全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(1)：17— 22 2004年 1月
中国卵叶海桑遗传多样性的 ISSR研究
李海生1一，陈桂珠1
(1．中山大学环境科学研究所，广东广州 510275；2．广东教育学院生物系，广东广州 510310)
摘 要：卵叶海桑(Sonneratia ovata)是海桑科濒危红树植物，在我国仅分布于海南文昌清澜自然保护区内。
采用简单序列重复区间扩增(ISSR)分子标记技术对该天然居群和东寨港红树林 自然保护区引种的人工居群
共 3个居群 39个个体进行了遗传变异分析 。l1个引物共扩增出 185条带，其 中 127条具多态性，多态位点百
分率为 68．65 。在居群水平上相对较低 ，多态位点百分率 36．76 ～54．59 ，平均值为 47．21 。Nei的基
因多样性、Shannon信息指数在物种水平上分别为0．141 1和0．229 2；在居群水平上平均值分别为0．120 9和
0．191 0。Nei的遗传分化系数 Gst表明：87．58 遗传变异分布在居群 内，12．42 的遗传变异分布在居群间。
居群间的遗传一致度达0．970 7。东寨港迁地保护的人工居群有效地保护了卵叶海桑的遗传多样性。
关键词 ：卵叶海桑 ；ISSR；遗传多样性；遗传分化 ；保护
中图分类号：Q948 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2004)01—0017—06
Genetic diversity of Sonneratia ovata
(S0nneratiaceae)in China detected by inter—
simple sequence repeats(ISSR)analysis
LI Hal—sheng 一．CHEN Gui-zhuI
(1．Institute of Environmental Science，Zhongshan University，Guangzhou 510275，China；2．Department
of Biology，Guangdong Education Institute，Guangzhou 510310，China)
Abstract：Sonneratia ovata is an endangered mangrove species of Sonneratiaceae restricted in Hainan Qinglan
Natural Reserve of W enchang City，Hainan Province．Inter—simple sequence repeats(ISSR)markers were
used to investigate the genetic variations within and among the wild population and two introduced populations
at Hainan Dongzhai Harbor Mangrove Natural Reserve．Leaf samples were collected from 39 individuals．E—
leven ISSR primers gave rise tO 185 discernible DNA bands of which 127(68．65 )were polymorphic．How—
ever，there were relatively low levels of polymorphism at the population level with the percentage of polymor—
phic bands(P)from 36．76 to 54．59 ，47．21 on average．Nei’S genetic diversity(h)and Shannon’S in—
formation index(D were 0．141 1 and 0．229 2 respectively at specific level，0．120 9 and 0．191 0 at population
leve1．Based on Nei’S Gst value，a large proportion of genetic variance(87．58 )was among individuals with—
