全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(3)：457— 461 2007年 5月
大规模茶叶细胞悬浮培养茶氨酸
合成工艺优化研究
吕 虎1，华 萍2，余继红1，冷和平3，蒋献猷3，华 东1
(1．江西师范大学 生命科学学院，南昌 330027；2．江西医学院 基础医学部 ，
南昌 330006；3．江西绿色制药有限公司，南昌 330002)
摘 要：以婺源绿茶为材料进行茶叶愈伤组织悬浮培养，采用正交实验设计进行了大规模茶叶细胞悬浮培养
合成茶氨酸工艺条件优化研究。结果显示，NH4+／Y 0．0／60．0 mmol／L、K+100．0 mmol／L、Mg++3．0
mmol／L、HzPO 3．0 mmol／L、蔗糖 30．0 g／L、水解酪蛋白2．0 g／L条件下，茶叶细胞生长量(速率)和茶氨酸
积累量均达到最高值；提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可延长细胞对数生长期和稳定生长期，从而有利
于茶氨酸积累；HzP 浓度主要影响细胞生长速率和茶氨酸积累速率的同步性，低 HzP 浓度环境中茶氨
酸积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值，高 HzPO：4浓度环境中早于细胞生长速率峰值出现时间；K+和
Mg++对细胞生长的影响不明显，但影响茶氨酸合成酶活性，维持适量的 K+和 Mg++有利于茶氨酸积累。
先加入一定量盐酸乙胺再每天进行少量补充，茶氨酸合成量比一次性加入的效果要好。从生产效率考虑，培
养周期以 19～22 d为宜。
关键词；茶氨酸；茶叶；悬浮培养；生物合成
中图分类号：TQ460，Q946 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2007)03—0457—05
Study on theanine biosynthesis in tea
cell suspension culture
Ln Hu ，HUA Ping2，YU Ji—Hong ，LENG He-Ping3，
JIANG Xian-You3，HUA Dong1
(1．College of Li Sciences，Jiangxi Normal University，Nanchang 330027，China；2．Basic Department，
Jiangxi Medical College，Nanchang 330006，China；3．Jiangxi Green Pharmacy Co．Ltd．，Nanchang 330002，China)
Abstract：The suspension culture on the calus obtained from W uyuan tea were conducted in a fermenter and then the
effects of different factors on the growth of tea cells and the amount of synthesized theanine were analyzed．The re-
suit showed：the theanine accumulation peaked between nineteenth day and twenty-second day in a culture period．
The growth of tea cells and the amount of theanine presented an optimal increment，when there are NH4+／NO§0．0／
60．0 mmoI／ I ，K+100．0 mmol／L，Mg++3．0 mmol／L，HzPO~3．0 mmol／L，sugar 30．0 g／L，protein 2．0 g／L in the
medium．The log phase and the stationary phase were enhanced when the amount of sugar and protein raised in the
