全 文 ：广 西 植 物 Guihaia (1)：95— 99 2OO7年 1月
病毒侵染对转 SCMV-CP基因甘蔗
光合速率和活性氧代谢的影响
姚 伟1，z*，段真珍1，陈义强2，何正权1，张木清2，陈如凯2
(1．三峡大学 生物技术研究 中心 ，湖北 宜昌 443002；2．福建农林大学 农业部甘蔗
生理生态与遗传改良重点开放实验室，福建 福州 350002)
摘 要：对转SCMV-CP基因甘蔗叶绿素含量、光合参数、活性氧代谢有关的酶活性进行了测定分析，结果表
明转基因甘蔗由于外源 CP基因的导人，病毒在植株体内无法正常复制繁殖 ，从而保护了植株细胞免受因病
毒侵染造成的伤害。未转基因甘蔗接种后病毒迅速繁殖蔓延 ，受害叶片对活性氧清除能力的下降，促使有毒
物质活性氧的积累，启动膜脂过氧化 ，造成膜的损伤 。
关键词：甘蔗；花叶病毒；活性氧代谢
中图分类号 ；Q945 文献标识码 ；A 文章编号：1000—3142(2007)01—0095—05
Effects 0f virus infection 0n the photosynthetic
rate and reactive oxyaen m etaboltsm 0t · 1 』● 』 l ‘ n
transgenic sugarcane with SCM V-CP gene
YA0 Wei1，2 ，DUAN Zhen-Zhen1，CHEN Yi-Qiang2，
HE Zheng-Quan1，ZHANG Mu-Qing2，CHEN Ru-Kai2
(1．BiotechnologyResearch C_~?ltre，ThreeGorges University，Yichang 443002。China；2．Keylw．b ofEco-physiology&Genetic
Improvement for Sugarcane，Ministry of Agriculture，Fujian Agriculture and Forestry University，FuAou 350002，China)
Abstract：Through the analysis of chlorophyl，parameter of photosynthesis and em yme in the metabolism of reactive
oxygen species，a conclusion was drawn that the transformants of CP gene can protect sugarcane cel from the virus
damage．But in the nonfansgenic sugarcane plants，the virus spreaded OUt after inoculation，and the tissues were seri—
ously damaged by the accumulation of harmful active oxygen．
Key words：sugarcane；mosaic virus；active oxygen metabolism
甘蔗花叶病(Sugarcane mosaic disease)，又称甘
蔗嵌纹病，是一种严重危害甘蔗生长的世界性病害
(周仲驹等，1989)。作为一种高度杂合的无性繁殖作
物，甘蔗遗传背景非常复杂，一般表现为异源多倍体
和多倍的非整倍体，其染色体数目多，基因组巨大，在
不同种间或同一种内的不同类型之间染色体数目差
异很大，从 2n=54到多的2n=128(秦新民等，1989；
李素丽等，2004)。在甘蔗栽培种的种质中表现缺乏
许多重要的抗性性状，所以要想通过常规的杂交育种
方法在优良品种中引入抗性基因是非常困难的(Ar—
encibia等，1997)。转基因技术的日趋成熟在这方面
开辟了一条全新的途径，使在优良品种中导入目的基
因进行品种改良成为可能，形成了一种高效的育种方
法。自从 Powel等成功地将 TMV外壳蛋白导入到
收稿日期；2006-06—27 修回日期 ：2006—10—28
基金项目{国家“863”高技术研究发展计划项 目 (2002AA241031)[Supported by National High Technology Research and
Development Program of China(2OO2AA241O31)]
作者简介：姚伟(1977一)，男，湖北宜昌人 ．博士，主要从事植物生物技术方向的研究 ，(E-mail)yaoweimail@163．com。
通讯作者(Author for correspondence)
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96 广 西 植 物 27卷
烟草，获得了抗烟草花叶病毒 TMV侵染的转基因植
株以来(Powel-Abel，1986)，到目前为止，已有很多个
植物病毒组的病毒的 CP基因成功转入多种植物中
