全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 30(2)：256— 260 2010年 3月
怀地黄 SRAP扩增体系的建立与引物的筛选
周春娥，谷凤平，路淑霞，段红英，周延清
(河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007)
摘 要：为建立适合怀地黄 SRAP—PCR分子标记技术体系，通过单因子实验分别研究了 DNA模板浓度、
TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度、引物浓度以及 dNTP浓度对怀地黄 SRAP扩增反应 的影 响，确立了适合怀
地黄 SRAP最佳反应体系为：在 25 L的反应体系中，模板 DNA量 20 ng／25 L、2．5 mmol／L Mg抖 、0．32
tlmol／L的上下游引物、0．30 p-mol／L的dNTP以及 2．5 U Taq酶，并利用确定的体系从 88个引物组合中筛选
出 12对适合怀地黄 SRAP—PCR反应 的引物。
关键词：怀地黄；分子标记；扩增体系优化；sRAP；引物的筛选
中国分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2010)02—0256—05
Establishment 0f SRAP
Rehmannia glutinosa
l ● 一 - - ● I -
am plitication system [or
and primer screening
ZHOU Chun-E，GU Feng-Ping，LU Shu-Xia，
DUAN Hong-Ying，ZHOU YaD-Qing
(College of Li Science，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China)
Abstract：The single factor design was used to optimize SRAP amplification system of 22 Rehmannia glutinosa
lines in five factors(the concentration of template DNA，Taq DNA polymerase，primer，M g0+and dNTP)．
SRAP amplification system was established as follows：2．5 mmol／L Mg2+，0．3O mmol／L dNTP mixture，2．5
U Taq DNA polymerase，0．32,umol／L each primer，20 ng template DNA and 2．5 L 10 X PCR buffer in 25 L
SRAP reaction system were the best suitable PCR system． 1 2 primers were collected from 88 primers using
the optimized amplification system above．
Key words：Rehmannia glutinosa；molecular marker；optimization of amplification protocol；SRAP；primer screening
怀地 黄(Rehmannia glutinosa)是驰名 中外 的
四大怀药之一。因产于河南怀庆府而得名。河南每
年都有大量地黄产品销往国内外市场、出口东南亚
和日本等国。地黄已成为河南产区重要的经济来源
之一 。所以，国内外市场对怀地黄的品质 、纯度和地
道性提出更高要求 。然而，目前市场上地黄产品来
源较复杂 ，优劣品种混杂；仍采用传统的形态特征和
系谱来源对其分类研究和遗传分析已不太准确(周
俊英，2002)。为准确鉴定和使用怀地黄药材，克服
传统鉴定方法不易区分品种的不足，为其新品种选
育和育种提供分子依据，本实验利用 SRAP分子标
记技术对 22个怀区地黄材料进行种质多样性鉴定。
目前应用于地黄的遗传标记有 RAPD、SSR等(陈
京荔等，2002；周延清等，2004a，2004b，2005)，主要
用于种质资源评价、遗传图谱的构建、重要性状的标
记定位以及基 因定位克隆等方面。相关序列扩增多
态 性 (sequence—related amplified polymorphism，
SRAP)，是 由加 利 福尼 亚 大 学 蔬 菜 系 Genyi和
carlOS Quiro于 2002年提 出的一种基于 PCR的标
记技术(Li＆ Quiros，2001)。它是针对基因外显子
收稿日期：2008-12-22 修回日期 ：2009-08—14
基金项 目：国家高技术研究发展计划“863”项目 (2006AA100109)[Supported by National High-Tech Research Development Plan(2006AA10010g)]
