全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 31(1)：31— 35 2Ol1年 1月
DOI：10．3969／j．issn．1000—3142．2011．01．007
海南龙血树 RAPD—PCR反应体 系的优化
郑道君，谢 良商，张 文，张治礼
(海南省农业科学院 农作物遗传育种重点实验室，海口 571100)
摘 要 ：采用单因子试验和正交试验设计 ，对影响海南龙血树 RAPD-PCR反应的模板 DNA量、Mg抖 、dNTP
和引物浓度，Taq聚合酶用量等因子进行研究 ，分析各 因子对 RAPD-PCR扩增绪果的影响，确立了海南龙血
树 RAPD-PCR反应的最佳 条件 ，即在 25 L反应体系中，包含 10 X buffer 2．5 L，2．0 mmol／L MgC12，300
#mol／L dNTPs，Taq酶 1．5U，引物 0．8 pmol／L和 DNA模板 20 ng。以此条件为基础，筛选出适用于海南龙
血树 RAPD-PCR分析的 18条有效引物，为采用 RAPD技术分析海南龙血树种群遗传变异水平和遗传结构打
下 了基 础
关键词 ：海南龙血树 ；RAPD；反应条件优化；有效引物筛选
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2011)01—0031—05
Optimization 0f RAPD-PCR reaction system
n 1 T T ●
10r 上 Jp． C C 7 D Z
ZHENG Dao—Jun，XIE Liang-Shang，ZHANG Wen，ZHANG Zhi-Li
(Key Laboratory of Crop Genetics and Breeding，Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou 571 100，China)
Abstract：Both single factor test and orthogonal design were applied to study the effects of main factors Oil the RAPD-
PCR system for Dracaena cambodiana，in which the main factors included the content of template DNA，the concen—
tration of Mgz+、dNTPs and primers and the content of Taq DNA polymerase，and an optimal 25 L RAPD~PCR re—
action system for D．cambodiana was established，including 2．5 L 1O×PCR buffer，2．0 mmol／L MgC12，300~mol／
L dNTPs，1．5 U Taq polymerase，0．8#mol／L primers，and 20 ng DNA template．18 primers were selected for
RAPD-PCR analysis for D．cambodiana using the optimized amplification system above，which can be employed for
the analysis of genetic variation and structure of D．cambodiana population．
Key words：Dracaena cambodiana；RAPD；optimization of reaction condition；screening of effective primers
海南龙血树 (Dracaena cambodiana)又名小花
龙血树，俗称“山海带”、“不老松”和“平安树”，属百
合科(Liliaceae)龙血树属植物，在中国仅产于海南
(中国科学院中国植物志编辑委员会 ，1992)。海南
龙血树是国产血竭的两种基源植物之一[另一基源
植物为剑叶龙血树(D．c。 ，z ，z )]，可提取传
统名贵中药材“血竭”(广东省植 物研究所 ，1977；谢
宗万，1989)。此外，海南龙血树还是园林绿化和家
庭盆栽的名贵树种，具有很高的观赏价值。作者在
野外资源调查时发现，近年来海南龙血树野生资源