去。我们于 2003年成功地将 SCMV-CP基因导入甘
蔗中，获得了抗病毒的转基 因甘蔗植株(姚伟等，
2004)。本试验的主要目的是分析比较抗病毒转基因
植株在光合速率和活性氧代谢上的变化，以期为探讨
其抗病机制奠定基础。
1 材料和方法
1．1材料
已转入 SCMV-CP基因的甘 蔗 Badila亚无性系
一 代及转基因的供体材料作为对照(Badila原种和组
培苗)。材料种植于福建农林大学农业部甘蔗生理生
态与遗传改良重点开放实验室的网虫室内。
1．2病毒粗提物
用于田间病毒接种的病毒粗提物的制备参照周
仲驹等(1989)方法：严重感染花叶病的病叶加 3倍量
的(v／w)0．1 mol／L pH7．2含 NaSO3的磷酸缓冲液，
经高速组织捣碎机捣碎 5 min，双层纱布过滤榨汁或
15 000 g离心 i0 min，取上清。
I．3叶绿素含量及其光合参数的测定
1．3．1光合参数的测定 幼苗长至 9—10片真叶时，光
控条件下(PAR=1 000 t~mol／(mz·s))，用 CI301PS
型便携式Co2气体分析系统活体测定 4个光合参数：
光合速率(Pn)、蒸腾速率(E)、气孔导度(C)、和胞间
C02浓度(CO2int)，连续观测 3次，取平均值作为观
测值。
1．3．2叶绿素含量的测定 参照陈福明等(1984)的混
合液法，称取待测叶片0．1 g，用 8O 的丙酮溶液避光
抽提，直到叶片发白为止。然后用核酸蛋白测定仪测
定 645、625 m 和 663 nnl处的 0．D．值，根据公式计
算出叶绿素a、叶绿素b以及叶绿素总含量，各设 3次
重复。
1．4 P(D、S0D、CAT、MDA的测定
选择生长一致的转基因植株亚无性系、组培苗和
原种苗进行接种处理，同时以接种磷酸缓冲液为对
照，分别在接种后 0、2、4、6、8、10d取样，测定其过氧
化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(S0D)和过氧化氢酶
(CAr)的变化。参照梁和等(1995)的方法提取粗酶
液。称取待测叶片 1 g，用 5 mL冰冷的 0．05 mol／L
的磷酸缓冲液(pH7．0)和少量石英砂冰浴研磨，匀浆
后 4℃下 8 000 g离心 15 min，上清液用于测定过氧
化物酶(P0D)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶
(CAT)的活性。酶液 的蛋白质含量测定采用考马斯
亮兰法(Bradford MM，1976)。
过氧化物酶 (POD)酶活性测定参照李杨瑞
(1990)的方法进行；POD同工酶分析采用聚丙烯酰胺
凝胶电泳法，参照袁晓华等(1983)的方法进行；超氧
化物歧化酶(S0D)活性的测定参照 Giannoplitis等
(1977)方法进行；过氧化氢酶(CAT)活性的测定参照
波钦诺克等(1981)的方法；丙二醛(MDA)含量的测
定按照 Heath等(1968)的方法进行。
2 结果和分析
2．1叶绿素含量及其光合参数的变化
当转基因Badila长至 9～10片叶子时，测定其叶
绿素 a．b及总叶绿素含量，如图1所示。
3．50
3．O0
ho
2．50
E
2．00
捌
郇 1．50
古 o
． so
0．O0
； = 兰 兰 兰量 §耋 量兰 量量萋娄
图 1 转基因及未转基因 Badila叶绿素含量的比较
Fig．1 Comparison of chlorophyll in
transfl0rmant and untransfotruant
由图 1可以看出，转基因 Badila叶片中叶绿素含
量明显高于未转基因的Badi1a组培苗，未转基因的
Badila原种苗最低。由此表明，由于病毒的侵染，未
转基因Badi1a体内叶绿体破坏比较严重，叶绿素含量
低，而转基因 Badila体内由于导入了 CP基因，能阻
止外源病毒的入侵，叶绿体没有遭到破坏，其叶绿素
含量维持在较高的水平。主要光合参数测定，也得到
同样的结果(表 1)，转基因Badila的净光合速率高于
未转基因的组培苗和原种苗。
2．2 P(m 酶活性的变化
图2结果表明，未接种时，转基因 Badila叶片内
POD的活性稍高于Badila组培和原种苗，接种后 4～
8 d，转基因和未转基因Badila叶片的POD活性都有
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1期 姚伟等：病毒侵染对转 SCMV-CP基因甘蔗光合速率和活性氧代谢的影响 97
增高的趋势，但未转基因 Badila的增高幅度大于转基
因Badila，组培和原种苗增高幅度接近。随后转基因
Badila的POD活性呈现下降趋势，而未转基因Badila
的POD活性有继续增高的趋势。
表 1 转基因及未转基因 Badila光合参数的变化
Table 1 Variations of photosynthetic parameters
in transformant and untransformant
