全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(1)：63— 68 2006年 1月
DNA分子标记在雌雄异株植物
性别鉴定中的应用
董莉娜，苏 雪，孙 坤 ，张建清，张 辉，陈 纹
(西北师范大学 植物研究所 ，甘肃 兰州 730070)
摘 要：雌雄异株植物中不同性别 的植株所产生的经济效应和生态效应存在一定 的差异，在生产实践中，选
取适宜性别的植株进行栽培有助于提高效率，避免不必要 的浪费。然而 ，性别鉴定 的常用方法大多是根据表
型、代谢产物含量及活性等方面的差异，在成株阶段进行的，鉴定结果的可靠性和准确性都有一定的局限。近
几年，DNA分子标记技术应用于雌雄异株植物的性别鉴定研究中，获得了快速准确的鉴定结果 。在 比较常用
性别鉴定方法的基础上，主要就常用 DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中的研究进展做一概述并对该
领域的研究提出展望。
关键词 ：DNA分子标记 ；雌雄异株；性别鉴定
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)0卜0063—06
Applications 0f DNA molecular markers 0n
一 ●1 ⋯ ‘ 一 一一 一 SeX ldentitication of dioecious plants
DONG Li—na，SU Xue，SUN Kun ，ZHANG Jian—qing．
ZHANG Hui，CHEN W en
(Institute of Botany，NorthTx·P“Normal University，I．anzhou 730070．China)
Abstract：There are many differences of the economic yield and ecological efficiencY between different sexua1
individuals of dioecious plants
． In practice，the unnecessary cuhivation of unwanted ma1es or fema1es leads to
wastage of resource，which can be avoided if the sex of the plant is determined at juvenile stage． The morpho—
logical and cytological studies conducted SO far have failed to differentiate accurately between the various sex
forms．Recently，the methods of seedling sex identification in dioecious plants have been improved by applying
DNA molecular markers．Based on comparing the traditional methods with DNA molecu1ar markers
，the aDDli—
cation of DNA molecular markers in sex identification of dioecious plants are summarized
． The DrosDect and
some problems in the field are also briefly presented
．
Key words：DNA molecular markers；dioecious plants；sex identification
整个显花植 物中雌雄异株植物约 占 5 (Lion—
akis，1985)。被子植物中有 959个属存在雌雄异株
现象，雌雄异株植物约 14 620种 ，分布于 143个科
(张大勇，2004)。显花植物中常见雌雄异株的科有 ：
银杏科(Ginkgoaceae)、大麻科 (Cannabaceae)、猕猴
