全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(1)：36— 4O 2003 年 1月
湖南四种尾矿环境下的狗牙根遗传
多样性的 RAPD分析
袁长春1，施苏华1，赵运林2
(1．中山大学生命科学学院，广东广州 510275}2．湘潭师范学院生物系 ，湖南湘潭 411201)
摘 要：选择湖南 4种有代表性的有色金属尾矿地所生长的野生狗牙根作为研究对象，并以正常生境下的野
生狗牙根作为对照，采用 RAPD技术分析了这些特别环境下的狗牙根的遗传多样性。17条 1o个核苷酸长的
引物用于 PCR扩增 ，共得到 432条 DNA带。检测位点 160个 ，其中多态位点 134个 ，占 83．75 。各个类群
间的Jaccard相似系数平均为 0．447 5士0．080 6，遗传距离平均为 0．382 5士0，071 2。结果显示生长于这些不
同尾矿环境下的狗牙根种群在遗传本质上均产生了明显的分化 ，完全可以根据其尾矿基质的不 同而划分为不
同的生态型或品种，甚至可能处理为新的变种。狗牙根种群具有丰富的遗传多样性，作为先锋植物可为尾矿
的复垦提供更多的品种选择。
关键词：狗牙根 ；尾矿；RAPD；遗传多样性
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2003)01—0036—05
Genetic diversity analysis of Cynodon dactylon
(L．)Pers．from the four different tailing
mines of Hunan by RAPD
YUAN Chang-chun ，SHI Su-hua ，ZHAO Yun—lin
(1．School 0，L fe Sciences，Zhongshan University，Guangzhou 510275，China；2．Department
of Biology，Xiangtan Normal University，Xiangtan 41 1201，China)
Abstract：The genetic diversity level of the population of Cynodon dactylon(L．)Pers． from four main tailing
mines in Hunan Province was determined by random amplified polymorphic DNA(RAPD)analysis．One sam—
pie of C．dactylon living in normal habitat from Xiangyang town of Hengnan County was used as comparing
group．Seventeen 10一mar oligonucleotide primers were used for DNA ampification，and 432 DNA bands were
generated．Total 160 loci were detected，of which 134(83．75 )were polymorphic．The mean value of Jaccard
’S coefficient of similarity is 0．447 5士 0．080 6 among the taxa，the mean value of genetic distance is 0．382 5土
0．07 1 2．The result indicated that the high genetic diversity existed in the population of Cynodon dactylon dis—
tributed at the four different tailing minerals，and it is reasonable to divide them into four different ecotypes or
varieties respectively，depending upon the type of tailing minerals．Therefore，Cynodon dactylon wil give more
options of the pioneer plants out for resurrection of the tailing mine based on its rich genetic diversity．
Key words：Cynodon dactylon(L．)Pets．；tailing mine；random amplified polymorphic DNA(RAPD)；genetic