株系
Strain
蒸腾速率(E)
Transpira-
tlon rate
(mmol·
Ilr2·KI)
B1 13．1O 1．O1
B2 14．12 1．19
B4 14．63 1．35
B12 1O．54 1．12
B15 16．43 1．52
B19 16．32 0．99
B23 14．70 1．14
B31 15．05 1．22
B36 16．25 O．89
B38 13．58 1．54
B42 2O．36 O．96
B48 12．63 1．93
B51 19．23 0．85
原种 Ul卜 7．26 1．95
transformant
组培 Trans-9．05 1．81
formant
97．5O
98．3O
100．23
94．9O
112．5O
11O．25
97．75
103．50
107．65
95．59
116．40
143．55
123．96
87．40
37．56
81．3O
75．9O
86．6O
70．54
23．1O
73．3O
54．68
32．5O
89．32
24．2O
78．23
85．63
88．25
注：三次测定结果的平均值。Note：The average of three tests．
600
500
0 2 4 6 8 10
病毒接种后天数／d
图 2 接种后甘蔗叶片内POD活性的变化
Fig．2 Changes of peroxidase activity in
sugarcane Ieaves after inoculation
At，Yt。zl：分别为接种病毒后的转基因 Balida、Balida原种苗和
Balida组培苗；Ap，Ylp，zp：分别为未接种病毒的转基因 Balida、
Balida原种苗和 Balida组培苗．下同。
At·Yt，Zt：Transformant，original seedling．test-tube plunder after
inoculation；Ap，Yp-zp：Transfomant，or~nal seedling ，test-tube
plantlet without inoeulatiorL The s哪 e as folows．
可能由于病毒粒子侵染后破坏了膜的正常结构
与功能，生物膜系统受损，细胞膜透性增加，酶与底物
无控制地接触 ，从而表现为酶促反应加速 ，酶活性提
高。可以认为，接种 POD后，甘蔗叶片体内POD活
性的提高是膜系统受到伤害的结果，而转基因甘蔗具
有较高的 POD活性，由它催化所形成的木质素和植
保素等次生抗性物质足以抵抗和限制病毒粒子的侵
入和扩散。
2．3 POD同工酶谱的变化
同工酶分析的结果 ，如图 3所示 。从图 3中可以
看出，未 接种时 ，转 基 因与未转基 因 Badila叶片 内
POD同工酶谱带基本一致，但在病毒接种后，转基因
Badila在接种后第 2天即出现一条新的酶带，持续出
现直到第 1O天酶谱带消失。而未转基因Badila在该
区没有出现该酶带，在接种后第 6天，Balida组培苗
出现特异酶带的上方区域出现了新的酶带，Balida原
种苗到接种后第 8天也出现了该酶带，而且随接种天
数增加而增强，这一结果与 POD酶活性测定结果基
本一致。
图 3 接种后甘蔗叶片内POD同工酶电泳图谱
Fig．3 Isozyme pattern of POD in sugarcane
leaves after inoculation
Ao-lO-YO-10，ZO-10：分别为转基因 Badila、Badila原种苗和
Badila组培苗接种后天数。
A0-10，Y0-10，ZO-10：Days after inoculation for transformant，
original seedling and test-tube plant．1et respectively．
2．4 SOD活性的变化
随着病毒接种天数的变化，转基因和未转基因
Badila体内SOD活性也发生了不同变化，结果如图4。
由图可以看 出，接种后 2 d，转基 因 Balida叶片
内SOD活性迅速上升，到第 4天达到最大，随后逐
渐下降，最后接近未接种前的水平。而未转基因
Balida开始 SOD活性缓慢上升，到第 6天达到最大
值，随后也呈现下降的趋势。
2．5 CAT活性的变化
在接种后，转基因与未转基因 Badila体内CAT
酶活性都有所变化，如图 5所示。转基因Badila叶
片中，CAT活性在接种处理后变化幅度比较大，而
暇嘶胞 C㈣噼．一～一～
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病毒接种后天数／d
图 4 接种后甘蔗叶片内 SOD活性的变化
Fig．4 Changes of SOD activity in sugarcane
leaves after inoculation
Badila的组培和原种苗的CAT活性没有发生太大
的变化。
蜒