作者简介：周春娥(1977一)，女 ，山西寿阳人 ，硕士，主要从事植物细胞工程与基因工程方面的研究，(E—mail)zhouchunel800@163．CON。
通讯作者(Author for c0resp0ndence)
2期 周春娥等 ：怀地黄 SRAP扩增体系的建立与引物的筛选 257
GC含量丰富而启动子 、内含子 AT含 量丰富 的特
点来设计引物对 ORFs(openreading frames)进行扩
增。 目前 ，SRAP已在马铃薯 、小麦 、油菜 、棉 花、西
瓜、柑橘、莴苣、芹菜、黄瓜、辣椒、菠萝、丹参、药用石
斛、毛木耳、坛紫菜、黄瓜等植物中研究应用(徐晴
等，2005；任羽等，2004；武志朴等，2005；樊洪泓等，
2008；许晓燕等 ，2008；潘俊 松等 ，2008)。但 SRAP
应用于怀地黄的研究未见文献报道。本研究探讨了
SRAP对怀地黄的适应性 ，并 建立 了适合怀地黄 的
扩增体系，为怀地黄基因图谱的构建及分子标记打
下坚实的基础。
1 材料与方法
1．1供试材料
用于 SRAP分析的怀地黄材料见表 1
表 1 供试地黄品种的名称及来源
Table 1 List of varieties and origin of Rehmannia glutinosa
编号 品种名称 来源 编号 品种名称 来源
Number Name Origin Number Name Origin
1 金状元 武陟 12 野生 2号 新乡
2 金黄后 武陟 13 85—5 武陟
3 串地龙 武陟 14 武陟 1号 武陟
4 小黑英 武陟 15 武陟 2号 武陟
5 9104 温县 16 武陟 3号 武陟
6 9302 温县 17 武陟 4号 武陟
7 北京 1号 武陟 18 武陟 5号 武陟
8 北京 2号 武陟 19 武陟 6号 武陟
9 北京 3号 武陟 2O 武陟 7号 武陟
1O 农家 武陟 21 武陟 8号 武陟
11 野生 1号 武陟 22 武陟 9号 武陟
优化反应体系所用的地黄为北京 3号。验证优
化条件所 用 的地 黄 为以上 22个 品种 ，其 中 9104，
9302取 自温县农科所 ，野生 2号取 自生物系花 园，
其余品种均取 自武陟四大怀药农科所 。
1．2方 法
(1)DNA提取 ：按 2 x CTAB方法提取基 因组
DNA，DNA 浓 度 及 纯 度 用 GeneQuant ProDNA／
RNA(GE Heahhcare)进行检测 。稀释至所需浓度
后 ，一20℃保存。(2)基本扩增反应体系 ：10×Reac—
tion Buffer(含 15 mmol／L Mg抖 )2．5 L，dNTP
Mixture(2．5 mmol／L each)2．5 L，Mg抖 (25
mmol／L)0．5 L，弓f物 (10~mol／L)0．8 L，Taq
DNA聚合酶(2．5 U／L)0．6 L，模板 DNA(57 ng／
L)l L，最后用 ddH O将总体积补至 25 L。(3)
扩增反应体系优化实验：根据香菇及相关作物研究
报道，设计 Mg 浓度 (1．5、2、2．5、3和 3．5 mmol／
L)、Taq DNA 聚 合 酶 (0．5、1、1．5、2、2．5 U／25
L)、引物 浓度 (0．24、0．28、0．32、0．36，和 0。40
／Lmol／L)、模 板 DNA 浓 度 (20、3O、40、5O、6O、700
ng／25 L)、dNTP mixture浓 度 为 0．15、0．20、0．
25、0．3O、0．35 gmol／L。5种 因素不 同水平梯度进
行相关实验。SRAP扩增反应在杭州大河科技有限
公司XP基因扩增仪上进行。94℃预变性 3 min，
然后前 5个循 环为 94℃ 变性 1 min，35℃退火 1
min，72℃延伸 1 min，后 35个循环仅将退火温度升
为 5O℃，最后 72℃延伸 7 min。用 Me6和 Em2引
物组合进行 PCR扩增以确定最佳反应体系。取 lO
~LSRAP扩增 产物 与 2 L溴酚 蓝混合后在 含有
EB(0．5 g／mL)2．0 的琼脂糖凝胶(1×TAE)上 电
泳，扩增图谱采用 OLYMPUS数码相机在紫外 270
nm 下拍摄 。(4)引物的筛选 ：本研究所用引物为 8
条正向引物和 l1条反 向引物，如表 2所示 ，一共可
组合成 88对引物 ，利用优化实验所确定出的最佳体
系筛选 出最佳引物对 。
2 结果与分析
2．1 SRAP-PCR反应体系的优化实验
Mg 是 Taq酶的激活剂 ，反应混合物中 Mg
浓度对 PCR反应的特异性和扩增效率均有影响 。5
种 Mg抖浓度下试验结果 (图 1)表明，Mg抖浓度为
1．5 mmol／L和 2．0 mmol／L时，扩增 结果 基本一
致 ，条带清晰，两者 比较 ，2．0 mmol／L时，特异性条
带扩增效果更亮。2．5 mmol／L和 3．0 mmol／L时
条带增多。由此确定 2．5 mmol／L为此扩增体系的
最佳浓度 。
Taq DNA聚合酶的用量过大会造成浪费，并且
会导致非特异性扩增；用量过小 ，会影响扩增效率，