diversity
收稿 日期 ：2002—02—22； 修订 日期 ：2002—04—09
基金项目：国家杰出青年基金项目(39825104)；湖南省教委资助项 目(96108)。
作者简介 ：袁长春(1964一)，男，湖南湘潭人，博士，副教授 ，从事植物分子生物学研究。
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l期 袁长春等：湖南四种尾矿环境下的狗牙根遗传多样性的 RAPD分析 37
狗牙根(Cynodon dactylon(L．)Pers．)，又名草
板筋、马拌草、铺地草 ，属禾本科画眉 草亚科 多年生
杂草[1]。原产非洲，广泛分布于热带、亚热带和暖
温带地区，在我国主要分布于黄河流域以南，多生长
于村庄附近、道旁河岸、荒地 山坡及草地[2]。为优
良饲料，又耐放牧，根状茎药用，可清血[3]。其根茎
蔓延力很强 ，为良好的 固堤保 土植 物和铺建草地的
良种，常用以铺建草坪或球场。由于其根茎再生能
力强 ，繁殖系数高 ，耐贫瘠 ，同时也是旱 田、果 园、路
边及旷野较难控制的杂草之一C4]。
尾矿是 由于选矿后 的废水 、废渣及所遗弃的一
些低品位的矿石淤积而成，通常含有较高浓度的不
同金属离子，营养贫乏，其生态环境十分恶劣。湖南
素有“有色金属之省”之称，多种有色金属矿贮量大，
且开采时间长，工艺落后，加上环保意识淡薄，因而
形成相当规模的不同尾矿，长期缺乏治理和恢复。
近年来，国家逐渐重视矿区生态环境的恢复和改善，
除采用先进的采矿工艺外，尾矿的复垦也是一个重
要的途径。通常，由于尾矿地环境胁迫作用强，一般
的植物很难生长。因而选择合适的复垦植物，尤其
是先锋植物是最基本也是最关键的一步。通过对湖
南境内的规模较大、开采历史较长、环境污染较为严
重的 4个有色金属矿区，即水 口山铅锌矿、常宁柏坊
铜矿、湘潭锰矿以及衡阳二七二铀矿等实地野外观
察发现，禾本科植物狗牙根能够生长在这些生境条
件十分恶劣的尾矿地，加上其容易栽培和管理，且繁
殖速度快 ，因而是一种较好 的尾矿复垦的先锋植物 。
从外部形态上来看，生长在这些特殊环境下的狗牙
根彼此之间以及与生长于正常环境下的狗牙根并无
两样 ，而且在某些所观察的尾矿地 ，狗牙根经过多年
的生长和繁衍，已经形成较大规模的群落。但是，是
否它们在内在遗传本质上也表现出一致性，抑或分
化程度如何，以及在实际生产应用中应如何选择品
种资源，尚未见相关报道。
随机扩增多态性 DNA(random amplified poly—
morphic DNA，RAPD)分析已被证 明为研究植物遗
传多样性和种群分化的有用工具之-C5~8]，具有简
便、灵敏度高、分析速度快、仅需微量的 DNA即能
获得丰富的多态性特征等优点，已被广泛用于植物
属下等级的分类，尤其是品种鉴定等方面的研究。
通过选择湖南有代表性的 4种主要有色金属尾矿环
境下生长的狗牙根作为研究对象，并用正常生境条
件下生长的狗牙根作为对照，采用 RAPD分析方法
研究彼此间的差异，旨在探讨狗牙根种群的遗传多
样性及其适应这些特殊环境的本质，为筛选适合有
色金属尾矿复垦的狗牙根品种提供一定依据。
1 材料与方法
1．1材 料
狗牙根(Cynodon dactylon(L．)Pers．)不同样
品分别采 自湖南湘潭、常宁、衡阳及水口山等不同矿
区尾矿地 (表 1)，对 照 组采 自湖 南衡南 县 向阳镇 。
每个样地各取 20株有代表性的植株作为一个样品，
清洗干净后用硅胶干燥保存。在每个取样点各采凭
证标本 3份，凭证标本保存于中山大学植物标本室。
表 1 实验材料(狗牙根)的编号与来源
Table l Number and sources of experimental materials(Cynodon dactylon)
1．2方 法
1．2．1总 DNA提取与 纯化 采用 2×CTAB法[9)
提取植物总 DNA。DNA 纯化按照下 列步骤进行 ：
100,uL DNA l×TE溶液加入 3倍体积 的 6 M
NaI，5 L玻璃粉 l×TE溶液，混匀，室温放置 5
min；8 000 r／m 离心 2 min，弃上清液；加洗脱液
200 L(含 0．2 M NaC1，10 mM Tris-HC1 pH8．0，1
mM EDTA，5O Ethano1)，混匀 ，8 000 r／m 离心 2
min，弃上清液，重复洗脱 3次；晾干，加 100 L l×
TE；5O。C保温 15～20 min至沉淀完全溶解；10 000
r／m离心 10 min，将上清液移至新管，弃沉淀，一20
℃保存备用。
1．2．2 PCR扩增及产物的分析 PCR扩增反应条