桃科 (Aclinidiaceae)、杨柳科 (Salicaceae)、冬 青科
收稿日期：2004—12—13 修回 日期：2005—06—16
基金项 目：国家自然科学基金(30270091，30570110)；西北师范大学知识与科技创新工程(O2)资助项 目[supported by the Nationa1
Natu ral Science Foundation of China(30270091，30570110)；Knowledge and Science Innovation Project of Northwest Norma1 Uni—
versity(No．02)]
作者简介：董莉娜(1979一)，女，陕西宝鸡人 ，硕士研究生 ，主要从事植物系统与进化研究 。
通讯作者(Author for correspondcnce)，E—mail：．
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(Aquifoliaceae)、葡萄科 (Vitaceae)、柿树科 (Eben—
aCeae)、薯蓣科(Dioscoreaceae)等。在经济植物中，
雌雄异株现象也十分普遍。不同性别的植株往往具
有不同的经济价值(陈中海等，2000)，如银杏等可作
为行道树种 ，因其雄株长势旺盛 ，在栽培中应多以雄
株为主；而猕猴桃等以产果实为主的植物，雌株经济
价值显然要高于雄 株。所以 ，在雌雄异株植物的栽
培过程中，合理选择雌雄个体对提高效益、减少浪费
都十分重要。然而 ，雌雄异株植物早期性别鉴定存
在一定的困难 ，制 约了不 同性 别植株的栽培育种 。
因此，植物早期性别鉴定的研究在理论与实践中都
有重要的意义(邵宏波等 ，I994)。
植物的性别决定机制复杂，不同植物其决定机
制也不相同。总体来说有以下 3种：(I)性染色体决
定；(2)性染色体与常染色体的比率决定；(3)激素调
控(Irish等 ，1989)。其中只有很少一部分雌雄异株
植物具有完整的性染色体(Shibata等 ，1999)。尽管
雌雄异株植物的性别决定机制各不相 同，但雌雄个
体总会在形态 、生理生化、细胞 、核酸等方面体现出
不同程度的差异。目前，植物性别鉴定的方法大多
也是以雌雄株外部形态 、生理代谢产物、所含化学物
质、同工酶、特异蛋 白质 、氨基酸含量及核苷酸的差
异为依据 ，这些方法在植物的性别鉴定研究 中发挥
了一定的作用(尹立辉，2003)。但上述方法大都是
对已成熟的个体进行性别差异研究，在植物性别的
早期鉴定方面所做的工作还不够 ；另外 ，由于植株个
体的性别分化受多种因素的影响，采用形态 、生理代
谢产物、所含化学物质、同工酶等方法进行植物早期
性别鉴定的准确性不够。DNA分子标记因其不受
发育阶段、外界环境及组织特异性的影响，能够提供
准确可靠 的性别鉴定信息 ，近年来被广泛应用于雌
雄异株植物的早期性别鉴定中。本文在比较常用鉴
定方法的基础上，主要就 DNA 分子标记 在植物性
别鉴定中的应用做一概述。
1 植物性别鉴定方法的比较
1．1以外部形态差异为依据
外部形态的差异是基因与环境共同作用的结
果，在一定程度上能够反映基因水平的差异。因此 ，
可以为植物 的性别 鉴定 提供依 据。例 如 ，龚文楼
(1995)对毛白杨苗木幼树和成熟期雌雄株夏态和冬
态的叶型、冠形、树皮及皮孔进行了比较 ，提 出了毛
白杨雌雄株鉴别的形态学依据。廉永善等(2000)通
过对中国沙棘雌雄株叶片的长、宽及长宽比的测量，
发现在大多数情况下 ，雌株的叶片较狭窄，雄株的叶
片相对较宽 ；雌株叶片的长宽比值均大于雄株 ，据此
可以进行沙棘雌雄性别鉴定 。
根据外部形态进行雌雄异株植物的性别鉴定具
有简便、易行、可操作性强等优点。然而，大多数雌
雄异株植物在性器官分化和发育成熟之前，雌雄株
的形态差异并不明显 ，而且植物 的外部形态易受环
境以及发育阶段的影响，鉴定结果 的准确性也不高。
1．2以生理生化差异为依据
雌雄株间生理生化 的差异指植株在生理指标 、
新陈代谢、生化特性、同工酶、特异蛋白质以及氨基
酸含量等方面所体现出的差异。以此为依据的鉴定
方法大多是对雌雄株个体问生理生化指标和活性进
