图 1)。
2．3 dNTP浓度对 ISSR反应的影响
在本研 究 中设置 0．025 mmol／L、0．05 mmol／
L、0．075 mmol／L、0．1 mmol／L、0．15 mmol／L 和
0．2 mmol／L 6个浓度梯度 进行 比较 。研究发 现，
dNTP浓度小于 0．05 mmol／L时扩增 出的条带模
糊，浓度高于 0．15 mmol／L 时结果 不稳定，当
dNTP浓度为 0．1 mmol／L时扩增 出的条纹最佳 。
图 l与图 2中每个梯度设置一个重复(图 l、
2)。
2．4引物浓度对 ISSR反应的影响
本文在 2O L体系中，对引物浓度设置了 0．1
mmol／L、0．2 mmol／L、0．3 mmol／L、0．4 mmol／L
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2( G 广 西 植 物 26卷
和 0．5 Tnntol／L五个梯 废 比较发现 0．3 n】 L。l L
的引物能够扩增出清 晰 、亚复性 好的条纹
图 1 Ⅵ 浓 度试验
Fig．】 Tesling of M g concentration
l钎 ￡08(AG C 和 I料 85 AC】 YG ∞It浊闺 讲．M
非 准讣别斯 I j I 25、2 5 2．75和 3 0 mnl(1【 L
Ami,lified result of ⋯ I．80 7【A“ t。 nd primer 55 ￡AC) YG
L esdna 0： lfaI L0～ ⋯ I 5．1 ： 、2 7 2 75 I ~=71 LO【 【l
圈 2 退 火温埏扩 增试验
Fi 2 TeNt Lng 】f allIlPgIe(I teITI口er￡ture
I特 s0 (AG) T 相『‘I柳 s4 I(CTI I{C 也滹 l ，世 火
压 仆 50、5I、52 53、5I ；5
A∞ plifi rcs，l。 Llf1 rime r∽ 8(AG T JlL_rlriC J r1． r S-I iC 7 ．RC
Th trmpera LL1F~ —r 52 t ．j0 ’． ．5j t
2．5退火温度及热循环数对 ISSR的影 响
根据 ISSR引物 汁算 出的退火温度在 j!℃左
右 ，设置了 jo~C，j1℃，52=C．53℃ ．jl℃ ，ij℃ 六个
怖菠进行 试验 结 求发现 =C．j1 ’，55 不能 扩
瑞 仟何条纹 大多数 引物 52℃『I_=『能扩增 出稳 定清
晰 救带 因此．5 2℃ 蚋退 止温度为本研究最佳退
火温度 图 2)
2．6 Taq DNA聚 台酶与 PCR厂家殛型 号的不同对
ISSR扩 增效果 的影 响
本研究分别用宝生物工程 (大连)有限公司生产
的 Ta I I)NA 聚台酶设 置了 0．5 U、1．0 I 和 1．：U
三个梯 凄 结果表 明 ．在 20 L体 系中 {=I)NA
聚合酶的量为 0．5 U时．条带较弱+k1．扩增结果不
稳定 ．故认 为 1 U Iaq DNA 聚台酶为最佳反应 量
用华美公司生产的 Taq DNA聚台酶进 行同样 豹摸
索{_rI=验 ．得刹同样的结 论，说 明使刷宝 生物工 程 (夫
连)有限公 司和华美公 司生产 的 Taq DNA聚 台酶
对棕榈 ISSR扩增结果影响 不大。
水实验在 爱普 生 (eppedarf)公 司梯度 PCR仪
上对 棕蜘 基圈组 DNA 进行 ISSR发 应条件 的筛 选
与优化 再在 MJ Researcb公司 的 PTC 1 00 的
PCR仪上进行 ：
1】_叮次不同药品与 仪器的试验结果发现 ISSR的
最佳J豆应条 件相 同 ．说明 此研究 筛选 优化 屿 lSSR
扩增 条件可重复性好 ，稳定性高 ，受仪 器刷号和药品
批号的影响不太
2．7反应 条件的确定
经过反复试验表明 ．棕桶 [SSR 20~1L的景悻反
应体系为：1 0 bufer 2 0 L，0 l OITIC] L dN IP．
0．3 l／l[ItOl 【J引物 ，I．j mmol／I MgC!一，2j ng模板
DNA I U T叫 DNA聚合酶 ，以双蒸水补足体系至
20 L 最佳反应程序 ：9j℃ 预变性 3 ntin．94℃ 30
s． 2℃ 4j s．7 2~C 1．5 min．35个 循环 ． !℃最后 延
” 7 mifl 此反应 条件扩 增 出的条带 清晰，口『重复
1 (臣I：{J．
3 讨论