遭受掠夺性采挖，加之人类活动致使其生境的破碎
化，其数量 目前 已十分有 限，现存 的原生种群仅有
1o个，而各种群的个体数量在 2O～5 000棵不等(调
查结果将另文报道)。调查还发现 ，海南龙血树种群
更新能力极差，属自然更新失败。野生海南龙血树
资源亟待保护。目前 ，该物种已被列入二级国家重
点保护野生植物 (中国数字植物标本馆：http：／／
www．cvh．org．cn／)和三级 中国稀有濒危保护植物
收稿日期：2010—05—24 修固日期 ：2010—1l—O8
基金项 目：国家 自然科学基金(30760015)；海南省自然科学基金(30831)[Supported byNationalNatural Science Foundation of china(30760。15)
Natural Science Foundation of Hainan(30831)]
作者简介：郑道君(1979一)，男，海南人 ，硕士 ，主要从事植物种质资源和植物保护遗传学研究，(E-mail)daojunzh@yahoo．com．en。
通讯作者：张治礼(1970一)，男，博士，研究员 ，研究领域为橡胶树产胶、植物抗逆分子生物学 ，(E-mail)zz1一eatas@hotmail．com。
32 广 西 植 物 31卷
(国家环境保护局等，1987)。全面开展保护生物学
研究，包括保护遗传学研究是解决生物多样性危机、
挽救成千上万物种的根本出路 ，也是合理的资源开
发和利用的前提 (李昂等 ，2002)。但关于海南龙血
树的研究 目前主要集 中在组织快繁、栽培技术 以及
以血竭为基础的开发利用等方面(郑道君等，2009)，
关于该物种保护生物学方面的研究目前国内外尚未
见报道。为此，我们采用 RAPD技术研究海南龙血
树种群遗传变异水平和遗传结构，以期从分子水平
揭示海南龙血树种群的濒危现状和致危原因，并为
制定合理的保护策略提供科学依据。
RAPD技术所需 DNA用量少 ，检测快速简便、
费用低廉，引物通用性强，具有很好的稳定性和多态
性，近年来已在濒危植物保护遗传学研究领域得到
广泛应用(李昂等，2002；董贞荣等，2006；Xia等，
2007；Gaiotto等，1997)。但是由于 RAPD技术是
一 种基于PCR的分子标记，且其引物序列短以致退
火温度较低，对反应条件变化非常灵敏，影响因子较
多。针对不同的物种 ，系统地研究 RAPD分析中的
各种影响因子，摸索其最佳反应条件，是获得准确、
可重复研究结果 的关键 。为此，我们对海南龙血树
RAPD分析 中的模 板浓 度、dNTPs浓 度、Mg 浓
度、Taq酶用量 、引物浓度等影响因子进行了比较系
统的研究 。在单因子试验结果的基础上，采用正交
试验研究海南龙血树 RAPD分析最佳反应条件，首
次建立了一套稳定的海南龙血树 RAPD—PCR反应
体系，在此基础上筛选出了一批有效引物，其研究结
果将为 RAPD技术应用于海南龙血树种群保护遗
传学方面的研究奠定基础。
1 材料与方法
1．1材料
用于反应体系优化的海南龙血树供试材料取自
海南省东方市俄贤岭居群(18。59 58 N，109。04 30”
E)；选取与俄贤岭居群生境差异较大的三亚市南山
居群(18。18 04”N，109。09 06 E)和东方市黑岭居群
(18。46 30．0 N，108。48 45．8 E)各 1份材料用于有
效引物的筛选。所有供试材料均为采自健康树的嫩
芽或叶，常温下带回实验室后保存于一2O℃备用。
1．2试剂与仪器
主要试剂：60条 S系列随机引物 由上海生物工
程有限公司合成；100 bp plus Marker购 自北京中
科瑞泰 公 司；Taq DNA polymerase和 4×dNTP
mix购 自上海申能博彩生物科技有限公司。主要仪
器 ：离心机，电热恒温水浴锅 ，电冰箱 ，移液枪 ，紫外
分光光度计，梯度 PCR仪(Biometra)，水平 电泳仪，
Gel Doc XR型凝胶成像系统等。
1．3方法
1．3．1基 因组 DNA提 取及检 测 采用梁远发等
(2008)改良后的 CTAB法提取基因组 DNA。利用
0．8 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的完整性、紫外分
光光度计检测 DNA的浓度和纯度。提取的 DNA
浓度稀释至 20ng／#L保存在一2O℃冰箱中备用。
1．3．2随机 引物初选 RAPD-PCR原始反应条件
组成：1O×反应 bufer 2．5 L，2．0 mmol／L MgC12，