in population，1 2．42 genetic variance was among populations． Genetic identity between populations was
0．970 7 on average．The ex situ conservation of S．ovata at Dongzhai Harbor M angrove Natural Reserve was
successful in the conservation of genetic diversity．
Key words：Sonneratia ovata；ISSR；genetic diversity；genetic differentiation；conservation
卵叶海桑(Sonneratia ovata Backer)是海桑科 海桑属红树植物，分布于泰国、马来西亚、新几内亚
收稿 日期 ：2003—04—08 修订 日期 ：2003—05—26
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助项目(20010558004)
作者简介：李海生(1971一)，男，河南沁阳人，讲师，博士生，从事植物学、生态学和保护生物学的研究。
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18 广 西 植 物 24卷
巴布亚湾以及昆士兰等地(Tomlinson，1986)。在
我国的海南岛，卵叶海桑亦有分布。作为沿海红树
林的组成成分之一，卵叶海桑对于防风、防浪、固堤、
保护农田和村庄、促淤造陆有显著的效果，同时，其
树干饱满，材质好，亦可作为我国红树林用材树种。
但该植物在我国仅天然分布于海南文昌清澜保护
区，分布范围狭窄，主要分布在文昌头宛保护站附近
的霞场村及AI-J湾附近乡镇 ，除在霞场村卵叶海桑
个体数量较集中分布外，在八门湾附近乡镇多呈零
星分布。由于近年来卵叶海桑生长地受到人类搞水
产养殖等经济活动的干扰，生存受到严重的威胁，个
体数量变得极为稀少，估计仅有 200株左右。上世
纪 90年代以来，海南东寨港红树林 自然保护区陆续
从文昌清澜保护区采种育苗，现在三江(1990年引种)
有 8棵，苗圃和林家湾各有 30多棵(1998年引种)。
物种的遗传多样性是长期进化的产物，也是其生
存和发展的前提。对稀有濒危植物遗传多样性和遗
传结构的研究，是探讨其适应性、生存力的基础，也是
分析致濒机理的基础，从而帮助制定科学有效的保护
策略和措施。目前对卵叶海桑的形态、解剖、细胞学、
生理生态作过一些研究(陈泽濂，1996；黄庆昌等，
1994；王瑞江等；1998；邓传远等，2000；邓传远等，
2001)。但对该物种在 DNA水平上的遗传多样性及
保护生物学方面的研究至今尚未见报道。ISSR(In—
ter-Simple Sequence Repeat)又称简单重复序列区间
扩增，是利用真核生物基因组广泛存在的简单重复序
列，设计单一通用引物对基因组 DNA进行 PC．R扩
增，扩增产物经聚丙烯酰胺胶或琼脂糖凝胶电泳分离
获得扩增指纹图，从而可以揭示样本间的遗传多样
性。ISSR分子标记技术具有DNA样品用量少，操作
简单，无需预先知道受试基因组 DNA序列，结果记录
方便，实验成本低，重复性好，能提供丰富的关于基因
组的信息等优点，已广泛用于遗传多样性分析、绘制
DNA指纹图谱、品种鉴定、进化及分子生态学研究
中。因而本研究采用 ISSR分子标记来研究卵叶海桑
的遗传变异，以阐明其遗传多样性水平和遗传结构，
为保护卵叶海桑提供基础资料和科学依据。
1 材料和方法
1．1材料
根据卵叶海桑的居群大小随机采样。对于小居
群一般全部采，大居群则按比例采集。采样时采摘
卵叶海桑的嫩叶，置于盛有硅胶的塑胶袋中干燥保
存。采样时间为 2001年 12月。各居群的基本情况
见表 1。
表 l 卵叶海桑取样居群的基本情况
Table 1 The general situation of Sonneratia
ovata sampling populations
1．2 DNA提取
采用 CTAB法 (Doyle等，1987)提取基因组
DNA。用电泳法测其含量。
1．3 PER扩增
对购自于哥伦 比亚大学的 100个引物(UBC
set No．9)进行了筛选，从中选取扩增条带清晰，重
