全 文 ：广 西 植 物 2l卷
[25：Bitters W P．Murashige T ， al Investigations on
established virus free p Lants through tissue culture
_A]．Calif．Citrus Nurserymen’s Soc．．1970，9：27
～ 30
[26]Juavez J，Navarro L and Guardida J I _Obtention de
plantes de divers cu[tlvars de demontiniers au moyen
de la culture de nucelle in vitro_J] Fruits，1976．
3l：751～ 762
[27]Navarro I ，Juarez J．Pina J A and Ba]lester J F The
citrus quarantine station in Spain[A]．Riverside：
Pro：．9th Cont．IOCV(in press)．
[28]Button J and Bornman C H D relopment of nucelar
plants from unpoilinated and unfertilized ovules of
Washington navel orange in vitro[J]．J．S Aft．
Bo1．，l971，37：l27～ l34
[29]Koehba J。Spiegel Roy P and Safran H A d1-enti~‘e
plants from ovules and nuceIli in Citrus[J]．Planta．
1972，lo6：237～ 245
(30]Kochba J，Buton J，Spiegel—Roy P，et a1．Stimula—
lion of rooting of citTus embryoids by gibberelie add
and adenine sulphate[J]．Ann．Bot．，1974，38：795
～ 802
[31]Roistacher C N．Detection of citrus viruses by graft
transmission：a review[A]．Riverside：In．Proe
7th Conf．IO(2V ，l975，lOCV，l75～ 185
[32]Quak F．Meristem culture and virus—free plant．In．
F．Reinert＆ Y．P．S．Bajai(eds．)．P]am Celtis—
sue and organ cut[re[M]．Berlin：Springer—Verlag，
1977，598～ 615
[33]Robaeker C D and Chang C J Shoot—tip culture of
M uscadine grape to]eiminate pierce’s disease bacteria
。 [J]．Hortscience，1992，27(5)：449～450．
[343王际轩，李 敬珍 ，隋世琴等．苹果组织培养苗离体
嫁接的研究口]．园艺学报，1985，12(3)：15l～l5 7
[35]薛光荣，扬振英，洪 霓等．茎尖培养等处理脱除
攀病毒的技术研究[J]．中国果树，l995，3：9～11
C38]洪 霓，王国平，张尊平等．巢病毒脱除技术研究
[J]．中国果树，1995．4：5～7
[37]Grum M ，Camloh M ，Rudolph K and Ravnikar M
Elimination of bean seed—borne bateria by ther—
motherapy and meristem culture[J] Plant Cell Tls
sure and Organ Cullure，1998，52：79~ 82．
[383陈菁瑛 ，胨景耀．龙眼茎尖离体培养及其脱毒效果
口]．植物生理学通讯．1996，32(2)：126～13i
[393 Navarro⋯I ．Roistacher．C．N．，and Murashige．
T ，l976．Efect of size and source of shoot tips on
psorosis-A anal exocortis content of navel orange
plants obtained by shoot_【lp grafting in vitro[A]．
Riverside： In． Proc． 7th Conf． IOCV． 1975．
IOCV，194～ 197
