全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21(4)：353— 357 2001年 11月
小球藻的异养生长及培养条件优化
张丽君，杨汝德，肖 恒
(华南理工大学食品与生物工程学院，广东广州 510640)
摘 要 ：对小球藻异养培养 中的碳源、氮源、微量元素一镁离子以及其他培养条件的影响进行 了探讨 ，并测
定了小球藻的生长曲线 优化结果：C：N为 4 1 5 1，硫酸镁的量为 1 g／[ ；培养条件为：pH6~7t接种量
10 ，温度 30。C。在此条件下，异养培养小球藻，其 OD值可达 l8，蛋白质为 30 ．叶绿索含量为 1．2 。
关键词 ：小球藻；异养培养{生物量
中图分类号：q949．21 7 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2001)04 0353 05
The hetertrophic cul ture 0f Chlorella and
optimization 0f growth condition
ZHANG Li—jun，YANG Ru—de．XIA0 Heng
c The Food and Biotechnology l~titule ／South China UnbJ~fty oJ了1 g ．Guangzhou 51 0640·China)
Abstract：The efect of carbon 8ources-nitrogen sources·microelement—M g” and culture condition for het—
erotrophic culture of Chlorela was researched．．We also get the growth c~rve．The results of optimizat[o~：C／N
is 4：1～5：1．MgSO is lg／l ；pH is 6～ 7，inoculationis 1O ，temperature is 30。C．Underthis condition，
the OD is 18，protein concentration is 30 ．chtorophytl concentration is L．2
Key words：Chlorelta；heterorrophic；bioⅡ1ass
小球藻为绿藻门小球藻属(Chlorela)单细胞绿
藻，生态分布广，易于培养，生长速度快，应用价值
高。小球藻细胞除了可在自养条件下利用光能和二
氧化碳进行正常的生长外，还可以在异养条件下利
用有机碳源进行生 长繁殖 ，生长速度 比光照条件下
快，类似于细菌的代谢生长 ’。
小球藻含丰富的蛋 白质、多糖、脂 类、叶绿素、
维生素、微量元素和一些生物活性代谢产物，具有
全面而均衡的营养价值，毒理学研究表明是无毒级
物质，广泛应用于保健食品、饲料、食品添加剂、精
细化工 品和医药制剂原料。 。因此长期以来 ．小球
藻不仅是生物学研究中优良的实验材料，而且是受
人注目的开发利用对象。目前大规模培养主要采用
开放池式户外培养，这种传统的、低产量的池塘光
培养系统已不能满足要求 80年代以来各种半密闭
和密闭培养系统的研究受到广泛重视，应用各种光
生物反应 器进行间歇流加 、连续 流加等方式 培养，
在一定程度上提高了小球藻的产量和产率“ 。但
由于仍然采用光照自养方式，生产效率井投有得到
根本的改变 以有机物作为小球藻的唯一碳源进行
异养培养，具有无需光照，细胞增殖快，浓度高，生
产系统易于实现自动控制，可利用现有的发酵设备
等优点，国外对此已引起高度重视 。国内对小球藻
的异养培养报道甚少，为了提高小球藻的产量和产
蛭稿 日期 ：2000 0j一22
作者简介：强丽君(1 975一)，女，河北元氏^．发酵工程硬士，从事微生物发酵盈生物制药方向研究
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354 广 西 植 物 21卷
率。满足日益增长的市场需求，我们研究了用异养
方法高细胞密度培养小球藻 ，探讨了异养培养小球
藻的一些影响因素 。
1 材料与方法
1．1藻种
小球藻(Chlorela wdgarls)种 由香港大学陈峰
博士惠赠，用基础培养基。 制成琼脂斜面保存种。用
基础培养基二级放大用于实验研究。