200#mol／L dNTPs，Taq酶 1．5 U，引物 0．4／xmol／L，
DNA模板 3O n譬，最后用无 菌超纯水补足至 25 L。
RAPD-PCR扩增程序：94℃预变性 4 min；然后按 94
℃变性 40 S，38℃退火 45 S，72℃延伸 120 S，进行 4O
个循环；最后 72℃延伸 8 min。按此原始反应体系
及扩增程序，对引物进行初选。
表 1 单因子试验中各因子的梯度水平
1 ble 1 Gradient levels of each factor in single factor test
水平
I evels
影响因素 Factors
T 托 A M
gZ+ dNTP Primer DNA
p y ase(mmol／I )( m。l／L)( )
( ng／25~L) (U／25／~L) 、 ⋯ 、 “⋯
2．5
5．0
10．0
20．0
40．0
60．0
8O．O
12O．0
160．0
240．0
320．0
O．O25 0．25
0．5 0．5
1．0 1．0
1．5 1．5
2．O 2．O
2．5 2．5
3．0 3．0
4．0 3．5
5．0 4．0
6．0 5．0
1O．O 7．0
0．25
0．05
0．1
0．15
0．2
0．25
0．3
0．6
0．8
1．0
1．3．3 RAPD-PCR反 应条件优化试验设计 采用
单 因子试验方法(表 1)，以上述原始反应条件为基
础，筛选各因子的适宜浓度范围(每个因子筛选 4个
水平)。以筛选出的适宜水平按 L (4 )方案设计正
交试验，筛选海南龙血树最佳 RAPD-PCR反应条
件。选择扩增条带多且清晰的引物$28用于模板浓
度优化，引物S5用除模板浓度以外的影响因子优化
和正交试验。参照何正文等(1998)和穆立蔷等
(2006)所用的直观分析法，依据谱带的强弱和杂带
O O O O 0 O O O ¨ ∞ 们
l 2 3 4 5 6 7 8 9 n
l期 郑道君等：海南龙血树 RAPD-PCR反应体系的优化 33
的多少对正交试验 的 PCR扩增 结果依 次打分 。条
带数量丰富、清晰的最佳产物记 16分 ；相反 ，最差的
计 1分。分别进行两次独立计分，取两次的平均数。
根据上述打分结果求 出每个因子 同一水平下的试验
值之和Ki以及每一因子水平下的数据平均值ki，并
求出同一因子不同水平间平均值的极差 R。
1．3．4有效多态性引物筛选 以生境差异显著的 3
份供试材料 的 DNA 为模 板 ，在优 化后 的最佳反应
条件下 ，筛选扩增结果清晰、重复性好且具有良好多
态性的引物 。
1．3．5扩增产物 的检 测 扩增 产物在 含 Goldview
核酸染料的 1．5 (w／V)琼脂糖凝胶电泳中分离，
电压为 5 V／cm，电泳缓冲液为 0．5xTBE。电泳结
束后在 Gel Doc XR型凝胶成像分析系统观察并拍
照记录。
2 结果与分析
2．1模板 DNA用量的适宜范围
试验结果表明，模板浓度对海南龙血树 RAPD-
PCR扩增产物的带型影响不显著(图 1)。只是在
2．5 ng／25pL时扩增条带较弱，随着浓度增大，即当
模板浓度≥2．5 ng／25pL时 ，扩增产物的带型一致 、
清晰。本研究选择 1O～6O ng／25gL的模板浓度用
于后续正交试验。
2．2 Taq酶用量对 RAPD-PCR的影响
Taq酶是影响 RAPD-PCR扩增结果 的重要因
子。试验结果表明：Taq酶用量少 于 0．5 U，扩增量
明显不足，条带少且弱(图 2中 1泳道)；当用量为
0．5～1．0 U时，带型不稳定，部分条带扩增量不足
(图 2中 2，3泳道)；而 Taq酶用量为 1．5～3．0 U
时 ，条带清晰，带型一致(图 2中 4～7泳道)；但是当
Taq酶≥4．0 U，部分扩增 条带减弱或消失 ，同时出
现新的条带。可见，过高的Taq酶用量会抑制海南
龙血树 RAPD-PCR反应 ，同时会 引起非特异 性产
物的产生。上述结果表明，用于后续正交试验的适
宜 Taq酶用量为 1．5～3．0 U。
2．3 Mg 浓度对 RAPD-PCR结果的影响
扩增结果表明：当 Mg ≤0．25 mmol／L时，不
能扩增出条带(图 2中 12泳道 )。这可 能是 由于模
板、引物、dNTPs竞争与 Mg 结合，导致激活 Taq
酶所需的自由 Mg抖不足，造成酶活力显著降低，扩
增反应失败。当浓度为 0．5 mmol／L时，有扩增产
物，但条带少且弱(图 2中 13泳道)，这说 明 M 浓
度仍较低。当 M 浓度在 1．0～3．5 mmol／L时，扩