[403高原利雄等 简易茎尖嫁接法脱柑桔病毒_J] 果树
试验场报告，l986．8：13～24
[41]Navarro L，Jucurez J．Ballester J F and Pina J A．E一
]imination of some citrus pathogens producing psoro—
sis—like leaf symptoms by shot—tip grafting in vitro
[A ．Riverside：In．Proe．8th Conf IOCV，]975，
198O，l62～ l66
(42]Mukhopadhyay S，Jaishree Rai，Sharma B C，eL a1．
Micropropagation d Dar)eeling orange(Citrus retieu一
[ata Blanco)by shoot—tip grafting[J]．Journal of
Hortscience．1997，72(3)：493～ 499
(43]李耿光，胡兰娟，黄群声等 柑桔 茎尖培养的韧步
研究[J]．植物生理学报，1978，4(2l：189～l9
[443赵学源，蒋元晖，李世菱等．我国柑桔栽培品种的
裂皮病的鉴定与脱除_J]．园艺学报(Acta Horticu]．
ture Sinica)，l986，13(2)：91～ 94
[45]蒋元晖，邱柱石 ．苏维芳，赵学源．利用茎尖嫁接脱
毒 培养无裂皮病的脐血橙[J]．植物保护学报，
1983，10(8)：l66～ 168
(46]蒋元晖．谈谈柑桔茎尖嫁接技术[J]．中国柑桔，
l987，2：l5～ 16
[473张秋胜，舒广平．宁顺华．柑桔茎尖嫁接技术的改
进[J] 中国柑桔，1991，20(2)：1l～l3
[483 Fengtong Ma，Chunhui Guo，Yurong Liu，eL a1．In
vitro shoot—apex grafting of Mulbrry (Morus alba
L．．)[J]．Hortscie~ce．1996，31(3)：460~462
[49]王国平．德国果树病毒病研究及防治考察口]．中国
果树 ，199l，47(1)：55～56
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广 西 植 物 Guihaia 21(1)：59— 62 2001年 2月
番木瓜叶片愈伤组织形成、分化
及再生植株移栽
朱西儒 ，张云开
(中国科学院华南植物研究所 ，广东广州 510650)
摘 要：研究了番术瓜的叶片愈伤组织的形成，并进一步诱导分化．离体培养成完整的试管植株．这对深人
进行体细胞突变育种．以及抗病毒品系筛选和种质改良或耐贮藏等基因转化 ，提供了有用的拄术和方法。
美键词：番术瓜(Carla papaya L)；叶片；愈伤组织形成 ；植株再生
中围分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2001)01—0059一O4
The formation of cai I us from papaya l eaf and
its generation induced and transpl anting
the pi antl ets with roots
ZHU Xi—rL1．ZHANG Yun—kai
( 叫 China Imtitute of Botany．Acadenda Si~ca．Guangzhou 510650，China)
Abstract The formation of callus from papaya leaf and the generation induced the tube seedling plantlets were
studied in thi~／paper．It was one useful way and method of the gene trans—formation to papaya ring-spot virus
(PRV )and to screening lines with storing for long time and good quality．
Key words：Papaya(CaHca papaya L)deaf；formation of callus；generation induced the plmatlets
番木瓜(Carica papaya L)是华南及台湾、福
建和云南部分地区特有的一种热带、亚热带常绿
果树“ ”，在我国，大约已有 70多年的栽培历史。
其果产量高、色美味鲜，而且富含糖和维生素，尤
其是木瓜蛋白酶(Papaw)．营养价值较高。所以，
它既可 以作为新鲜水果食用，又能够人菜煲汤。