1．2培养基组成与培养条件
基础培养基为小球藻光自养培养基添加葡萄
糖 10 g／L配制而成，调 pH6．1。实验培养基根据需
要对培养基成分作相应调整。250 mI 三角瓶装培养
基 100 mI ，12l。c灭菌 20 min。超净工作台接种和
取样，30℃ 1 S0 r／min旋转摇床暗培养。
1．3测定方法
1．3．1藻生物量测定“ 采用浊度比色法。用 721
分光光度计测定培养液在 540 nm处的吸光度
(OD。 )。
1．3．2叶绿素测定 采用丙酮提取比色法。取 l mI
藻培养液离心洗 涤，在藻体沉淀 中加人 80 丙酮，
4屯 冰箱提取 24 h，再离心分离丙酮提取液，测定
其在663 nm和 645 am处的吸光度(A 和A )，根
据公式；总叶绿素一8．02×A +20．2×A ． 来计算
叶绿紊的含量。
1．3．3硝酸根的测定⋯ 采用酚二磺酸分光光度
法。
1．3．4葡萄糖的测定“ 采用二硝基水杨酸法 。
1．3．5粗蛋白测定“ 采用凯氏定氮法。
2 结果与讨论
2．1生长 曲线
在开始对小球藻的特性进行研究之前，有必要
对异养培养时，小球藻的生长过程有一了解 本实
验中藻种在恒温培养箱中培养一段时间后取出，按
10 的接种量接入液体培养基，从 0 h开始，每隔 4
h取样测OD、pH，得到其生长血线(图 1)。
细胞的生长过程大致呈“s形”，从图 1中看，其
调整期较长，约为 12 h，12～36 h之间为对数生长
期，36 h后进人稳定期，48 h后再延长培养时间，生
物量无明显变化，即进入衰亡期
2．2培养基组成对小球藻生长的影响
2．2．1最佳葡萄糖与硝酸钾之 比 有前 人报道知 ，
葡萄糖为异养培养小球藻的较好碳源。虽小球藻不
能直接利用 NO；-中的氮，而是首先在硝酸盐还原酶
的作用下将其还原为 NO；再由亚硝酸根还原酶将
其彻底还原为 NH+才能被小球藻吸收利用，这一
过程需耗用一定的能量。但通过利用硝酸氨、尿素、
氯化铵、硫酸氨、硝酸钾作为氨源的比较实验，发现
氨盐作为氮源时，氨根离子直接被小球藻吸收，但
为保证细胞内电荷平衡而释放出氢离子使得培养
液的pH值下降，在酸性条件下，小球藻的生长会受
到抑制。虽然以硝酸钾作为氨源会消耗能量，但小
球藻在吸收硝酸盐过程中伴随质子共转运(NO~-／
H Symport)使得培养基中的质子浓度降低，培养液
的pH值上升。 ，这有利于小球藻的生长。因而，硝
酸钾仍为最好的氮源。但葡萄糖与硝酸钾的含量之
比是影响其生长的主要因素 。
0 8 l 6 24 32 40 48 56
t／h
图 1 小球藻生长曲线
Fig．1 The growth cHrvc of Chtoretla wutgaris
本实验按照 36个不同的c：N比分别称取葡
萄糖为 10、13、1 6、2：0、25 g／i ，分别记为c c。、c
c G ，硝酸钾分别为 1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5、
4．0、4．5、5．0 g／I ，其他成分不变。接种量 10 ，摇
床培养 48 h 所得结果如图2
由图 2可以看出，对同一个硝酸钾浓度，OD值
随着葡萄糖浓度的增加而增加，可见葡萄糖利于小
球藻细胞的分裂，但测定蛋 白质、叶绿紊含量，并无
明显 的增加 ，可见并未增加代谢 物的积累，因而本
实验中取葡萄糖浓度为 10 g／t t而同一葡萄糖浓
度，在实验范围内不同硝酸钾浓度对小球藻的生长
影响不是很大，只有当葡萄糖浓度与硝酸钾浓度之
工
5 5 _0
8 8 7 7 6 6
8 6 4 2 O 8 6 4 Z O
0o
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4期 张丽君等：小球藻的异养生长及培养条件优化 355
比在 5：I～4：1之间时，OD值为最大，如当葡萄
糖浓度为 10 g／[ ，硝酸钾浓度为 1．5～2．o之间时，
OD值达 16．648；再测定培养液中的NO7浓度发现
(表 1)，硝酸钾起始浓度在 O～2 g／I 48 h后培养液
中所剩的NO；浓度为 0 g／i ，而硝酸钾起始浓度大
于 2 g／1 时，所剩的浓度太于 0 g／i ，两者差值在 2
g／[ 左右。可见，葡萄糖的浓度为lo g／[ 时，小球藻
消耗硝酸钾的最大量为 2 g／i ，即消耗最大c；N
(葡萄糖与硝酸钾之比)为 5：1 分别测定上述不同