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o
0 2 4 6 8 10
病毒接种后天数／d
图 5 接种后甘蔗叶片内CAT活性的变化
Fig．5 Changes of CAT activity in sugarcane
leaves after inoculation
2．6 MDA含量的变化
抗病反应中，高水平积累的活性氧和迅速升高
的脂氧合酶(Lipoxygenase，Lox)活性可直接攻击膜
系统中的不饱和脂肪酸．导致膜脂过氧化的发生，表
现为 MDA的积累，由图 6可以看出，病毒接种后，
未转基因 Badila叶片内的 MDA含量上升幅度很
大，在接种 10 d后仍然保持较高的水平，而转基因
Badila的MDA变化不大，在接种后 6 d开始下降，
逐渐恢复至接种前水平。充分说明当受到病毒侵染
后，未转基因品种膜系统受到的破坏严重，膜脂的过
氧化使得 MDA大幅上升，而转基因品种因为导人
了 CP基因，病毒的侵染受到控制，膜系统受到的破
坏较小，MDA含量变化不大。
3 讨论
植物在正常情况下，体内产生活性氧与清除活
性氧保持平衡状态，使植物免受伤害。当植物病毒
10
，、
8
耋
掣 LI-．6
舌 O 4
暑
2
0
0 2 4 6 8 1 0
病毒接种后天数／d
图 6 接种后甘蔗叶片内 MDA活性的变化
Fig．6 Changes of MDA content in sugarcane
leaves after inoculation
侵染或其它逆境胁迫时，细胞内原有的活性氧产生
与清除平衡会遭到破坏，造成活性氧和自由基的累
积，直接攻击膜系统中的不饱和脂肪酸。直接或间
接地启动膜脂过氧化，导致膜的损伤和破坏，表现为
MDA的积累，对生物体起着毒害作用。同时植物
体内也存在清除活性氧的酶(SOD、POD、CAT)和
非酶物质(GSH、AsA、Ve、类胡萝 卜素)两类防御系
统。SOD能催化超氧阴离子 自由基歧化成 HzO ，
而 POD、CAT能清除 H Oz，把 HzO2还原成没有
毒性的水(逯明辉等，2005)。本研究对转 SCMV基
因和未转基因的Badila进行病毒种处理后，在病毒
诱导下，植株体内清除活性氧的酶活性发生了变化。
在转基因的Badila体内，由于外源CP基因的导人，
可能对 SCMV病毒的侵染产生了很高抗性，使病毒
在植株体内无法正常复制繁殖，从而保护了植株细
胞免受因病毒侵染造成的伤害。未转基因 Badila
不具有病毒抗性，接种后病毒迅速繁殖蔓延，受害叶
片对活性氧清除能力的下降，可能促使有毒物质活
性氧积累，启动膜脂过氧化，造成膜的损伤，因此膜
脂过氧化产物丙二醛(MDA)含量不断增加。而转
基因Badila具有很高的酶促保护能力，活性氧代谢
反应迅速启动，未造成活性氧的积累，从而保护细胞
膜系统免受损害。POD是植物体内最重要的氧化
酶，能催化脂肪酸、芳香胺和酚类物质的氧化，是木
质素合成的关键酶之一，还参与乙烯的生物合成和
氧自由基的消除反应，其与植物的抗性密切相关(顾
龚平等，2000；杨涛等，2004)。病毒接种处理后转基
因与未转基因品种中POD活性都升高，但转基因品
种升高的早且幅度比未转基因的大。从第8天开始
转基因品种 POD活性有下降的趋势，而未转基因品
种继续保持上升的趋势；POD的同工酶谱分析结果
与POD酶活性测定结果基本一致，转基因 Badila
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1期 姚伟等：病毒侵染对转 SCMV-CP基因甘蔗光合速率和活性氧代谢的影响 99
从第 2天开始出现一条新的酶带，第 10天时该酶带
消失，推测该酶带与甘蔗的病毒抗性密切相关。
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(上接第 76页 Continue from page 76)
植物区系形成了鲜明对比；温带、寒温带物种丰富，
欧亚高山植物属种几乎应有尽有；区系成分多样，分
化激烈，地理联系广泛，替代现象明显；高山花卉和
现代松柏类植物的多样化中心；东亚特有科和单型
中国特有科丰富，多古老、原始的单型属和寡型属；
滇西北不可多得的高山植物种质资源基因库；保护
区植物在植物进化舞台上 ，扮演着极其重要的角色 ，
是研究植物地理不可多得的好场所 。
由于整个山脉呈南北走向，故使其成为南北物
种汇集、迁移和扩散的主要通道，许多物种在迁移的
过程中，在此定居下来，并在新的环境中产生分化，
形成许多特有种，仅中国特有种子植物就有 883种，
占保护区种子植物总数的 51．8 。富含横断山区
特有种和中国特有种，同时滇西北特有种也较丰富，
但保护区自身特有种少。所有的特有种在地理分布
上都有局限性，如果这些物种在该地区丧失，则意味
着该分类单元在整个地球上的消失。因此，白马雪
山自然保护区的特有物种应该受到特别关注。
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