行 比较 ，得 到雌雄株的鉴别信息。例如 ，卢崇恩等
(1995)通过对中国沙棘雌雄株叶片的持水力和叶绿
素含量的测定 ，发现雄株不仅持水力强 ，而且叶绿素
含量、光合速率 和呼吸速率均 比雌株高。廉永善等
(2000)比较了不同产区的中国沙棘雌雄株叶片的氨
基酸含量，发现雄性 叶片 中氨基酸含 量(除天冬氨
酸)都高于雌性叶片，特别是精氨酸、亮氨酸和谷氨
酸的含量更为明显 。
其中，由于同工酶是分子水平的指标，是基因差
异在表达水平的体现，在一定程度上可以反映出雌
雄株问的本质差异，是植物性别鉴定 的有效途径之
一
。 例如，袁仕禄等(I999)通过对华中五味子雌雄
株的休眠芽、萌动芽、功能叶和茎的韧皮部的过氧化
物酶同工酶电泳分析 ，发现尽管不同器官、不同时期
的过氧化物同工酶具有时问特异性 ，但是不同时期
的功能叶的过氧化物同工酶谱却趋于稳定，且雌株
功能叶与雄株功能叶之间存在明显的差异。艾辛等
(2000)对黄瓜雌性系和雌雄株系子叶和真叶进行了
过氧化物酶同工酶 、多酚氧化酶同工酶 、超氧化物歧
化酶同工酶分析 ，结果表 明雌性植株有较强的酶活
性和较多数 目的同工酶 ，而且真叶中酶谱的稳定性
较子叶的好。
与 以外部形态 的差异进行性 别鉴定的方法相
比，生理生化水平的差异，尤其是同工酶水平的差异
在其鉴定结果的准确性上有明显提高。但这些方法
的应用大多集中在雌雄株成熟个体的 比较 ，缺乏纵
向的比较和分析，而且生理生化的差异受发育 阶段
和植株所处环境的影响，对于不 同发育阶段以及不
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l期 董莉娜等 ：DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定中的应用 65
同生境中植株间差异的研究也有不足 。因此 ，生理
生化水平的差异虽然可以为雌雄异株植物的性别鉴
定提供一定的依据 ，但其鉴定结 果的可靠性 尚需进
一 步的分析。
1．3以细胞水平的差异为依据
雌雄植株在细胞水平上的差异主要反应在染色
体组型上 。根据染色体组型来进行植物性别鉴定的
方法只适用于由性染色体决定的雌雄异株植物，如
银杏、女娄菜 、罗汉松等。与前两种鉴定方法相 比，
应用染色体组型分析进行植物的性别鉴定受多种因
素的限制，如有些染色体 太小 ，不便于观察与测量 ；
有些植物的性别决定机制不清楚 ；只能用于鉴定 由
性染色体决定性别的植物等。
1．4以核酸差异为依据
应用核酸差异进行性 别鉴定主要有两个方面 ：
(1)根据核酸含量 的差异进行鉴别 ；(2)应用 DNA
分子标记的方法进行鉴别。
由性染色体决定的雌雄异株植物在理论上存在
核酸含量的差异。但是核酸含量的测定在实际操作
过程中受多种 因素制约，如提取核酸 的技术水平 的
限制、对鉴定结果的分析处理等。此外 ，应用核酸含
量进行的性别鉴定仍然是以雌雄株个体间量上的差
异为依据，并不能反映雌雄株间的本质差异，而且操
作繁琐，鉴定结果不稳定。因此，对雌雄异株植物性
别鉴定 的准确性并不高 ，以此作为性别鉴定的依 据
在实际应用中并不多。
近年来 ，DNA分子标记技术被应用于植物的性
别鉴定中，提高了植物性别鉴定的准确性。与前几
种常用方法相 比，DNA分子标记 的方法有如下优
点：(1)不受组织特异性及环境的影响 ；(2)对采样的
要求不高；(3)在理论上 ，适用于各种性 别决定机制
形成的雌雄异株植物；(4)可以从海量信息中筛选所
需信息，而不是只根据几个信息位点进行判断；(5)
测定结果容易标准化 ；(6)鉴定结果准确性高。鉴于
此，DNA分子标记被广泛应用于植物早期性别鉴定
的研究中，为雌雄异株植物 的栽培育种提供 了可靠
的性别鉴定信息。
2 DNA分子标记在植物早期性别
鉴定中的应用
由于 DNA分子标记具有上述优点，因而开始
在雌雄异株植物 ，如银杏(王晓梅等，2001a，2002；姜
凌等，2003)、大麻(Mandolino等，1999；陈其军等，
2001)、猕猴桃(Harvey等，l997；Gil等，l998)、番
木瓜 (Urasaki等 ，2002；Deputy等，2002；Parasnis
等 ，l999)等经济植物 的性别鉴定 中得到了应用 ，为