c：N下的 OD值、粗蛋白、叶绿素发现在 4：1～5
：1时，其最终 OD值、粗蛋白、叶绿素最高分别为
1 6 、31 、1．03 。所以，葡萄糖与硝酸钾的比为 4
：1～5：1，采用葡萄糖浓度为 10 g／[ ，硝酸钾浓度
为 1．6 g／i ．
35
30
25
凸 2O
。 1 5
l0
5
0
1 l_5 2 2．5 3 3．5 4 4．5 5
硝酸钾 (g／L)
— C10—●卜IC13—．广_C16— C20—．_C25
图 2 不同碳氮比对小球藻生长的影响
Fig 2 The effect of different C／N ol the growth
of Chlorelta vulgaris
表 1 硝酸钾的消耗状况
Table 1 The consumption of KNOj
项目 硝酸钾的难度
Items Concentration of KNO，(g／L)
0 h 0 0．25 0 5 1 O0 l 25 1 5 2 2 5 3．0 3 5 4．0
48 h 0 0 0 0 0 0 0．07 0 5ll O5l 55 2 05
差值 0 0 25 0．5 1．O01．25 1．5 1．g31．991．951 951 g 5
2．2．2微量元素～镁离子对小球藻生长的影响 除
碳源、氮源外，元机离子也是营养组成之一。由于镁
离子是构成叶绿素与某些辅酶的主要元素，因而对
小球藻的生长也极为重要 。
本 实验首先将二级种子液在无镁培养基培养
24 h取出再接人硫酸镁浓度分别为 0、0．5、1、2、3 4
g／l 的培养基中，摇床培养 48 h。其结果如图 3。
由图3可以看出，当硫酸镁浓度为 0．5 g／I，时，
其 OD值为 1O．2，叶绿素含量为 o．5 ，硫酸镁浓度
为 1 g／L时，其 OD值为 1 6．5，叶绿 素含量为 1 。
若硫酸镁浓度再增加，OD值、叶绿素含量基本不
变。因而硫酸镁浓度为 0．5 g／f 时已经满足小球藻
的需要 。而一般取硫酸镁浓度为 1 g／1 。
2．3环境条件对小球藻生长的影响
培养基是小球藻生长的营养源．培养条件同样
是影响小球藻生长的重要影响因素 ，主要有 pH、温
度、接种等。
2．3．1 pH值对小球藻生长的影响 调培养基的起
始值pH为 4、5、6、7、8、9，摇床培养 48 h。测得最终
OD值、pH值，结果如下：
O 2 3 4 5
硫酸镁 (g／L)
L 2
1
0．8
n 6
0．4
2
0
图 3 硫酸镁对小球藻生长的影响
Fig．3 The effect of MgSO．on growth of
Chlorella z~ulgar
由图 4可以看出，虽然起始 pH值不同，但是随
着培养时间的延长 pH会调整到相当水平。24 h之
前，pH为 8。随着时间的延长，会下降到 7左右。而
pH为 4、5、6的会 随着时间 的增加 上升到 7，初 始
pH为 7的随时间变化不大，而后变化趋势相同，最
终的pH也相差不多，大约在 8．5左右。可见，在实
验范围内小球藻可将 pH值调整到最适 pH。
由图5可知，随着时问的延长，虽然起始的pH
不同，但OD的变化趋势相同。硫酸钾不断的被还原
利用，使得 OD值不断的上升，48 h后 ，硝酸钾的消
耗量已达到小球藻的最大利用量，OD值的变化趋
于平缓。培养液的初始 pH为 4、5时，其最终的OD
值较低，培养液的pH为 8．2，而为 6、7、8时，其最终
的 OD在 1 6左右 ，培养液的 pH在 8．5左右。pH为
3时会严重抑制小球藻的生长，且细胞会发生黄化
现象。另调起始pH为 9、10，48 h后，起始 pH为 9
的最终结果与 pH为 8相当，而培养液的韧始pH为
8 6 4 2 O 8 6 4 2 O
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1 0时，OD值会下降至 10．2，培养液的 pH 变化不
大。可见初始 pH较低时，不利于小球藻的生长，而
初始pH增加至 lO时，OD值又会下降，镜检发现，
细胞体积较大，密度较小。这是由于 pH大于 9．5
时 ，母体细胞的细胞壁的弹性增加 ，不断膨胀 ，子细
胞分裂后无法 冲破母体细胞壁，因而不能脱离母体
8
7
毛6
5
4
0 8 16 24 32 40 48 56 64
t／h
圈 4 不同初始 pH时实际 pH的变化