降低扩增 产物 的产量 。因此 ，本试验对 Taq DNA
聚合酶的用量设 5个处理进行 了比较，扩增后的电
泳检测结果如图 2所示 ，泳道 3、4、5中仅有少数几
条主带，说明这 3个泳 道 Taq DNA聚合酶用量过
低；泳道 1和 2条带清晰明亮，主带较前 3个泳道明
显增多。而当 Taq DNA 聚合酶用量为 2．5 U时 ，
扩增条带进一步增多达到最多 ，清晰度也最好 ，主带
也明显增多。因此确定 SRAP扩增反应体系中Taq
DNA聚合酶的用量为 2．5 U 比较合适。
258 广 西 植 物 30卷
图 1 Mg +浓度对 SRAP扩增结果的影响
(test strain No．9，下 同)
Fig．1 Effect of different Mg +concentrations on
SRAP products from Rehmannia glutinosa
M．marker(Gene Ruler 100 bp DNA Ladder Plus)，the
same bdow；1，2，3，4，5：Mg concentrations were
1．5，2．0，2．5，3．0，3．5 mmol／L
图 2 Taq酶浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig．2 Effect of different Taq DNA polymerase concen-
trations On SRAP products from Rehmannia glutinosa
1，2，3，4，5．Taq DNA polymerase were 0．5．
1．0，1．5，2．0，2．5 U／25“L
引物用量少，与模板 DNA结合效率低，产物的
产量就会受到影响。引物用量过大，会增加非特异
性结合的机率；也会增加引物之间形成引物二聚体
的概率；本试验对 5个引物用量不同的试样扩增后
的电泳结果如图 3所示，北京 3号在供试 5个引物
浓度下，均能扩增 出一定的条带 ，随着引物浓度的升
高 ，扩增条带由弱到强 ，当引物浓度为 0．32／~mol／L
时，反应稳定 ，条带清晰。考虑到引物浓度过高会增
加引物二聚体 的形 成机 率，故 将 引物浓 度确定 为
0．32／*mollL为宜。
图 3 引物浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig．3 Effect of different primer concentrations on
SRAP products from Rehmannia glutinosa
1，2，3，4，5．Primer concentrations were 0．24，
028，0．32，0．36，0．4O~mol／L
模板 DNA对 PCR结果有重要作用，它的用量
关系着产物的产量和特异性。本试验对 6个用量不
同的模板 DNA扩增后的电泳结果(图 4)表明，在
25 L体系中加入模板 DNA浓度从 2O～7O ng均
有清晰的电泳条带出现，其结果稍有不同，加入模板
DNA 70 ng时 ，出现一条大约 2 000 bp的一条带，
但条带不清晰，随着用量的减少，逐渐模糊，但其它
条带变得清晰，用量为 20 ng时条带最为清晰，因此
认为加入模板 DNA浓度为 20 ng／25 L时，SRAP
2期 周春娥等：怀地黄 SRAP扩增体系的建立与引物的筛选 259
条带数丰富、清晰且稳定，故确定为最适浓度。
图 4 模板 DNA浓度对 SRAP扩增结果 的影响
Fig．4 Effect of genetic DNA concentrations on SRAP
amplification products from Rehmannia glutinosa
1，2，3，4。5，6．DNA concentrations were 70。60，
50，40，3O，20 ng DNA／25,uL
dNTP为 PCR中 Taq DNA聚合酶提供底物，
使得产物得以延伸。本试验对 dNTP用量不同的 5
个试样扩增后 的电泳检测结果 如图 5所示 ，5个泳
道 中均 有条 带 出现 ，dNTP浓度 为 0．3O mmol／L
时，电泳条带最为清晰。随着浓度的升高，一部分
dNTP竞争了 Mg 而使 Taq DNA聚合酶活性下
降出现条带缺失的现象。因此我们确定 dNTP浓
度为 0．3O mmol／L较为适宜 。
图 5 dNTP浓度对 SRAP扩增结果的影响
Fig．5 Effect of dNTP concentrations on SRAP ampli-
fication products from Rehmannia glutinosa
1，2，3．4，5．dNTP concentrations were 0．15，
0．2，0．25，0．30，0．35 mmol／L
2．2 SRAP—PCR反应体 系的确立
从结 果 稳 定 性 和 经 济 性 出 发，确 立 怀 地 黄
SRAP扩增最佳反应体系模板 DNA 20 ng，Mg 浓
度为 2．5 mmol／L，引物 0．32~mol／L，dNTP浓度