件如下；20 L反应体积；1×Taq酶 buffer(Sangon
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公司)；约 2～4 ng模板 DNA；2．0 mmol／L MgC12；
200~mol／L dNTP(Sangon公司)；Taq酶 1个单位
(Sangon公司)；15 ng／20 L引物(Operon公司)。
空白对照用三蒸水代替模板 DNA，其余的成分不
变。
PCR扩增按下列程序进行：94。C 4 min，一个
循环 ；94。C 1 min~35。C 2 min～72。C 2 min，45个
循环；72。C 7 min一个循环，结束。PCR扩增完成
后 ，取 15 L扩增产物点样于 p一1．4 琼脂糖凝胶
上 ，在 1×TAE缓冲液 中电泳 ，稳 压(4 v／cm)，电泳
约 3 h 30 min，2 Kb ladder DNA用作分子量标记。
凝胶在 0．5／~g／mL EB(溴 化 乙 锭 )中染 色 约 40
min，紫外光下检测和照像。
1．2．3数据分析 在电泳图谱上每一 DNA片段被
看作一个可区分的分子标记，同一标记位点有带者
(包括强带和弱带)记作 1，缺乏记作 0，选取长度在
200~2 200 bp并且可重复的 DNA带记录待分析。
各个样品间的相似性系数采用如下公式计算(103：
Jaccard相似性系数 Si—a／(a+b+c)(a为 2个种共
有的带数，b为B种有 C种无的带数，e为 C种有 B
种无的带数)；遗传距离采用下列公式计算(1)：D一
1一F，F一2a／(2a+b+c)(D为遗传距离，F为 Cze—
kanowski相似性系数，其它各字母代表内容与上式
相同)。采用Phylip3．6软件，选用UPGMA法对所
求得的相似性系数和距离系数矩阵进行聚类分析，
构建树系图。
2 结 果
2．1随机引物的筛选
对 120条 10个核 苷酸 长的随机 引物 (Operon
公司产品)进行筛选。仅选用能得到清晰扩增带，对
照无假带或假 带弱 ，加总 DNA后 这些假 带消失 的
引物，共筛选出 17条(表 2)进行正式扩增。
2．2扩增结果
用 17条引物对 5个分类群的总 DNA进行扩
增，共得到 432条可区分的 DNA带，检测位点 160
个，其中多态位点 134个 ，占 83．75 。最多的在引
物 OPD-11共获得 43条带，最少的在引物 OPD-02
共获得 15条带，17个引物在每个样品中扩增的片
段总数平均为 86条 ，其中引物 OPA一11和 OPD-20
的扩增结果见图 1。
表 2 用于本研究的引物及其序列
Table 2 The primers used in this study and their sequences
2．3 RAPD数据分析结果
Jaccard相似性系数以及遗传距离系数计算结
果列于表 3，其中Jaccard相似性系数值变动范围在
0．313 0～0．605 3之间，平均为 0．447 5±0．080 6；
而遗传距离系数位于 0．245 9～0．493 5之间，平均
为 0．382 5±0．071 2。用 UPGMA 法对 所求得 的
相似性系数和距离系数进行聚类分析，得到 2个相
似的树状分枝图(图 2)。
3 讨 论
由表3可知，各个居群间的Jaccard相似性系数
平均为 0．447 5±0．080 6，遗传距离平均为0．382 5
4-0．071 2。Buren等(6)用 RAPD方法研究 Ranun—
CUlUS acriformis var．aestivalis与几个同属近缘种
的关系，种间的最大 Jacard相似性系数为 0．473，变
种间最小的 Jarcard相似性 系数为 0．520。Kazan
等( 2)用 RAPD标记研究几个 Stylosanthes种的遗
传变异，种间最小的遗传距离为 0．290。上述 4种
尾矿下的狗牙根居群彼此间及其与正常环境条件下
居群间的 Jaccard相似性系数为 0．360 7～0．508 6，
均小于 0．520；遗传距离系数为 0．325 7～0．469 9，
均大于 0．290。若参 考 以上报 道 ，表明 4种尾矿环
境条件下的狗牙根种群在遗传上已经产生了明显的
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1期 袁长春等：湖南四种尾矿环境下的狗牙根遗传多样性的 RAPD分析 39
分化，其彼此之间以及与正常生境下的狗牙根之间
的差异基本达到了变种的水平。因而可以将上述 四
种尾矿下 的狗牙根划分 为 4种不 同的生态型 ，即锰
矿型、铜矿型、铅锌矿型和铀矿型，至于是否将他们