medium．The simultaneity of tea cells growth and theanine accumulation was changed by the diferent amount of
Hz PO~in the medium．The activity of theanine-synthatase(L-glutamate：ethylamine lingase)was effected by K+
and Mg++．Accumulating-content of theanine could greatly raised when ethyl—amine(ZtNH2-HCI)added，with multi-
addition ZtNHz—HCI performing better than the one-time addition of ZtNHz-HCI at a specific amount at first and
then a smaler amounts．
Key words：theanine；tea；suspension culture；biosynthesis
收稿日期：2005—06—30 修回日期：2006一O1—20
作者简介：吕虎(1962一)．男，江西永修人，教授，主要从事天然产物深度加工与综合利用研究。
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茶氨酸(N一乙基一L_谷氨酰胺，N—ethyl—L-gluta—
mine)主要存在于山茶科植物中，为茶叶的特征性氨
基酸，也是茶叶的呈味物质之一，其含量与茶叶的品
质和等级呈正相关(高小红等，2004)。茶氨酸可调
节体内儿茶酚胺、5一羟色胺等神经递质分泌量、具有
对咖啡因的拮抗作用、影响多巴胺释放等从而发挥
降血压、静心安神、促进大脑功能等多方面的药理作
用(高小红等，2004)；并且可以干扰谷氨酰胺代谢等
作用而抑制肿瘤细胞生长和肿瘤转移(高小红等，
2004)；作为食品添加剂，茶氨酸可抑制其它食品中
的苦味和辣味物质、改善食 品风味 (高小红等，
2004)；在食品和医药行业中具有很高的应用前景。
目前，已经探索过的茶氨酸制备方法主要有化学合
成、微生物发酵、茶树愈伤组织培养和茶叶中提取
等。近年来，茶树愈伤组织培养合成茶氨酸研究已
日益为人们所重视。固体培养基和液体培养基摇瓶
振荡培养研究表明，向培养基中添加初级胺类前体
物质(高小红等，2004；杜荣茂等，2003；汤皴，2002；
Takanobu等，1992；Tsutomu等，1990)、适宜的植
物激素组合(成浩等，2004；汤皴，2002；钟俊辉等，
1997)可大幅度提高愈伤组织茶氨酸合成量；培养基
中宏量元素含量、碳源、氮源等因素都对茶树细胞生
长量与茶氨酸合成量具有不同影响(成浩等，2004；
高小红等，2004；钟俊辉等，1997)。但大规模液体培
养的报道少见。本文采用婺源绿茶为材料进行茶叶
愈伤组织悬浮培养，在单因素研究和机械搅拌式发
酵罐培养放大研究的基础上，进行了大规模茶叶细
胞悬浮培养合成茶氨酸工艺条件优化研究。
1 材料与方法
1．1实验材料
由江西婺源县嶂公山地区采集的婺源绿茶嫩
叶，经 1O 次氯酸钙溶液 15 min表面消毒后在固
体培养基上诱导成为愈伤组织，取其中较为疏松的
愈伤组织在含 0．5％纤维素酶的 MS液体培养基中
消化 30 min后接种到 MS液体培养基中置摇床振
荡培养(转速 100±10 rpm，振幅 2～3 cm)，每 7 d
续代 1次，接种量为原培养液 ：新鲜培养基=1：2。
连续续代 7次后将三角瓶静置 30 min，取上层细胞
液建立悬浮培养细胞系。
1．2培养方法
搅拌式发酵罐(20 L，Bi0engineering NLF22)，
桨叶型板搅拌器，转速 90 rpm，通气量 1．0～1．2
vvm 接种量5g鲜细胞／100 mL培养基；于培养第 5
天加入25 mmol／L盐酸乙胺；培养温度 26±l℃。
1．3基础培养基
MS培养基(含 IBA 2 mg／L，6-BA 4 mg／L)。
1．4培养基成分对细胞生长与茶氨酸合成量的影响
采用正交实验设计，考察大规模培养过程中培