增条带一致且清晰 ；但随着浓度大于 3．5 mmol／L部
分条带开始变弱 ，且背景加深 。这可能是由于增加镁
离子的浓度使引物的错配频率增加。考虑到高浓度
会引起扩增的严谨性下降 ，本试验选择 M 浓度为
1．O～3．0 mmol／L用于后续正交试验。
图 1 模板浓度梯度试验
Fig．1 Testing of template concentration
M ：100 bp plus；1～ 11：2．5，5，10，20，40，60，
80，12O，160，240 and 320 ng／25~L．
图 2 Taq酶和 Mg2+浓度梯度试验
Fig．2 Testing of Taq DNA polymerase
and Mg2+ concentrations
M ：100 bp plus；1～6：0．25，0．5，1．0，0．15，2．0，2．5，3．0，4．0，5．0
6．0，10．0 U(TaqDNA polymerase)；12～22：0．25，0．5，1．0，
1．5，2．0，2．5，3．0，3．5，4．0，5．0，7．0 mmol／L(Mg0 )．
2．4 dNTPs浓度对 RAPD-PCR结果的影响
dNTPs是反应 中磷酸根的主要来源 ，其浓度取
决于扩增片段的长度，另外其浓度的任何变化都会
影 响 到 Mg 的 有 效 浓 度 。扩 增 结 果 表 明，当
dNTPs浓度在 25～300~mol／L之间时 ，随着浓度
的增加扩增的带数与强度也随之增加。当 dNTPs
≤100／lmol／L时条带不清晰，扩增量不足(图3中1
～ 3泳道)，当浓度在 150～300 Fmol／L时，扩增出
的带型基本一致，条带多而清晰(图 3中 4～7泳
道)；而当 dNTPs≥ 350／~mol／L时 ，较大 的扩增条
i量黜Ⅲ 黜 ㈣ⅢⅢ ㈨
口o 。 0 口口 口 口 口 。 O 0 O 0 粼Ⅲ 。。。∞∞ ¨
34 广 西 植 物 31卷
带表现出不能有效 的扩增且有明显缺失的趋势 。这
说明，高浓度的 dNTPs会抑制分子质量相对较大的
条带扩增，其原因可能是过高浓度 dNTPs与反应混
合液中的 Taq酶竞争 Mg ，从而抑制聚合酶的活
性 ，导致扩增谱带 的改变甚至消失。根据以上分析
结果 ，选择 150～300 ptmol／L的 dNTPs浓度用 于
后续的正交试验为宜。
图 3 dNTPs和引物浓度梯度试验
Fig．3 Testing of dNTPs and primer concentrations
M ：100 bp plus；1～10：25，50，100，150，200，250，300，400，
550，650~mol／L(dNTPs)；11420：0．025，0．05，0．1，
0．15，0．2，0．25，0．3，0．6，0．8，1．O,umol／L(primers)．
2．5引物浓度对 RAPD-PCR结果的影响
试验结果表明(图 3，l1～2O泳道)，引物浓度对
RAPD-PCR扩增 的带型产生 明显影响。引物浓度
小于或等于 0．05 t~mol／L时无扩增产物；当引物浓
度达到 0．1 fmol／L时，随着浓度的增加，扩增条带
的数量与强弱也随之明显增加；当达到 0．6 fmol／L
及其以上浓度时扩增条带丰富且清晰，带型趋于一
致。根据扩增条带多少、强弱以及带型的稳定性，选
择 0．3，0．6，0．8和 1．0 fmol／L的引物浓度用 于后
续的正交试验。
2．6正交试验分析
正交试验设计结果见表 2，共包括 5个因子各 4
个水平，其试验的扩增结果如 图 4所示 。对试验结
果进行打分，16个试验组合的分数依次为：1、8、1l、
12、l6、15、2、3、4、2、8、5、7、4、3、7。由各组合的得分
情况可知，分值最高的组合为 5号组合，即为最佳组
合 ，其扩增条带数最多，为 15条 ，其中强带为 6条
(图 4中 5泳道)；而最差组合为 1号 ，能扩增出 8条
弱带，仅有 1条强带(图 4中 1泳道)。极差 R反映
了影响因子对反应体系的影响情况，R越大，影响越
显著。由表 3可知各因子不同水平的变化对海南龙
血树 RAPD-PCR反应 的影响从大到小依 次为：
dNTP>引物>DNA模板>Mg抖>Taq酶。
表 2 RAPD-PCR正交试验设计表
Table 2 Orthogonal design for RAPD-PCRELIs(4s)]
图 4 止交试验分析结果
Fig．4 Analysis results of orthogonal design