重在益脾健胃和帮助消化，治疗十二指肠 胃溃疡
病．产妇 多食可以增加乳汁。木瓜凝乳蛋 白酶
(Chymopapaw)的医用价值更高，对人的“腰脊椎
盘突出症”疗效显著，可避免动手术之疾苦“ ”。
近年来 ，我们已经分离、纯化上述两种酶，还获得
其中含有的“融苗酶 ”。对促进伤口愈合，防止感
染，以及水果和食品保鲜都有重要意义。
番木瓜叶片愈伤组织的形成，并进一步诱导
分化，离体培养成完整的试管植株，对深人进行
体细胞突变育种、以及抗病毒品系的筛选、种质
收稿 日期 ：2000一Ol一06
作者简介：朱西儒(1950一)，博士，副研究员 ．主要从事番木瓜、香蕉病毒病拉 铡技术、组织培养 厦荔枝保鲜和生物防治等工作
基金项目：广东省“八五 攻关资助项 目(950645)
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60 广 西 植 物 21卷
改良或耐贮藏基因转化，是一项有用的技术和方
法““ 因为，目前国内外尚无抗番木瓜环斑病毒
(Papaya rlngspot virus，PRV)的品系资源，包括许
多野生种也易感染此病“’ 。 ，唯一途径是依靠基
因转化手段 ，利用病毒外壳蛋白基因(cp—gene)进
行遗传转 化，获 得抗 病毒植株 已有成 功 的先
例。 “ 。
叶片作为转基因的受体，由于取材方便．特
别是“叶圆盘法”基因转移方法的创立“ ，已得到
广泛使用。 。番木瓜茎尖和侧芽的离体培养已
获得成功。 ．但是，叶片诱导分化成植株 ，还未
见报道。
1 材料和方法
1．1材辩
用番木瓜品种 ：“穗中红”无菌试管苗幼叶，
作为离体培养的外植体。
1．2方 法
除去叶柄，将叶肉组织切成 2～5 llnl 小块，
在不同培养基上诱导分化，观察其生长变化。
1．3培养基制备
以MS培养基为基本培养基 ，经过改良(调节
氨态比倒)，附加有椰子乳 (cw)10 ，以及 2，4一
D BA。 和 NAA ，蔗糖或葡萄
糖 3 ，琼脂 0．6 。
1．4培养条件
培养室温度 25～28℃，光照(2 000 3 500
ix)，除愈伤组织的诱导开始进行暗培养 5～7 d
以外 ，其余处理都是每天光照 12～14 h。
2 试验结果
2．1不同2，4一D浓度对敷伤组织形成的影响
每一试验处理用改良的MS基本培养基，添
加不同浓度的激素比例，配制250 mL培养基，分
装 lO个小三角瓶 ，每瓶接 5～6块外植体。然后．
培养 3～6周，观察其愈伤组织的形成及生长势
(图版 I)。每批试验重复 5～6次，统计试验结果
见表 1。
结果表明：使用 2，4 D 。BA¨NAA 比较理
想，其形成的愈伤组织紧密，呈现绿色半透明状．
进而产生球形胚状体。当浓度达 到 2，4一D 。+
BA +NAA 时．贝0出现大量白色霜状组织块，
很少产生球形胚状体。
2．2不同碳源种类与浓度对愈伤组织形成的影响
使用不同种类与浓度的碳源，对愈伤组织形
成会产生较大影响。因此 ，比较了蔗糖和葡萄糖
对番木瓜叶片组织培养产生的效果，其中，使用
2．4一D + BA + NAA 配方．培养条件如上
所述。结果见表 2。
表 1 不同 2，4一D浓度对愈伤组织形成的影响”
Table 1 The influence of diflerence 2，4一D
concentration to the calus formation
激索浓度
Hotrtor rate
(mg L’) 篓毳篓 錾组 R ateGr*ow势th(-KTi~uesCalus织(块)形成)⋯生长 ，^tmaJ‘m
2，4-D rBA NAA 248 1O3
2，4-D BA ．NAA 256 l 16
2-4 D ⋯BA NAA 250 I28
2，4-D ⋯BA ；NAA ． 258 150
2，4-D 。BAn sNAA Jn 260 145
41．5 +
45 3 +
51 2 + +
58 l + +
55 8 + + +
”污染数除外 + 少量 ++绿色．质地蟹密 +++丈量
表面有白色霜状组织层。
Except poluted buds；”+ a litte g+ + green．Inseparable
quatity of materiah+ + + lot of eatus like white[rost
表 2 不同碳源种类与浓度对愈伤组织形成的影响
Table 2 The influence of dif[erence concentration
sugar to the calus[ormation
污染敢 腙丹 ； + 少 量 + +缔 色 质 地 紧密 + ++丈 量
表面有 白色霜状组织层
” Except polluted buds； + a tittte~+ + green．Inseparahte