复性较好的 11个引物(表 2)用于 PCR扩增。扩增
反应在 PTC-1 00 TM Programmable Thermal Con-
troler(美国)PCR扩增仪上进行。经实验证实较好
的扩增条件为每 10 L反应体积含 1 vtL 10×buff-
er，3．0 mmol／L MgC12，300 mmol／L dNTPs，0．3
／lmmol／L primer，1U Taq DNA聚合酶(加拿大真
达公司)，lO ng模板 DNA。扩增程序：94℃预变性
5 rain，之后进行 45个循环，每个循环包括 94℃变
性45 S、52～53．5℃退火(退火温度随引物而定)
(表2)45 S、72℃延伸 1．5 min，最后于 72℃延伸 7
min。将扩增产物置于4℃冰箱保存。
1．4 PER产物鉴定
将 PCR扩增产物在用 0．5×TBE配制的含有
EB的 1．5 的琼脂糖凝胶中电泳分离。以 100 bp
DNA ladder(1O0～3 000 bp)作为相对分子质量标
准。在 60 mA的恒流下电泳 3 h。电泳结束后在紫
外检测仪上观察记录扩增产物的泳带，并在凝胶成
像系统中保存图像。
1．5数据的统计和分析
1．5．1居群遗传结构及遗传多样性分析 在琼脂糖
凝胶电泳图谱上同一 ISSR位点上有电泳带记为 1，
无电泳带的记为 0，作 0，1矩阵输入计算机。应用
Popgene 1．31程序，假定居群在这些 ISSR标记位
点处于 Hardy—Weinberg平衡状态，统计下列参数：
(1)多态位点百分数(P)：扩增的DNA片段出现频
率小于或等于 0．99的位点即为多态位点，多态位点
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1期 李海生等：中国卵叶海桑遗传多样性的 ISSR研究 19
百分数=具有多态的位点数／检测到的位点数 x
100 ；(2)平均每个位点的观察等位基因数(Na)；
(3)平均每个位点的有效等位基因数(Ne)；(4)Nei
的基因多样性(h)(Nei，1973)；(5)Shannon信息指
数(J)；(6)总的基因多样度(Ht)和居群内的基因多
样度(Hs)；(7)基因分化系数(Gst)和基因流(Nm)；
(8)Nei的遗传距离(D)(Nei，1972)和遗传一致度
(I)。
1．5．2聚类分析 采用算数平均数的非加权成组配
对法(UPGMA)对居群间使用 Nei(1972)遗传距离
进行聚类分析，对居群个体之间使用 Nei和 Li
(1979)的相似性系数进行聚类分析。使用软件为
NTSYSpc 2．02。
2 结果与分析
2．1卵叶海桑居群的遗传多样性
用 11个 ISSR引物扩增了 3个卵叶海桑居群
共 39个个体，共扩增出 185条带，每个引物扩增的
条带数为 12～24条，平均每个引物扩增的条带数为
16．8条，扩增的条带在 150 bp至 2 500 bp之间，其
中 127条具多态性 (表 2)，多态位点百分率 为
68．65 。由表 3可知，居群内的多态位点百分率在
36．76 9／5～54．59 之间，平均值为 47．21 。随着
个体数的增加，居群多态位点百分率亦随着相应提
高。Nei的基因多样性在 0．100 8～0．133 9之间，
Shannon信息指数反映的遗传多样性比Nei的基因
多样性高，在0．158 5～O．212 4之间，但表现出同样
的趋势 ，即 MP>TW>SJ。
2．2卵叶海桑的遗传分化
由Popgene分析，卵叶海桑所有群体总的基因
多样度为0．138 0，居群内基因多样度 0．120 8，居群
间遗传多样度为0．017 2，分化系数Gst为0．124 2。
换言之，卵叶海桑居群间发生了一定的遗传分化，居
群间的遗传变异占总遗传变异的 12．42 ，居群内
的遗传变异占总遗传变异的 87．58 。居群间的基
因流为 1．763 2。居群间的遗传距离(D)矩阵和遗
传一致度(I)见表 4。I值变化范围为 0．961 9～
0．976 5，所有群体间的平均一致度达 0．970 9。根
据 Nei(1972)遗传距离将所有群体进行 UPGMA聚
类，聚类结果为头宛居群(TW)和三江居群(SJ)首
先聚在一起，然后在距离 0．03处再与苗圃(MP)居
群聚为一起。利用 NTSYSpc 2、02软件计算卵叶
海桑 39个样品之间 Nei和 Li(1979)的遗传相似性
