全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(5)：472— 476 2005年 9月
大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究
Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性
董登峰，杨 杰，江立庚，陈念平
(广西大学农学院，广西南宁 530005)
摘 要：从大豆叶片中分离能水解磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酸性磷酸酯酶，通过硫酸胺分部 (2O ～50 饱
和度)沉淀、DEAE一纤维素层析 、刀豆球蛋白琼脂糖凝胶亲和层析将酶纯化了 422．47倍 ，活性达 78．16 U／mg
蛋白。该酶对 PEP专一性不强，Km为 1．09 mmol／L(PEP)，最适 pH5．8，在 PH4．8～7．0范围内及 60℃以下
较稳定，水解 PEP的活性被 Mg2+、Mn2+激活，F一、CuZ+、ZnZ+、PO4 3一、Mo04 2一及 3一磷酸甘油酸(3-PGA)、三
磷酸腺苷 ATP等代谢物抑制，受异柠檬酸等有机酸影响较小。
关键词：大豆；非专一性酸性磷酸酯酶；纯化；特性
中图分类号 ：Q556．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2005)05—0472—05
Study on soybean ph0sph0en0lpyruVate phospha—
tase(PEPP)Ⅲ．Purification and characteri-
J ● n ● ^ ● ● 1 ■ ■ J
Zatl0n OI nonsoeci[1C aCid Dn0SDnataSe
DONG Deng—feng，YANG Jie，JIANG Li—geng，CHEN Nian—ping
(Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：An acid phosphatase hydrolyzing phosphoenolpyruvate(PEP)has been isolated from soybean leaves
and purified 422．47一fold，tO a final specific activity of 78．1 6 U／mg proteins，through Ammonium sulfate frac—
tion precipitation(20 ～50 saturation)，DEAE-cellulose chromatography and Concanavalin A sepharose af—
finity chromatography．This enzyme shows low specificity for phosphoenolpyruvate(PEP)；its Km is 1．09
mmol／L and optimum pH1 5．8．It is relatively stable at the pH ranging from 4．8 tO 7．0 and at temperature be—
low 60 ℃ ．The enzyme activity is activated by M g2+，MnZ+ and inhibited by F ，CuZ+，ZnZ+ ，P04 3一，MoO4 2一
and some metabolites such as 3-PGA ，other than organic acids such as isocitrate．
Key words：soybean；nonspecific acid phosphatase；purification；characterization
植物中广泛存在磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶
(PEPP)，其作用被认为是将 PEP直接水解成丙酮
酸释放 Pi，提供了一条支路绕过消耗 Pi的丙酮酸激
酶(PK)途径，维持植物缺磷条件下的EMP—TCA这
一 基本代谢的运转(Duff等，1994)。不同来源的
PEPP性质相差较大，Duf等(1989；1991)先后从黑
收稿 日期
基金项 目
作者简介
芥悬浮细胞中纯化了两种能水解 PEP的酸性磷酸
酯酶，其最适 pH都是 5．6，但其温度稳定性、亚基
结构、底物专一性等相差很大，亚细胞定位也不同，
因而推测其功能也不一样，Malhotra等(1990)从萌
发的绿豆 中纯化 PEPP，最适 pH 为 8．5，郭振飞
(1994a，b)从水稻叶片中纯化两种水解 PEP的磷酸
2004—09—06 修订 日期 ：2005—02—24
国家自然科学基金(30070453)；广西大学博士启动基金(DD160008)(Supported by the National Natural Science
Foundation of China，Grant No．30070453；Initial Foundation to Ph．D of Guangxi University No
． DD160008)。
董登峰(1971一)，男．湖北京山人，博士，副教授，从事植物逆境生理和酶工程研究。
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5期 董登峰等：大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性 473
酯酶，一种最适 pH为 5．3，专一性差，另一种最适