quatity of materiatl一 + + lot of catuslike white~rost
试验表 明：使用 3 的葡萄糖或 3 ～4 蔗
糖 比较好 当提高使用浓度时，就会出现大量白
色霜状愈伤组织层，不够结实，难以诱导产生球
形胚状体
2．3不同 BA浓度对愈伤组织诱导分化的影响
将上述培养获得的结构紧密 ，呈现绿色半透
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1期 朱西儒等：番木瓜叶片愈伤组织形成、分化及再生植株移栽 61
明状的愈伤组织，进一步在含有 BA 和 NAA
的 MS培养上，比较不同 BA浓度对不定芽产生
的影响。观察结果见表 3。。
表 3 不同 BA浓度对愈伤组织诱导分化的影响“
Table 3 The nfluenee Of d fferenc~c0ncentration
BA tO buds induced from the calus
”表 内对污染 敢不 作统计 Except po Luted buds
从实验结果可以看出，BA使用浓度在 0．5
时，其诱导分化率最高，达到 85．8 (图版 I)。多
数从叶片与叶柄切口处形成胚状体，或者在叶缘
直接产生不定芽 但是，凡是出现白色霜状组织 ，
尽管生长比较快，始终不会产生球形胚状体。它
也无不定芽的分化能力，随着培养时间的延长，
发生褐变而枯死
2．4不同NAA浓度对愈伤组织诱导分化的影响
在固定 BA使用浓度 0．5时，比较不同 NAA
浓度对愈伤组织诱导分化的影响。结果发现在使
用NAA 时 诱导分化率达到 73．9(表 4，图版
I)。
表 4 不同 NAA浓度对愈伤组织诱导分化的影响
Table 4 The ird[uence of diffelence concentration
NAA to huds Induced from the calus
”表 内对污染 散 不怍 统 计 Except poluted buds
2．5番术瓜叶片愈伤组织不定芽的根系诱导
分化
将诱导发生的不定芽．分别移植在 1／2 MS
培养基上．除去 2，4一D，添加有 1 的活性碳和不
同浓度 IBA+比较对试管不定芽根系发生的影响，
结果见表 5
从表 5结果看 出：使用 IBAO．10的效果最
好．出根率达到85．2 。当超过 IBA0．25时，虽然
出根率不低，但根系愈伤组织化，如同海绵状，松
软、易烂 ，很难移栽成活。
2．6番术瓜叶片愈伤组织诱导分化的小植株移栽
移裁成活是试管苗的主要难关 ，特别是番木
瓜诱导分化的小植株 。成功与否取决于根系的质
地是否紧密．叶片愈伤组织诱导分化的小植株移
栽成活，需要经过在营养液内保湿培养 3～7 d练
苗，最后，移栽到沙+泥炭土中，其成活率可以达
到71．3 (表 6，图版 I)。
表 5 番木瓜叶片愈伤缉龋不定芽的根幂诱导分化
Tab】e 5 The diferentlal roots of buds induced
from the calus of papaya leaf
污染数障外}”+ 步量；++晕色 。质地譬密；+++大量．
表面有白色霜状组织层。
Except pa tuted buds； + a little}+ + green，Inseparable
qua~ty of rnateria[；+ 4-+ tot of calus like white frost
表 6 番木瓜叶片愈伤组织分化的小檀株移栽”
Table 6 The survived palntlets induced from the
callus ot papaya leaf in transplantation
试验重复 5次 Test repeat 5 5rues
2 讨 论
叶克难等(1991)研究过番木瓜悬浮培养的体
胚发生以及植株再生 ，但是未报道移栽成活
率。本试验首次用叶片组织切块离体培养．诱导
分化并再生成植株。愈伤组织的质量与分化力关
系密切，不仅必须是绿色，而且愈伤组织应紧密、
结实，才可以诱导分化。同时发现先出根的．就难
再生不定芽；相反+先出芽后出根的，就能够培养
成完整小植株
本研究初步获得较高的移栽成活率+认为番
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62 广 西 植 物 21卷
木瓜再生小植株的根系质量是其关键因素。凡是
根系生长不紧密，尽管诱导产生有大量根毛，仍
然难以存活，最后会因根茎连接处愈伤组织容易
感染病菌而死亡。为克服根系不正常，采用降低
IBA浓度，添加一定量的活性炭，基本可以消除此
种现象，提高小苗移栽成活率，在其它植物中也