系数，并根据相似性系数使用 UPGMA法聚类，结
果见图2。从聚类图中可知，每一个居群的样品一
般并非都单独地聚为一类。
表 2 ISSR引物、序列、退火温度和
扩增后产生的带型数
Table 2 Name of ISSR primers，sequence，annealing
temperature and bands after amplification
eque nce Primer
of primer
退火温度 记录的带数
Annealing No．of
tetaperature bands
(℃) scored
887
Total
(AG)8C
(AG)8G
(AG)8(CT)C
(AG)8(CT)A
(GA)8(CT)T
(GA)8(CT)G
(CA)8(AG)C
(AC)8(CT)G
(ATG)6
(GAA)6
(AGT)(ACG)
(AGT)(TC)7
表 3 卵叶海桑居群间遗传变异统计
Table 3 The genetic variation statistics among populations of Sonneratia ovata(Mean±SD)
居群 观察等位基数 有效等位基数 期望杂合度 Shannon信息指数 多态位点百分数
Population Na Ne h
．
I
． —
P
．
TW
M P
sJ
平均 Average
总群体 Al locus
1．5O2 7士0．501 3
1．545 9士0．499 2
1．367 6士0．483 5
1．472 1士0．093 0
1．686 5土0．465 2
1．205 4士0．308 3
1．215 9士0．316 5
1．162 5±0．289 6
1．194 6士0．028 3
1．221 8士0．306 5
0．127 9士0．169 6
0．133 9士0．171 3
0．100 8士0．159 8
0．120 9士0．017 6
0．141 1士0．164 9
0．202 2士0．246 2
0．212 4土0．246 6
0．158 5士0．234 9
0．191 0士0．028 6
0．229 2士0．235 2
Note：Na—obserred number of aleies，Ne=efective number of aleles，h=Nei’s gene diversity，!=Shannon’s Information index，一P the
percentage of polymorphic bands．
善
8 9 5 6 O 2 7 7 4 8 印 印 踮 踮 踮
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2O 广 西 植 物 24卷
表4 卵叶海桑居群间Nei(1972)的遗传一致度
(右上角)和遗传距离(左下角)
Table 4 Neis(1972)genetic identity(above diagona1)and
genetic distance(below diagona1)of Sonnem tia ovata
3 讨 论
3．1卵叶海桑的遗传多样性
尽管卵叶海桑目前分布范围和个体数量非常有
限，但从实验结果来看，多态位点百分率远高于红树
植物红海 榄 (Rhizophora stylosa)(Goodal等，
M P
1989)、秋茄(Kandelia cande1)(黄生，1994)、老鼠
筋(Acanthus ilicifolius)(Lakshmi等，1997)，原因
可能在于本研究采用 ISSR分子标记技术，较上述
研究所采用的等位酶、RFLP、RAPD技术可检测到
更多的基因位点，发现更加丰富的遗传信息(God—
win等，1997；Nagoaka等，1997；钱韦等，2000；杜金
昆等，2002)。另外，采用 ISSR分子标记研究表明：
红树植物银叶树(Heritiera litoralis)总的基因多
样性为 0．232 7，多态位点百分率为 83．19 (Jian
等，2002)；桐花树(Aegiceras corniculatum)总的遗
传多样性仅 0．039，多态位点百分率为 16．18 9，6(Ge
等，1999)；而卵叶海桑总的基因多样性为 0．138 0，
多态位点百分率为 68．65 。因此，从卵叶海桑的
遗传多样性来看，在种的水平上，遗传多样性在红树
『
O．02 O．03 0．03 0．03 O．03