养基中氮源、碳源、K 、Mg++、H：P 、NH ／N
等因素对细胞增长量和茶氨酸积累的影响。
表 1 因素水平表
Table 1 Factors and Ievels
因素 Factor
8O．O 1．O
1O0．O 2．O
120．O 3．O
1．5细胞总量与活细胞数测定
取定量悬浮培养液 2 000 rpm离心 10 min，取
沉淀7O℃恒温箱中干燥至恒重精密称出细胞总重
量。活细胞数参照郑国昌等(1993)的方法进行。
1．6茶氨酸含量测定
精密称出定量经7O℃恒温干燥至恒重的细胞，
粉碎后用 8O 乙醇溶液(75～8O℃)浸提 2 h，浸提
液经过滤后作为上样液。采用氨基酸分析仪(日历
835—50型)；分析条件为分离柱 ‘P4 x 150 mm，树脂
日历 2619 F；滤氨柱 ‘p4 x 150 mm，树脂 日历 2650；
缓冲液 I pH1．6，缓冲液泵流速 0．45 mL／min，压力
90 kg／cm ；印三酮流速 0．30 mL／min，压力 10 kg／
cm ；进样量 500 L。
2 结果
2．1培养基成分对细胞生长与茶氨酸合成量的影响
表 2中10～28 d列数据分别为培养不同天数
取样检测结果；做 3个平衡，结果取均值；检测结果
中第一行数据为茶叶细胞总量(g／100mL)，第二行
数据为茶 氨酸 积 累量 (mg／gDW)。结果显示，
NH ／N 、K 、Mg++、H：P 、等宏量元素不同含
量以及蔗糖、水解酪蛋白不同浓度的组合对茶叶细
胞增长周期、生长量和茶氨酸积累量均产生影响。
由此可见，培养液中茶叶细胞总量和茶氨酸积累有
嚣F E
+
c
mB
A
平
水
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密切关系；以茶叶细胞量和茶氨酸积累总量为考察
指标，6种主要因素的最佳组合为 A B2C DzE-F ，
即 NH+／N 0．0160．0 mmol／L、K 100．0 mmol／
L、Mg++3．0 mmol／L、H2P 3．0 mmol／L、蔗 糖
30．0 g／L、水解酪蛋白2．0 g／L条件下，茶叶细胞生
长量(速率)和茶氨酸积累量均达到最高值。结果还
显示，提高培养基中蔗糖和水解酪蛋白浓度可使细
胞对数生长期和稳定期得到延长，从而有利于茶氨
酸积累；H。P 浓度主要影响细胞生长速率和茶氨
酸积累速率的同步性，低 H。PO 浓度环境中茶氨酸
积累速率峰值滞后于细胞增长速率峰值，高 H。POa
浓度环境中茶氨酸积累速率峰值出现时间前移；K
和 Mg++对细胞生长的影响不明显，但影响茶氨酸
合成酶活性，维持适量的K 和 Mg++有利于茶氨
表 2 L18(37)正交实验设计及结果表
Table 2 Design and results of orthogonal test
注：(1)10~28thd列数据分别为培养不同天数取样检测结果}做 3个平衡，结果取均值。(2)检测结果中第一行数据为茶叶细胞总量(g／
100mL)，第二行数据为茶氨酸积累量(mg／gDW)。
Note (1)The data were tested separately on 10～28 d during the culture．The result was valued by three samples．(2)The data in 1st line
is cel quantity(g／100mL)during the culture．The data in second line is accumulation of theanine(mg／gDW)during the culture．
酸积累。
2．2盐酸乙胺及其添加方式对茶叶细胞生长与茶氨
酸积累量的影响
表 3中做3个平衡，结果取均值i第一行数据为
不加盐酸乙胺；第二行数据为培养第 5天加人 25
mmol／L盐酸乙胺；第三行数据为培养第 5天加人
2O mmol／L盐酸乙胺，并且每天流加盐酸乙胺(1
mmol／L)。可见，添加茶氨酸合成前体物质盐酸乙
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胺对茶叶细胞生长量影响较小，培养前期细胞增长
量基本一致，培养后期添加前体的细胞增长量略有