有成功的报道“ 。这将对进一步深入研究抗 PRV
的 cp基因转化，或利用遗传工程技术，培育出高
产、优质番木瓜新品系有重要意义。
参考文献：
[1] 卜学贤，陈维伦．活性炭对培养基中植物生长调节物
质的吸附作用口]．植物生理学报，1988，14(4)：401～
40S
(2]朱西儒．范怀忠，冯志萍等_番木瓜茎尖哈侧芽的离体
培养(简报)[J]．植物生理学通讯，1989，(s)：49
[3]朱西儒，张云开，张海保等．番木瓜杂交座耔与了芽及
F1代的环斑花叶病调查研究口]．广西热作科技，
1999，(2)：5～ 8
[43刘 卫，朱西儒．番奉瓜酶动力学的研究ED]．《中国
科学院华南植物研究所硕士学位研究论文》，1997，
PP．1～ 53
(83朱利显，吴显荣．两种因化木瓜蛋白酶的研究Eli．西
南农业大学学报，1983，15(3)：262~268
(6]李潮生．木瓜蛋白酶产业之开发口]．福建热作科技．
1988，(3)：18～ 21
[7]张云开．朱西儒，张海保等．两个番木瓜品系的比较初
报[J]．广东农业科学，1994，(2)：23～25
[83广西重要研究所．番木瓜[A]．在《广西药用植物名
录》，南宁 ：广西人民出版社，1983，PP 1．53
[93陈枝捕，范怀忠．番木瓜环斑病毒在番木瓜原生质体
中复制的初步研究[J]．中国病毒学报．1993，8(3)：
263～ 270
[IO3叶克难，马 蕾，李宝健．番木瓜悬浮培养的体胚发
生和植株再生[13 植物学报，1 991．8(3)：263～270
[11]杨乃博．几种母奉植物的组织培养及器官发生[J]．
植物生理学通讯，1 982．(4)：23~27
[12] Beachy R N． Coat protein．mediated resistance a
gainst virus infection[J]Ann- ．Phytopathology．
28：451～ 474
[133 Conover R A tLits R E．Breeding for resistance to p
paya ring spotⅥrus[J]．Phytopathology，1983，73
(1)：121～ 124
C14]Hoeseh R B．A simple and genera[method for trans
letting geⅡ into plants[J]．Science，1986，227：
1229～ l231
[15] Powel Abel R． Delay of disease development in
transgene plants that the tobacco mosaic virus coat
protein口]．Science，1 985，232：738～743
C16]Shah D M．The introduction of foreign genes in
plantsEJ]．Biotechnology and genetics engineering r —
vietvs，]987，S：8]～98
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朱西儒等 ：番木瓜叶片愈伤组织形成 、分化及再生植株移栽
ZHU Xi rkL．et n ．：The formation of calus from papaya leaf and its
generation induced and transplanting the plantlets with roots
番木瓜叶片愈伤组织形成与不定芽的诱导分化
The callus formation and differential buds induced from papaya leaf
(箭头 ：球形胚状体：不定芽 Global embryo：buds)
图版 I
Plate I
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朱西儒等 ：
ZHU X ru． 日
版 Ⅱ
PlateⅡ
番木瓜叶组织诱导分化的有根试管小苗及移栽成活
The survived plantlets lransplanted the tube seedling with roots induced from lhe callus of papaya leaf
A．试管小苗(愈伤组织化根)Calus roots~edling；B正常根系的诱导 Normal lOOtS seedling；
C、D 试管苗移栽成活 The survive of tube seedling transplanted
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