Coe瓶 cient
图 1 卵叶海桑居群间遗传距离(Nei，1972)UPGMA聚类图
Fig．1 Dendrogram of UPGMA cluster analysis based on Nei’S(1972)genetic
distance among populations of Sonneratia ovata
植物中保持着中度的遗传多样性水平。
3．2卵叶海桑的遗传结构
卵叶海桑群体间存在一定的遗传变异，居群间
的遗传变异占总遗传变异的 12．42 9，6，分布在居群
内遗传变异占总遗传变异的87．58 。这样的遗传
结构与大多数热带树种的遗传结构相似(Hamrick
等，1990)。影响居群间遗传结构的因素很多，如繁
育系统、分布范围、种子传播机制 等 (Hamrick，
1987)。海桑属植物繁育系统是以异交为主，主要靠
蝙蝠、鸟(Staford—Deitsch，1996)、天蛾 (Primack
等，1981)等传播花粉，造成了一定的基因流动(Nm
= 1．763 2)；东寨港红树林保护区与文昌清澜保护
区，两地毗邻，有着相似的立地、气候条件，且分布在
东寨港的卵叶海桑是从文昌采种育苗引种的，不同
居群的植物个体间有很近的亲缘关系，用 UPGMA
法对个体之间聚类结果，每一居群中的个体并非单
独聚为一类，亦表明了这一点。因此，可能正是由于
上述因素导致了卵叶海桑的遗传变异主要分布在居
群内。另外，卵叶海桑多生于高潮带，其果实为浆
果，种子多数，果实落地后，部分果实会受到涨潮、退
潮的影响而被带到他处，至于随潮水传播的距离及
对由此造成的对卵叶海桑遗传结构的影响则尚待进
一 步研究。
3．3卵叶海桑的保护
目前人们在红树林生长地搞水产养殖，因挖鱼
塘、虾塘等砍掉了大量的红树林植物，红树林植物的
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1期 李海生等：中国卵叶海桑遗传多样性的 ISSR研究 21
O．78 0．87 0．9l
Coefficient
TlⅣl
TW2
TW3
TW5
Ⅳ l
SJ7
SJ8
Ⅳ lO
Ⅳ l4
Ⅳ l5
TW4
TlⅣ7
TW9
TlⅣ8
P
Ⅳ l7
TlⅣl1
TlⅣl2
li
SJl
SJ2
SJ4
ⅣfP2
i
ⅣfP6
Ⅳ l2
ⅣfPl3
{
Ⅳ 9
Ⅳ l1
Ⅳ 7
TW6
SJ5
O．95
图 2 卵叶海桑个体间Nei和Li(1979)的遗传相似性系数 UPGMA聚类图
Fig．2 The dendrogram of individuals of Sonneratia ovata based on the Nei and Li
(1979)similarity coefficient and the UPGMA clustering method
生境受到很大破坏，给包括卵叶海桑在内的大量红
树植物的生存带来极大的威胁。卵叶海桑作为红树
林中的上层树种，更易遭到砍伐破坏。因此，人类的
砍伐及所带来的生境丧失、生境片断化等是造成卵
叶海桑濒危的主要原因。另外，卵叶海桑天然分布
居群和迁地保护居群中，均较少发现有实生苗存在。
这是由于卵叶海桑母树少，加之果实落地后，易受到
螃蟹、蚂蚁的啃食，种子变得更为稀少，以及原生地
可能缺乏种子萌发的立地条件。因此为保护卵叶海
桑，除应在其天然生长地实行就地保护，保护其生
境，制止乱砍乱伐外，还应进一步实施迁地保护工
作。从我们的研究结果来看，头宛居群和在东寨港
迁地保护的三江居群、苗圃居群间遗传多样性差异
不大。居群间的遗传一致度高达 0．970 2。表明在
东寨港迁地保护的卵叶海桑在很大程度上保持了原
生居群的遗传多样性，迁地保护较为成功。由于东
寨港引种栽植的卵叶海桑数量不多，为成功地保护
这一濒危植物，还应进一步加强卵叶海桑种质资源
的收集工作，加强采种，提高育苗、造林技术。尽快
让居群数量得以恢复。
本研究野外采样得到了文昌清澜自然保护区管
理站梁勇站长和东寨港红树林保护区陈建海同志的
帮助；实验在中山大学教育部基因工程重点实验室
完成，实验过程中，一直得到了施苏华教授的关心和
指导，简曙光博士、谈凤笑博士、田春杰博士、袁长春
博士、南蓬博士、周仁超博士、余燕同学等在实验和
数据处理过程中提供了帮助；王玉国博士对初稿提
出了宝贵意见，在此作者深表谢意。
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