雌雄异株植物的早期性别鉴定提供了新的途径。目
前 ，常用于植物性别鉴定研究 的 DNA分子标记有
RAPD、SCAR、AFLP以及基于 SSLP的方法 ，这些
方法大多是在 PCR的基础上，结合混合分组分析方
法(bulk segregant analysis，BSA)，对雌雄异株植物
进行快速 、可靠 、准确的早期性别鉴定。
2．1 RAPD标记
随机 扩 增 的 多 态性 DNA(random amplified
polymorphic DNA，RAPD)是 以一个 l0碱 基的任
意序列的寡核苷酸片段为引物在未知序列的基因组
DNA上进行随机的 PCR扩增，扩增产物通过凝胶
电泳分离，溴化乙锭染色，显示扩增产物 DNA的多
态性。
RAPD标记可以为雌雄株间差异序列的分析提
供丰富的多态位点，具有易操作、费用较低等优点而
被广泛应用于雌雄异株植物 的性 别鉴定 中。Har—
vey等(1997)在形态学及生理生化水平的差异对猕
猴桃性别鉴定不理想 的情况下，对人工育种的猕猴
桃杂交后代应用 RAPD标记的方法进行性别标记
物的筛选。结合 BSA的方法，Harvey等(1997)从
500个随机引物中筛选 出 2个 特异性标记物 ：雄性
特有的 800bp和雌 性 特有 的 850bp的扩增条 带。
张立平等(1998)应用 RAPD标记技术从 l0个引物
中筛选出了四个引物(P601、P6i0、P681、P688)，这
四个引物的 PCR扩增产物在刺葡萄、桑叶葡萄、复
叶葡萄雌雄株间存在多态性，尽管雌雄株间相同带
数明显多于相异带数，但仍能看到雌雄间的差异。
王晓梅等(200lb)应用 150个 随机单引物和 110对
随机双引物组合对银杏进行 RAPD分析，共得到了
1800个标记物，其 中仅有一个单引物 (TGATC—
CCTGG)可以在雄性池和雄性个体间产生一条 1kb
左右的雄性特 异标记 物。姜凌等 (2003)结合 BSA
法从 1200个引物 中得 到了 8372个 RAPD扩增条
带 ，从中筛 选 出了 与银 杏雄 株相关 的 引物 $1478—
682和与雌性相关的引物 OPC4，通过对北京和沈阳
两地银杏雌雄株个体的 RAPD扩增发现引物 S1478
鉴定结果的稳定性较 高，可以应用于银 杏的早期性
别鉴定。蔡亮等(2002)在筛选了 340种随机引物，
发现其中有 23种引物的 PCR扩增产物具有良好的
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多态性 ，最终筛选得到了引物 P20，该 引物可以在罗
汉松雌株上产生特有的长约 75Obp的扩增条带 ，可
用于罗汉松的早期性别鉴定。
大多数雌雄异株植物虽然性器官及生理行为等
方面存在差异 ，但遗传信息的绝大部分是一致的(王
晓梅等 ，200lb)。因此 ，应用 RAPD标记 的方 法进
行植物性别早期鉴定时不可避免的要经历繁琐的引
物筛选过程。此外 ，RAPD标记对实验条件较敏感，
试验结果的重复性低等标记本身的不足影响了鉴定
结果的准确性 。尽管如此 ，RAPD分子标记技术仍
不失为快速进行植物性别早期鉴定的好方法，尤其
适用于对未知基因序列的雌雄异株植物进行性别鉴
定的初步研究 。
2．2 SCAR标记
特征序列扩增区域(sequence characterized am—
plified regions，SCAR)，是从 RAPD技术衍生而来
的，通过对感兴趣的 RAPD片段 的克 隆与测序 ，进
行序列分析后设计 出一对互补 到原来 RAPD两端
的 24碱基的引物，用这对引物与原来的模板 DNA
进行 PCR扩增 时，特征序列扩增 区域被特异 性扩
增 。由于 SCARs标记对反应条件不敏感 ，重复性
好，可以提供较 RAPDs更多的信息位点。因此，将
RAPDs转化成 SCARs标记进行植物早期的性别鉴
定可以获得更加稳定可靠 的鉴定结果。
Gil等(1998)在 Harvey等(1997)研究的基础
上 ，将两个 RAPD标记物 ：雄性特有带 (SmY)和雌
性特有带(SmX)克隆到载体 pGEM—T上进行序列
分析，随后在形成 RAPD标记物的引物后添加 l2～
13个寡核苷酸，合成了 SCARs引物：SmXf，SmXr，