增加。但是，添加盐酸乙胺后对茶氨酸合成量的影
响非常明显。在没有添加前体物质时，培养细胞中
的茶氨酸合成量很少并且几乎没有增加；当添加了
盐酸乙胺后，细胞中的茶氨酸合成速率从培养后第
10天后开始迅速增加，培养到第 19～22天达高峰，
接着逐渐下降。以不同方式加入盐酸乙胺对茶氨酸
合成量影响也不相同；先加入一定量盐酸乙胺再每
天进行少量补充，茶氨酸合成速率比一次性加入的
效果要好，茶氨酸合成高峰时间在培养 22 d出现。
添加的前体物质能促进或诱导细胞中茶氨酸合成活
性，使细胞充分利用前体进行茶氨酸合成；先添加特
定量、然后再逐步补充前体物质可以在培养基中维
持一定浓度的盐酸乙胺，有利于提高茶氨酸合成速
率和积累量。
表 3 盐酸乙胺加入方式与茶叶细胞生长／茶氨酸积累的关系
Table 3 Growth dynamics of tea cell and accumulation of theanine with ethyl—amine added in different methods
培养时问 Cultured duration(d)
细胞总量 (g／100m1 )
Cell quantity
茶氨酸积累量 (mg／gDW)
Accumulation of theanine
1O．89
1O．22
1O．O5
46．66
51．26
68．72
14．34
14．39
15．OO
45．O2
107．O5
122．33
16．OO
16．33
16．O9
43．15
205．57
206．16
15．47
16．19
15．8O
34．1O
201．OO
197．64
14．52
14．84
14．77
29．76
16O．28
172．31
注；做 3个平衡，结果取均值；第一行数据为不加盐酸乙胺；第二行数据为培养第 5~／JnA 25 mmol／L盐酸乙胺；第三行数据为培养第 5d／JnA
20 mmol／L盐酸乙胺．并且每天流加盐酸乙胺(1 mmol／L)。
Note： The result was valued with three samples from fermenter；the data in the 1st row without precursor；the 2nd row added with ZtNHz—
HC1(25 mmol／L)on the 5th day during the culture；the 3rd row added with ZtNHz—HCI as 20 mmol／L on the 5th day and 1 mmol／L in every
day during the culture．
3 讨论
近年来，茶树愈伤组织培养生产茶氨酸成为研
究热点，在固体培养基和液体培养基摇床中小规模
进行培养的报道较多，但采用发酵罐大规模进行培
养的报道少见。本文在单因素研究基础上设计了本
文中主要考察因素水平，通过正交设计进行发酵灌
放大培养试验，结果显示，在一个培养周期中，茶叶
愈伤组织细胞呈现几个不同的生长阶段，培养的第
10天开始茶叶细胞生长进入加速期(acceleration
phase)，细胞数量逐渐增加；第 l3天开始进入对数
生长期(1og phase)，细胞总量迅速增加；从第 l9天
前后细胞增长速度减慢而转入稳定生长期(station—
ary phase)。茶氨酸的合成速度在细胞对数生长中
后期开始迅速增加，积累速率略滞后于细胞增长，但
将培养基中H：PO；浓度提高时，茶氨酸积累峰值前
移；并且茶氨酸积累量与愈伤组织生长量密切相关。
Takanobu等(1992)和 Tsutomu等(1990)的研究显
示，根据培养前的条件、培养基性质不同，细胞延滞
期、加速期、对数期和稳定期持续天数略有差异；茶
氨酸积累量增长略滞后于细胞量增长；本文的研究
结果验证了上述研究结果。本文研究中获得的 6种
主要因素的最佳组合为 A。B：C D2E。F ，即 NH ／
NO：j0．0160．0 mmol／L、K 100．0 mmol／L、Mg
3．0 mmol／L、H2PO 3．0 mmol／L、蔗糖 30．0 g／L、
水解酪蛋白 2．0 g／L条件下，茶叶细胞生长量(速
率)和茶氨酸积累量均达到最高值，与其它文献