Fig．4 The variation of pH under different original pH
9
8．5
8
毛 7．5
7
6．5
6
细胞，使得母体细胞不断增大，出现沉淀现象。
由上述可知，培养液的初始 pH 为 6、7、8时利
于小球藻的生长。pH为8时，灭菌时会引起类似于
美拉 得的反应 ，培养 液的颜 色稍 有加深 不利于观
察。所以初始pH最好选择在 6～7之间，一般调pH
为 6．1
l8
l6
l4
l 2
口 l0
0 8
6
4
2
0
0 l0 20 30 40 50 60 70
t／h
图 5 不同韧始 pH时 OD的变化
Fig．5 The variation of OD under diferent original pH
2O
18
l6
14
l2
8 10
8
6
4
2
O
0 8 16 24 32 40 48 0 8 16 24 32 40 48
t／h tfh
图 6 不同温度下 pH的变化
Fig 6 The variation of pH under different temperature
2．3．2温度对小球藻生长的影响 微生物的生长和
产物的合成都是在各种酶催化下进行的。温度是保
证酶活性的重要条件，因此在微生物发酵系统中必
须保证稳定而适合的温度环境条件。
在本实验 中，取 36个 250mI 摇瓶分为 3组 3
个 不 同的 温度，即 24 C、30。C、32℃，接种 量 为
l0 ，培养 48 h，每次取 2个进行测定。结果如下：
由图 6、7可知，在生长温度范围内，较高温度，
延期较短，在细胞培养周期中，细胞内酶活性强，代
谢旺盛 较低温度培养时 ，由于细胞对低温的适应
图 7 不同温度下 OD的变化
Fig．7 The variation of OD under different temperature
期较大 所需时间较长，这可能由于细胞膜在低温
下发生改变，与膜有关的运输和呼吸代谢功能受到
影响，需要一段较长的时间重新 建立细胞 内外的离
子平衡 从 图 6也可以看出，在一定实验 温度范围
内，藻细胞的生长速率随温度的升高而增高。对 于
pH的变化来说，温度高，pH上升快，低温条件下，最
终的 pH也较低。从叶绿素测定来看，24。C最终为
70 mg／I ，30。C为 82 mg／I ，32。C为 3 mg／I ．由以
上结果看，培养温度为3O℃
2．3．3接种量对小球藻生长的影响 率实验取 3个
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4期 张丽君等：小球藻的异养生长及培养条件优化 357
相同型号的 250 ml 的三角瓶，装培养液 100 mL，
接种量分别为5 、10 、l5 。摇床培养，每 4 h取
样 1次测 OD值得到如下结果 ：
由图8可知，接种量为 5 ，20 h前生物量增加
缓慢，而后才迅速增加，培养相同的时间后，最终
OD比接种量为 l0 、1 5 较低。接种量低，细胞数
目增加的缓慢，调整期长。而接种量为 l5 ，调整期
短，8 h便可进入对数生长期，最终的OD值最大，但
需种量大为制种过程增加工作量。接种量为 10 ，
培养相同时间后，最终 OD与接种量为 l5 的相
当，所以一般采用接种量为 10 。
I8
l6
14
12
。 lO
一 8
6
4
2
O
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
tth
图 8 接种量不同对小球藻生长的影响
Fig．8 The effect of different inocutation。n
growth of Chlorelta wdgaris
3 结 论
小球藻是食品、医药行业的重要原料，小球藻
的开发利用前景广阀。如何用低成本、高产量、易控
制的异养培养方式生产出富含多种营养成分的小
球藻是大规模生产的关键。本文只是对通过摇瓶培
养异养培养的培养基、环境条件做了初步研究，得
到优化培养基主要成分：c：N为4：1～5：1，硫酸
镁的量为 1 g／i ；培养条件为：pH为6～7，接种量为
1 0 ，温度为 30。c，在上述条件下培养小球藻，其
OD可达 18，蛋白质为 30 ，叶绿索含量为 1．2 g／
L。若要用于生产有待进一步进行研究 。
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