I]CR 增 容易 受 到请 多因素 的影 响 ：如模 l{丘
DNA 的用量与纯 度、tiNTP刷量 、引物浓度 、MgCI：
的『丌量及扩增程序与循环数 等 基因组 DNA是悼
~l-t, 增 的模板 ，其用量 和纯 度直接影响 PCR的产量
和效率 1SSR对 DNA筷 板 的许可范 围较 火．5～
：0 r】g范围的 DNA均能提供较好的结果(邹喻苹
等．20~1】 1SSR对模板浓度与纯度要求并不是很
高 (张志 红等．2004}冯 富娟等 ．2004)．率实验未对幞
板 】)NA 卫上行 纯 化，同样 I『5}到较 好 的扩 罐 结 果
clNq P是PCR的原料，麒浓度直接影响扩增教果，
浓度过高会导致错误掺人：浓度过低．扩增产物少，
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2期 李 文表 等：棕榈 ISSR反应 条件n々筛选与优 化 207
而。f=L有可能使产物单链化 ，dNTP一般浓度 为 0．05
～ c．2 mmoI／L(张维怡，2003) 引物浓度太低l尢扩
增产物 ．太高会造戚筷扳与引物 的错 配，甚至形成 引
物二聚体 (张维铭 ，~003) 引 物浓度一 般 为 0．1～
【．5 mmot／L(王建波 ，2002j． Faq DNA 聚合酶 是
PCR反应 的催化剂 I、 【DNA聚 合晦量 少会影 响
扩增的产摩．维度过高叉会造成浪费=聚台酶要靠
二价阳离 子 Mg。 激 活 才 能 发挥 其 作 用 ，故 优化
Mg 对 PCR反应，尤其对ISSR是非常重要 实验
中 Mg 对 ISSR 反 应 的 影响 十分 明显 。一 般 的
PCR反应 p M 浓度为 1．5～2．0 mmel／L(张维
镀 ，20C3j
3O0Obo
600bD
100bP
图 3 引物 8j 0『H忱化后舶反应条件对稼搁部分样品的扩增谱带
Fig．3 The ISSR p r{!file frnm p rimer 8 10 for 8OI]!e aHlp[e wit1]lhe Oplimized condition
最佳扩增程序提供 PCR最佳扩增效果 反直
程序中对扩增效果影响最大 岫是迟 火温度 退火泓
度山引物长度及 GC含 决定 ，具体 可山公式 T 一
4( —C)一2(A+T)确定 (张维铝 ．2003)，退火 度
一 般取 T 一5℃。但事实上 T 嫠受到梅反应J!1
分的浓度影响很大，故由 算出 退火温度I』
是一个太致值，具体PCR反应[n需婴县体摸索 有
些研 究认 为不 同引物 具有不 同的垃适 退 火 度 (余
艳等．2003；王 建波 ，2002；冯 富 炯等 ．90(14；廖 文 芳
等．2004)，但另外也有研 究表 叫刑同样材 料不同 的
1SSR引物用同样 的退 火温度 即可 扩增 出稳定的、多
态性高 的 产物 (肖龙 寄 等，2 - 3； 永 奇 等，2003；
Qilj等 ，2004jAdan1s等．2C03；Hat cher等 ，2004)
本实 验每个引物均在 51 帕 退火温度 计能够扩 出
清晰、稳定柏条带 在此退火弧度下从 、条 1SSR
引物中筛选出l 2条能够扩增出稳定、清晰、多态陛
高条带的引物，与后者的研究结果一致
1SSR反应特异性 和稳定 部很 强‘冯甫 娟等，
2004) 用宝 生物 公 生 产的 raqDNA 臻台 酶在
eppendol：#椰 度循 环仪 进行 筛选 优 化最佳 ISSR
PCR反应条件 『司样的条件用华美公司生产垧聚
台酶 MI Research公司的 P FC—l0。1 循环仪上进行
同样的试验 得 到同样较 好的 增效果 说 明优化
后的 ISSR反应 条 件 具有 很高 的 稳定 性和 可重复
性．不同型号的 PCR循环仪与不同公研生产的
Taq酶 的筛 选优化 结 相同 ，验 证 了 ISSR反应 的
可重复 l生高．稳定 性好的特 点 这 蜕明 ．稳 定 、可重
复性好的理地 1SSR反应条件足可以通过反复筛选
与优化得到的
本实验稳定的 ISSR反应体系可以为栋榈 ISSR
实骑蚺后续 工作 提供 参考 ，特 别 是可 为运用 [SSR
技术进行抹榈遗传多样性研究奠定 一定的基础 该
研究对探讨影响 ISSR反应 的影响困予及 进行有 关
实验具有一定的参考价值
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