(Takanobu等，1992；Tsutomu等，1990；张莹等，
2003)报道的在摇瓶培养和固体中获得最佳组合各
主要因素含量有一定的差异。提示，摇瓶培养获得
的工艺参数不能直接用于放大培养；进行工业放大
时应综合考虑各种因素影响。
研究表明，茶氨酸合成酶仅为茶树所特有，对
L_谷氨酸、乙胺和 ATP有较高的特异性亲和力
(Matsuura等，l965)；但在没有添加前体物质的条
件下，来自根、茎、叶的愈伤组织中茶氨酸的合成能
力较弱，其中以嫩叶的愈伤组织茶氨酸的合成能力
相对较高(成浩等，2004)。当培养基中添加盐酸乙
胺等初级胺类前体物质可大幅度提高愈伤组织中茶
氨酸合 成 量 (Takanobu等，l992；Tsutomu等，
1990)。资料报道，当在培养基中添加 25 mmol／L
的乙胺时，茶叶愈伤组织的茶氨酸合成量处于最大
值(钟俊辉等，1997；汤皴，2002；张莹等，2003)。本
文研究通过对一次性添加和逐步流加方式补充前体
物比较研究结果显示，培养基中盐酸乙胺浓度维持
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在 20 mmol／L以上时，茶叶愈伤组织的茶氨酸合成
量和细胞生长量即可保持良好状态；大规模培养时
以流加方式补充前体物可使细胞中茶氨酸合成酶活
性水平处于较高状态，在细胞密度较高时更是如此；
这可能是茶氨酸合成速率需要维持一个稳定的前体
物质浓度才能处于最佳状态。
钟俊辉等(1997)报道，增加培养基中糖浓度有
利于茶氨酸等次生代谢物的累积；暗培养条件下茶
树愈伤组织细胞生长率虽然略低于光照培养，但茶
氨酸积累却大幅度提高(由光照培养的 58．72 mg／
gDW 提高到 l67．87mg／gDW)。这是代谢形成的
茶氨酸不会被茶细胞很快利用掉而贮存起来的结果
(钟俊辉等 1997)。茶树体内，在茶氨酸合成酶作用
下利用谷氨酸和乙胺(消耗 ATP)合成茶氨酸；如果
茶树光合作用旺盛，茶氨酸分解代谢就会加速，其碳
架参与茶多酚形成及其它相关物质代谢；因此，当光
合作用加强、大量进行碳素同化作用时细胞内茶氨
酸含量降低，而碳素同化作用降低则茶氨酸积累量
提高(汤皴，2002)。梁晓岚等(1994)报道，使用氮肥
可以促进茶树茶氨酸合成。本文研究显示，提高培
养基中蔗糖和水解酪蛋白含量可提高细胞内茶氨酸
积累量，这种特征与茶树体内茶氨酸合成特征一致；
其原因可能是由于降低了茶叶细胞碳素同化作用。
因此，大规模悬浮培养茶叶细胞时应保持适当的有
机碳和有机氮浓度，以利于茶氨酸大量积累。
日本学者 Matsuura等(1965)首次报道从茶树
根中分离出茶氨酸合成酶(theanine—synthatase，L-
glutamate：ethylamine lingase)，并证 实该酶对谷
氨酸、乙氨和 ATP有较高的亲和力，酶分子中含有
松散结合的金属离子。但是由于茶氨酸合成酶在细
胞外较容易失活，K 和 Mg++等金属离子对酶活性
的作用机制研究被研究者们所省略。资料报道(王
镜岩等，2002)，几乎 1／3的酶催化活性需要金属离
子，金属结合酶(metaloenzyme)含有紧密结合的过
渡金属离子(如 Fe 、Fe 等)，金属一激活酶含松
散结合的碱和碱土族金属离子(如 Na 、K 、Mg++
或 Ca++等)；金属离子通过结合底物为反应定向、
调节氧化还原反应、静电稳定或屏蔽负电荷等主要
途径参加催化过程。可能茶氨酸合成酶是一类金属
激活酶(metal—activated enzyme)，K 和 Mg 等金
属离子通过形成 Mg++一ATP复合物产生静电屏蔽
效应促进反应，或通过水的离子化作用促进亲核催
化等机制而对茶氨酸合成酶催化活性产生促进作
用，使茶氨酸合成速率得到提高。
由于本文是在无反馈条件下观察，结果可能没
有精确反映培养基中乙胺浓度对茶氨酸积累茶氨酸
积累的影响，最佳的乙胺流加量和维持量有待于进
一 步研究。此外，本文研究中蔗糖和水解酪蛋白为
一 次性添加，进行大规模培养时以流加方式补充有
机氮源、碳源对细胞增长量和茶氨酸积累的影响也
有待于深人考察 。
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