处理为 4个不同变种，还需要进行进一步的系统学
研究 。
表 3 居群 间的 Jaccard相似性 系数及 l-F距离系数
Table 3 Jaccarfs similarity coefficient and distance coefficient(1-F)between any two samples
2 3 4 5 M N 1 2 3 4 5 M N
a b
图 1 由随机引物扩增产生的 DNA带型
Fig．1 RAPD profiles generated by primer OPA—ll(a)and OPD-20(b)respectively
图上面的数字代表的类群见表 1；N：空白对照；M：1 kb ladder DNA Marker；a：引物 OPA一11
扩增产生的 DNA带；b：引物 OPD-20扩增产生的DNA带．
The number on top refers to the taxa listed in Table 1
． N：no DNA template；M ：1 kb ladder DNA Marker
Sj值树状
常宁柏坊铜矿尾矿 群
水口【ll锚锌 J 矿居群
二七二厂 铀 矿 群
衡市县川 镇 群
湘潭锰矿 矿 群
湘渖镭矿 矿 群
常宁柚坊俐矿 群
水ll⋯锚锌矿 ∥膈群
二七 二J铀J己矿 群
衡市县l；q⋯镇 群
I— 值树状幽
图 2 用 Jaccard相似性系数( )及遗传距离系数(1一F值)经 UPGMA法聚类分析产生的树状图简化图
Fig．2 Dendrogram generated by using Jaccards coefficient of similarity(1eft)and 1一 F values(UPGMA)
由表 3和图2还可知，生长在锰尾矿下的狗牙 根变异最为明显，与其它居群间的 Jaccard相似性
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r
4O 广 西 植 物 23卷
系数为 0．388 7±0．063 8，遗传距离为 0．435 1±
0．055 6；铜尾矿和铅锌尾矿下的居群稍为接近，Jac-
card相似性系数为 0．508 6，遗传距离为 0．325 7；铀
尾矿下的居群与正常环境条件下的居群较为接近，
Jaccard相似性系数 0．605 3，遗传距离为 0．245 9。
由此表明不同类型尾矿的生境条件相差甚远，不同
的金属离子对植物生长的影响也不相 同，锰离子 、铜
离子和锌离子 因为与代谢作用有关从而对植物的生
长产生较强的影响，特别锰离子对一些主要代谢过
程 以及某些酶的活性会产生直接影 响 ，因而锰尾矿
可能对生长在其上的植物有更强的趋异作用。通
常，铀离子并不为植物代谢所必须，当植物生长在其
辐射作用并不强的铀尾矿地时，其变异程度会相对
较低。汪小全等(13用 RAPD分析研究银杉遗传多
样性所得亚居群间的遗传距离仅为 0．162 3，苏应娟
等0 43用 RAPD方法研究陆均松及罗汉松不同居群
所得平均遗传距离分别为 0．106 1和 0．069 3。由
此表明，由不同金属尾矿所造成的生境的差异程度
比由于不同纬度和气候条件所造成的生境差异要大
得多，并且来得更快。对生长于其上的植物有相当
强的胁迫作用，除了营养缺乏和水分不足以外，特别
是高浓度的金属离子所产生的毒害作用使得大多数
植物不能在其生长。
狗牙根作为全球广布种，本身种内变异非常丰
富( 53，即使在正常生境条件下，随着纬度和气候条
件的不同也会在形态显现出一定差异。美国 Har-
lan J．R．等根据狗牙根外部形态、地下茎生长习性
和体细胞染色体数目，将其分为 6个变种(163，Ro—
checouste根据叶毛的排列方式及其类型，将毛里求
斯的狗牙根分为 4个生物型，Ramakrishnan根据狗
牙根对土壤 Ca2+的反应，划分为 3个生态型，即喜
钙型、中间型和厌钙型(173。尾矿环境下的狗牙根作
为其种群中的一个特殊类群 ，单从形态上并不能发
现有何特别之处，但 RAPD分析结果表明其内在分
化程度出人意料。GustavoC183曾用 DAF和 ASAP
的方 法研 究两种狗牙 根栽 培品种 “Tifgreen”和
“Tifdwarf”，发现它们在遗传上具有不稳定性，不同
居群 间也有一定 的基 因型上 的差异 ，并认 为这种差
异可能是突变的结果。
目前世界上已培育出很多不同性状的狗牙根品
种(包括杂交品种)，但其适应性普遍不如本地野生
种类(153。结合本研究的结果 ，在尾矿复垦中，应优
先选择当地或相同矿种尾矿下的野生狗牙根作为品
种来源。
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