O．30 mmol／L，Taq DNA聚合酶 2．5 U，反应总体
积为 25 L。
以上述确定条件 ，用 Me8和 Em6组合引物在
22个供试地黄品种中进行扩增验证 (图 6)。可见扩
增谱带清晰，品种间有不同程度的多态性。
图 6 Me8和 Em6引物组合的 SRAP扩增谱带
Fig．6 SRAP products from 22 Rehmannia glutinosa varieties using primers Me8 and Em6(1-22 showed in table 1)
2．3 SRAP分子标记引物的筛选
采用 8条正向引物与 11条反 向引物 ，一共有 88
个引物组合，利用优化体系筛选出的引物一共有 12
对(表 3)，部分引物筛选结果(图 7，8)。从 图 7看 出，
Me8／Em5，Me8／Em6，Me8／Em7这 3对引物扩增中
的条带比较多而且清晰；从图8看出Me5／Em1，Me5／
Em3，Me5／Em4，Me6／Eml，Me6／Ern2，Me6／Em3这 6
对引物条带也比较多。所 以这 9对 引物可以用于怀
地黄 22个品种 SRAP遗传多样性 的研究，另外通过
其他组合中又筛选出 3对引物(图略)，一共是 12对
引物 。
4 讨论
影响 PCR扩增效果的技术环节主要包括扩增程
序、DNA的提取、扩增体 系和扩增产物的检测。通
常，扩增程序对 PCR扩增 效果影响较大，但是 由于
SRAP引物具有通用性，不同作物采用的引物组合往
26O 广 西 植 物 30卷
往是相同的，因此扩增程序对 SRAP—PCR扩增结果
影响不大。目前在SRAP-PCR中使用的扩增程序有
图 7 Me8和 Eml一11引物组合的 SRAP扩增谱带
Fig．7 SRAP products using primers M e8 and Eml一1 1
1，2，3，4．5，6，7，8，9．10，11．Me8／Eml，M e8／Em2，
Me8／Em3，Me8／Em4，Me8／Em5，Me8／Em6，Me8／Em7，
Me8／Em8。Me8／Em9，Me8／Eml0，Me8／Eml1
2种。第 1种是 Li& Quiros(2001)提出的退火变
温法，即最初 5个循环的退火温度设为 35℃，后 3O
个循环的退火温度升高为 5o℃。第 2种是 Budak
等(2004)所使用的程序：94℃变性 1 rain，47℃退
火 1 min，72℃延 伸 1 rain(35个 循环)，72℃ 5
rain。前者因为后 3O个循环中所用的退火温度比
后者高，扩增结果更稳定。本试验采用的扩增程序
与第 1种相近，最初退火温度为 35℃的循环数仍为
5，随后退火温度为 5O℃的循环数则设定为 35，获
图 8 引物筛选的扩增谱带
Fig．8 SRAP products of selecting primers
1。2，3，4，5，6，7，8．MeS／Eml，M e5／Em2。Me5／Em3，MeS／Em4，
Me6／Eml，Me6／Em2，Me6／Em3，Me6／Em4
表 3 筛选取出的引物序列
Table 3 List of the selected primer sequences
得了较理想的试验结果。
SRAP标记是基 于 PCR 标记系统 的，故 PCR
扩增体系中DNA、Mg抖、引物、dNTP Mixture、Taq
DNA聚合酶等各组分的用量会影响扩增结果。本
试验在优化 SRAP扩增体系时也发现 ，Mg 、引物 、
Taq DNA聚合酶作为 PCR扩增的原料，有一个相
对适宜的用量范围 ，浓度过低 ，不能满足扩增要求，
浓度过高 ，组分间可能会产生竞争 ，影响扩增效果。
在对模板 DNA进行优化时发现 SRAP扩增对模板
DNA的浓度要求不高，在实验中发现甚至 4 ng的
模板都可扩增出条带。这与任羽等(2004)、武志朴
(2005)的研究结果基本一致 ，说明 SRAP分子标记
对 DNA模板要求不高。
SRAP一般使用 PAGE 电泳 检测 PCR产物 ，
本试验采用琼脂糖凝胶电泳检测 ，亦获得较丰富的
多态性。本试验优化的 SRAP扩增反应体系在 22
个供试地黄品种中均获得稳定、清晰谱带，品种间表
现不同程度多态性。SRAP标记系统建立为该技术
在地黄等四大怀药遗传多样性、系统发育和育种研
究 的广泛应用奠定 了良好的基础 。
参考文献：
潘俊松，王剐，李效尊，等．2005．黄瓜SRAP遗传连锁图的构建
(下转第 273页 Continue On page 273)
2期 陈文娟等：半制备高效液相色谱制备 5种苯乙醇苷类单体 273
mm×250 mm，5 m)半制备色谱柱上，以甲醇一水为
流动相，流速为 4 mL／min，采用梯度洗脱方式，在
较短的时间内(26 min)一次可从牛耳朵中制备分离
得到5种苯乙醇苷类单体，高效液相色谱分析表明
所制备的 5种化合物 的纯度均 高于 98 。该方法
具有操作方便、高效、经济的特点，制备的 5种苯乙
醇苷类单体均可作为对照品。
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