SmYf，SmYr，其中 SmY可用于猕猴桃个体的早期
性别鉴定。Mandolino等(1 999)应 用引物 oPA进
行 PCR扩增 ，在大麻雄株上形成长约 4OObp的特异
带 (OPAs。)，对 OPA 。进 行序 列分 析后 ，在 引物
OPA后添加了 9～10个寡核苷酸 ，对这两个引物进
行 PCR 扩 增 ，得 到 雄 性 特 有 的 390 bp左 右 的
SCAR标 记，该 SCAR标记可用于精确、早期、快速
地鉴别大麻雄性植株。陈其军等(2001)应用 RAPD
技术筛选了30个随机引物，其中引物 $40l(5-GT—
TGGTGGCT一3 )扩增得到了约 2．5 kb的一条雄性
特异带 ，通过对该 RAPD标记物进行克隆与序列分
析，在引物 $40l的基础上合成了 20和 22个碱基的
SCAR引物，对这两个引物进行 PCR扩增 ，发现雄
性大麻能够扩增 出一条与 RAPD标记相应 的特异
条带 ，应 用 于大 麻 的早 期 性 别 鉴 定。Urasaki等
(2002)应 用引物 IBRC—RP07进行 PCR扩增后，在
番木瓜雄性和两性植株 中得到约 450 bp的扩增条
带 PSDM (Papaya Sex Determination Marker)，经
克隆测序后合成 ScAR引物 SDP—l和 SDP一2，PCR
扩增 可 以 在 雄 性 及 两 性 植 株 上 形 成 225bp的
SCARs标记物 ，可用于精确快速的番木瓜的早期性
别鉴定 中。Deputy等(2002)依据番木瓜中性别决
定基因 sex1所提供的信息 ，将 3个 RAPD标记物
克隆 、部分 测序后 ，合成 了 3个 SCAR引物：wll、
T12和 F1；其中，SCAR W11和 SCAR T12可以在
两性及雄性植株中产生特异带 ，SCAR Tl在被测植
株中则形成相似 的条带 ，因此 ，应用 SCAR T12和
SCAR T1的扩增条带作阳性对照，从番木瓜的幼苗
中鉴别 出两性番木瓜植株的成功率可达 99．2 。
与 RAPD标记相 比，SCAR标记鉴定结果的稳
定性得到了显著提高。但要成功得到 SCAR标记 ，
需对 RAPD标 记 进 行 克 隆、测 序等 过 程，固而较
RAPD标记操作繁琐、花费高。此外，SCAR标记同
样存在对 PCR反应条件较为敏感等不足之处。然
而，鉴于 SCAR标记可以提供准确可靠的鉴定结果，
目前还是广泛应用于植物性别早期鉴定的研究中。
2．3 AFLP标记
扩增 片 断 长 度 多 态 性 (amplified fragment
length polymorphism，AFLP)是将基因组 DNA经
限制性 内切酶完全消化后 ，在限制性片断两端连接
上人工接头作为扩增的模板 ，扩增后检测其多态性
的一种 DNA分子标记。由于 AFLP引物设计的巧
妙与搭配的灵活使其成为当今获得多态性效率最高
的分子标记 。
Spada等 (1 998)应用 两 个酶组 合 ：EcoR I和
Mse I，Pst I和 Mse I，对石 刁柏基 因组进行 完全
酶切 ，用 46个引物(35个 EcoR T+3和 Mes I，l1
个 Pst I+2和 Mes I+3)组合进行 PCR扩增 ，得
到一条雄性特异标记物 SV，可以更有效 的应用 于
石刁柏的性别鉴定。王晓梅等(2001a)利用 48个引
物组合对雌雄银杏两个 DNA池进行 AFLP分析，
共得到 l 896条扩增带 ，其 中有 3个 引物组合(E。／
Ms，E． ／M ，Es／M )的 3个标记只存在于雌性基因
池中，将雌性特有 的这三个 AFLP片段 回收，再扩
增并克隆后 ，制备成探针 ，分 别与雌雄银 杏基因组
DNA进行 Southern点杂交 ，其中以 E ／M 引物组
合得到的 AFLP片段为探针进行 Southern点杂交
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1期 董莉娜等 ：DNA分子标记在雌雄异株植物性别鉴定 中的应用 67
在雌雄银杏基 因组 DNA 中均 出现杂交 信号，Ez／
M。和 E。／M。只在雌性植 株中产生杂交信号 ，初步
证明这两个差异片段为雌性基因所特有 。