pH8．7，专一性较强。我们以大豆叶片为材料纯化
PEPP，过 DEAE一纤维素柱时得到两个活性峰，随后
研究证实一个是非专一性的酸性磷酸酯酶(AP)，一
个是专一性较强的 PEPP。本 文报道非专一性的酸
性磷酸酯酶的部分特性。
1 材料与方法
1．1材料种植
以大豆品种 BXIO为材 料，严格挑选 大小一致
的饱满种子，用 30 的 H O 表面消毒 5 rain，先后
用 自来水与蒸馏水冲洗干净 ，再用饱 和硫酸钙溶液
浸泡 30 rain，播种于干净湿润的细河沙中催芽，待
两片子叶展 出后移栽到 3 L的塑料 盆中。每盆 20
株 ，置于 网室用 1／5强 度 Hoagland营 养液 (含 1
mmol／L KN0 ；1 mmol／L Ca(N0 )2；0．4 mmol／L
MgSO4；0．2 mmol／I KH2P04；2O t~mol／L ED—
TAFe(Ⅲ )Na；46 t~mol／L H B03；9 t~mol／L
MnC12；0．3 t~mol／L CuSO4；0．3 t~mol／L ZnSO4；
0．072 8 t~rnol／L(NH )6Mo 02 )自然培养至第三
复叶，整个材料培养过程中每 2 d换一次营养液，每
天 7：30及 19：O0各调一次 pH使之保持在 6．0±
0．5，用气泵间歇供气，调节断电控制器使每小时打
气 20 rain，调节通气筏使每钵气流大小一致。
1．2 PEPP酶活性的测定
(1)以 PEP为底物的活性按 Plaxton等(1990)
方法略作修改：1 mL反应体系中含有 50 mmol／L
MES—KOH缓冲液(pH6．5)，2 mmol／L磷酸烯醇
式丙酮酸环己亚胺盐，50 mmol／L KC1，10 rnmol／L
MgC12，0．2 mmol／L NADH，1 mmol／L DTT，0．2
mg／mL BSA，2IU兔肌乳 酸脱 氢酶及适量酶液 ，反
应温度 30℃，由酶液启动反应 。仪器 自动记录 340
nm 波长处吸光值的变化并计算斜率，扣除 NADH
氧化酶活性(即上述体系中不含磷酸烯醇式丙酮酸
环己亚胺盐时的测定值 )，1U定 义为每分钟消耗 1
／~mol的 NADH。测定酶的性 质时根据具体研究 目
标做相应的改变。
(2)非 PEP为底物 的活性 (仅用于研究酶的底
物专一性)：按 Duf等(1991)方法，反应缓冲体系改
为 MES—K0H(pH5．8，为本 酶最适 pH)，1U定义
为每分钟释放 1 mo1的 Pi。
(3)蛋白质含量按 Bradford(1976)的方法测定，
以牛血清蛋白作标准。
1．3 PEPP的提取和部分纯化
1．3．1酶的提取 称取大豆叶片 100 g，洗净、沥干，
加入 16O mL预冷 的提 取 液 即 25 mmol／L MEs_
KOH 缓 冲 液 (pH6．5，含 2 mmol／L EDTA，4
mmol／L MgC12，14 mmol／L巯基乙醇)，迅速匀浆，
尼龙布过滤 ，滤液离心(10 000 g，10 rain，4℃)，上
清液即为酶粗提液 。
1．3．2 硫 酸 铵 分 部 上 清 液 缓 慢 加 入 固 体
(NH )2SO 至 20 饱 和 度 ，离 心 (10 000 g，10
rain，4℃)，弃沉 淀，上 清 液 再 缓慢 加 入 固体
(NH )2SO 至 50 饱 和 度 ，离 心 (10 000 g，10
rain，4℃)，弃上清液，沉 淀用 25 mmol／L MES—
KOH 缓冲液 (pH6．5，含 2 mmol／L MgC1 )悬浮 ，
装入透析袋中对相同的缓 冲液透析至 Nessler’S试
剂检测不到 NH 为止 ，离 心(10 000 g，10 rain，4
℃)弃沉淀。
1．3．3 DEAE一纤维素柱层析 上清液过 DEAE一纤
维素柱 (1．5 cm×15 cm)(经用 25 mmol／L MES—
KOH 缓冲液(pH6．5，含 2 mmol／L MgC1 )预处理
的)，先用含0、0．1 mol／L KC1的上述缓冲液洗涤至
流出液 A28。<0．05，然后用 400 mL含 0．1～0．5
mol／L KC1的上述 缓 冲液 线性 梯度 洗脱，流速 为
0．75 mL／min，每管收集 5 mL，检测各管蛋 白含量
和酶活性，得到两个酶活性峰。
1．3．4刀豆球蛋白琼脂糖亲和柱层析 合并第 15～
23管(即第 1个峰)，上 ConA—Sepharose亲和柱
(0．5 cm×5 cm)(经过 5 mmol／L的 PBS(pH6．5，
含 1 mmol／L KC1、1 mmol／L EDTA、1 mmol／L
CaC1z、1 mmol／L MnC1 )平衡过的)，先用平衡缓冲
液洗涤至流出液 A 。<0．05后 ，再用 30 mL含 50
～ 5OO mmol／L甘露糖的平衡缓冲液梯度洗脱，每
管收集 1 mL，检测各管蛋 白含量和酶活性 ，合并活
性部分 。
2 结果与分析
2．1酶的纯化
经过粗提、硫酸铵沉 淀、过 DEAE-纤维素柱层
析柱时得到两个蛋 白质峰和两个 PEPP活性峰，第
一 个活性峰略提前于第一个蛋白峰，第二个活性峰
为专一性磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶(另文待发)，
活性峰尖与第二个蛋白峰尖基本重叠(图 1)。
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474 广 西 植 物 25卷
合并第一个活性峰(第 15～23号管)进行刀豆
球蛋白琼脂糖亲和柱层析 ，酶被纯化 了 422．47倍 ，
达 78．16 U／mg protein(表 1)。该酶能被 ConA 亲
和吸附，表明该酶为糖蛋白。PEPP和 PK不易分离，