(M 100 bp plus；1～16．处理编号同表2)
表 3 正交设计结果直观分析
Table 3 Intuitive analysis of orthogonal design
2．7有效 引物筛选
采用上述优化后的反应条件，以3份生境差异
显著的材料之 DNA为模板 ，对经初选后有 2条 以
黜 黜黜ⅢⅢ m ⋯
1期 郑道君等：海南龙血树 RAPD—PCR反应体系的优化 35
上扩增产物的引物进行多态性引物筛选。结果表
明，共 l8条引物表现出较好的多态性，其编号及序
列见表 4。
3 结论与讨论
单因子试验即在保持其他因子一致不变的条件
下 ，变化单一因子 ，分别研究各影响 因子对 RAPD～
PCR反应的影响情况 ，已被广泛应用于 RAPD—PCR
反应体系的优化中(邵敏等，2009；孙丽娜等，2007 ；
周则刚等 ，2008；黄玉源等，2009；张志勇等 ，2009)，
但此方法忽视了各因子间的互作效应。正交设计试
验可弥补上述的不足，它具有均衡分散 、综合可比和
效应明确等特性 (李鹏等，2008)，可了解各因子间的
内在规律，较快找到最优的组合条件，并可明确影响
扩增的主要因子和次要 因子 (明道绪 ，2007)。自倪
星群等(1995)将正交试验应用于 PCR反应体系优
化 中，何正文等(1998)对其统计方法进行简化后 ，该
方法已在 PCR反应体系优化研究中广泛应用(黄夕
洋等，2008；张安世等，2009；沙伟等，2004)。但不同
表 4 所筛选出的 RAPD引物及其序列
Table 4 Selected RAPD primers and scorresponding sequences
的物种 ，其各 RAPD—PCR反应 影响 因子的适宜水
平有很大差异 ，而正交设计应是从各 因子 中挑选 出
适宜的水平进行试验。因此 ，为确保应用于正交试
验设计的各因子水平的合理性，使其分析结果更加
科学，本研究在单因子试验的基础上，找出各因子的
适宜反应浓度水平用于正交试验优化以找出最佳反
应条件。结果表明，在所研究 的 5个海南龙血树
RAPD-PCR反应影响因子 中，dNTP浓度的影响最
大，R值为 6．75；引物 与 dNTP相 当，R值 为 6；而
Taq酶浓度的影响最小，R值仅为 1．25。这与部分
学者的研究结果不一致。张安世等(2009)在进行水
稻RAPD反应条件优化时发现，各因子不同水平的
变化对 RAPD—PCR的影响依次为：dNTP浓度>
Taq酶>Mg 浓度 ==引物浓度 。沙伟 等(2004)研
究表 明，在 藓 类 植 物 RAPD 分 析 的 影 响 因子 中
dNTP浓度影响最大，其余依次为 Taq酶、模板
DNA浓度和引物浓度。作者认为以上分析结果 的
差异主要是由于不同物种 DNA所具有的特性所
致，同时与不同厂家、批次 Taq酶的质量等也有较
大关系。
经过上述单 因子试验与正交试验 ，确定海南龙
血树最佳 RAPD—PCR反应条件：在 25 L反应体系
中包含 1O×bufer 2．5 L，2．0 mmol／L MgC12，300
#mol／L dNTPs，Taq酶 1．5 U，引物 0．8~mol／L，
DNA模板 2O ng；其PCR扩增程序为：94℃预变性 4
rain，然后按 94℃变性 40 S，38℃退火 45 S，72℃延
伸 120 s，进行 4O个循环 ，最后 72℃延伸 8 min。在
此基础上，本研究筛选出18条适用于海南龙血树保
护遗传学研究的有效多态性随机引物。
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86 广 西 植 物 31卷
光照强度均增加，开花的数量增大，传粉者开始频繁
地访花，且此时果实开始形成 ，因此这个时期花的生
物量较高。至有性生殖末期 ，花蕾和花几乎都凋零 ，
果实的生物量就增加。
如果分配给繁殖的资源量增加 ，分配给存活、生
长的资源量就会减少 ，进而影响到植物未来 的生长
与发育。当环境条件较好时，植物营养体较大，光合
产物较多，既可维持较高 的生育率 ，又可在生长、存
活等方面投入更大的资源 ，多年生的柔毛淫羊藿植株
一 般先只进行营养生长，达到一定个体大小之后才开
花结实，此后大部分资源分配给繁殖，而一小部分分
配给营养生长，以维持其基本的生长、存活需要。因
此柔毛淫羊藿是营养生长和有性繁殖活动同时存在，
存活、储藏和繁殖活动同时需求资源的投入。
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