应用 AFLP技术进行性别鉴定研究 ，可 以得 到
与 SCAR标记相当的准确性 ，但 AFLP分析存在试
验步骤多，流程长 的问题 ，包括模板 DNA 的纯化 、
内切酶的选择与完全消化 、接头的连接效率 、预扩增
的条件与产物的稀释、选择性扩增时引物组合的筛
选 、引物对浓度 的比例 以及在现实可能的条件下检
测手段的确定 等一 系列过程都需 要反复摸索 。所
以，应用 AFLP标记进行植物 的性 别鉴定研究 ，对
实验室和操作人员的要求较高。
2．4基于 SSLP的方法
SSLP(simple sequence length polymorphism)
是一系列不同长度的重复序列 ，不 同的等位基 因含
有不同数 目的重复单位 。SSLP主要 有两种类 型：
(1)小卫星(minisatellite)通常为 lO～60bp，重复程
度较低；(2)微卫星 (microsatelite)通常为二、三或
四核苷酸单位的重复。其中微卫星较小卫星更常用
作 DNA标记，主要因为：第一，小卫星常分布于染
色体的末端，相比之下，微卫星在基因组中的分布更
便于用来基因定位。第二，微卫星重复单位短，更适
用于应用 PCR进行快速分型分析。
Siljak—Yakovlev等(1996)应用色霉素 A3对枣
树根尖染色体进行染色，发现在雌株上有一对 GC
含量丰富的同型染色体，并应用于枣树的性别鉴定。
Siljak—Yakovlev等的实验表明，雌雄株在重复序列
上存在明显的差异 ，这 为应用 SSLP进行植物性别
鉴定的研究提供 了实践依据。Parasnis等(1999)提
取已知性别的番木瓜个体幼嫩叶片中的 DNA，应用
限制性内切酶 Alu I，HaeI11，Hinf I，Taq T，EcoR
I，EcoRV，Msp I，Mbo I，Sau3A丁和 Dra I对所
提 DNA进行充分的消化后 ，与微卫星探针 (TG) 。，
(CAC)5，(GAA) ，(GGAT ) ，(GATA ) ，(GA—
CA) 和小卫星探针 pV47和 M13进行 Southern杂
交，发现探针(GATA) 与 Hinf I消化产物杂交可
以检测到雄性个体所特有的 5kb的条 带，其鉴定结
果稳定可靠 。为了进一步检测在番木瓜幼苗中的鉴
定效果，Parasnis等对生长两个月左右的幼苗叶片
进行 DNA的提取 ，对鉴定结果做-ig录，并与开花
后个体的性别与实验所得鉴定结果进行比较，发现
应用微卫星标记进行早期性别鉴定的准确性可以达
到 100 。
基于 SSLP的方法在性别鉴定中操作较其他分
子标记的方法更为繁琐，对实验条件要求较高等不
足 ，目前应用微卫星进行性别鉴定的报道并不多。但
其性别早期鉴定结果的稳定性和可靠性却是不容忽
视的，这一方法可以应用于雌雄异株植物的早期性别
鉴定尤其适用于多年生经济物种的早期性别鉴定 。
3 结束语
DNA分子标记技术应用于雌雄异株植物的性
别鉴定，提高了鉴定结果的准确性和可靠性。尤其
是 DNA分子标记的方法不受发育时间及组织特异
性的影响 ，用于雌雄异株植物的早期性别鉴定可 以
得到常用方法无 法获得 的可靠 的鉴定信息。尽管
DNA分子标记方法在植物性别鉴定 的研究中仍存
在操作繁琐 、雌雄株间特异性条带筛选困难、费用高
等技术上的不足以及不便于在生产实践中推广等问
题 ，但是 ，近年来随着 DNA 分子标记和基因芯片等
分子技术的不断发展 ，这些 问题将会得 到解决 。如
今后 可以应用基因芯片技术对雌雄株间的差异序列
进行快速的筛选与分离，用以实现性别鉴定操作的
自动化，同时将筛选到的特异性引物制备成探针，对
雌雄异株植物 的性 别进行快速 、高通量 、准确 的鉴
定，将可以满足生产实践的需求 。另外，应用重组基
因原理寻找或构建与植物性 别相关的表型基因，以
便于从稳定的表型差异上直接对雌雄异株植物进行
快速准确的性别鉴别，将降低性别鉴定的成本，简化
操作过程。相信随着雌雄异株植物性别决定机制的
深入研究和分子生物学 的飞速 发展，应用 DNA 分
子标记进行雌雄异株植物 的早期性别鉴定具有广阔
的应用前景。
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