Podesta等 (1991)证 实 Malhotra和 Kayastha
从绿豆 中纯化的 PEPP和 PK是 同一蛋 白质 ，我们
在反应体系(pH7．2)中加入 2 mmol／L ADP，没有
检测出 PK活性 ，证明所纯化的酶不是 PK。对该酶
进行 4O0～600 nm波长的扫描，该酶在 550 nm附
近没有吸收峰，表明该酶也不是紫色酸性磷酸酯酶
(LeBansky等，l992)。
2．50
2．00
赛 1．50
《 1
．03
0．50
0．∞
2．2酶的生化特性
2．2．1最适 pH 及 pH稳 定性 在不 同 pH 的缓冲
液(pH4～5．4用 HAc—NaAc缓冲系，pH5．5～6．7
用 MES缓冲系，pH6．8～8．2用 HEPES缓冲系)中
测定酶的活性，结果表明该酶 pH活性宽，最适 pH
为5．8。将酶置于不同 pH缓冲液中 5 h(4℃)后，
在最适 pH5．8的缓 冲液 中测定酶活性 ，与放置前 的
活性比较，结果表明该酶在 pH6．0～7．4范围内较
稳定(图 2)。
2．2．2热稳定性 将酶置于 0．5 mL离心管不同温
度干浴 10 min后，迅速插人冰中冷却，测定酶活性 ，
l 6 ll l6 21 26 31 36 41 46 51 56 61 66 71 76 81
收集管号 Fraction／lumber
20
l5
l0
5
0
图 1 大豆叶片非专一性酸性磷酸酯酶过 DEAE一纤维素柱层析洗脱
Fig．1 Elution profile of soybean leaves nonspecific AP on DEAE—cellulose chromatography
表 1 大豆叶片非专一性酸性磷酸酯酶的纯化
Table 1 Purification of nonspecific acid phosphatase from soybean leaves
纯化步骤
Steps
总蛋白质 总活性 比活性 纯化倍数 回收率
Total protein Total activity Specific activity Pu rification Yield
(mg) (Units) (U／rag) (fold) ( )
粗提液 Crude extract
硫酸铵分部(2O ～5O 饱和度)
Ammonium sulfate fraction(2O ～ 5O satu ration)
DEAE-纤维素柱层析 DEAE—cellulose chromatography
刀豆球蛋白琼脂糖凝胶柱层析
ConA sepharose chromatography
430．95
29O．12
47．74
9．31
O．18
O．52
3．52
78．16
1．OO 1OO．00
2．83 67．32
19．O3 11．08
422．47 2．16
结果表明该酶较耐热 ，在 60℃以下温度较稳定 ，至
60℃仍保持有 76 的活性 (图 3)。
2．2．3米氏常数(Km)及最大反应速度(Vmax) 测
定 0．05～2 mmol／L浓度梯度的 PEP底物反应速
度，以浓度的倒数对速度的倒数作图 ，该酶的 Km为
1．09 mmol／L，Vmax为 188．68 U／mg protein，专
一 性常数为 173．1(图 4)。
2．2．4酶的底物专一性 以含有磷酸酯键不同的底
物(O．05～2 mmol／L)代替 PEP反应 ，测定 Pi的释
放作为酶的活性，以浓度的倒数对速度的倒数作图，
计算该酶的对不同底物的Km和 Vmax。该酶合成
底物 pNPP催化活性最高 ，对 ATP亲和力最强，对
PEP专一性不及 pNPP和 3-PGA强(表 2)。
2．2．5 离子及 代谢 物 对 酶 活性 的 影 响 在 含 l
mmol／L PEP(Km浓度底物)的HEPES—K0H缓冲
液(pH5．8)中分别加入不同的离子，测定纯化酶的
活性，结果表明 Mg抖、Mn。 激活 AP活性，Fe抖、
F、Cu抖、Zn抖、PO 、MoO 。一抑制 PEPP活性，其
中MoO 。‘抑制作用最强，仅加人 0．5 mmol／L就完
全失活，而 F抑制作用弱，加人 50 mmol／L仍有
一，Ig价／s=c n】
=>一 u
，
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5期 董登峰等：大豆磷酸烯醇式丙酮酸磷酸酯酶研究Ⅲ、非专一性酸性磷酸酯酶的纯化与特性 475
5O 活性 ，可见在测定丙酮酸激酶(PK)活性时加入
MoO 一来消除 PEPP的干扰要 比 F有效(表 3)。
3．8 4．8 5．8 6．8 7．8
pH
图 2 pH对大豆叶片 AP活性及稳定性的影响
Fig．2 Effect of pH on the activity and stability
of AP from soybean l eaves
25 40 55 70
温度Temperature(。C)
图 3 温度对大豆叶片 AP稳定性的影响
Fig．3 Effect of temperature on the stability
of AP from soybean leaves
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1／【PEPP】(L／mmo1)
图 4 大豆叶片酸性磷酸酯酶的 Lineweaver-Burk图
Fig．4 Lineweaver—Burk plot for AP
purified from soybean leaves
本实验用以研究专一性的代谢物都抑制该酶对
PEPP的催化活性 ，抑制效果都在 50 9／6以上，其中 2
mmol／L的 3-PGA 完全抑制。几 种有机酸则对
PEPP抑制效果较小，这与我们前期的结果一致：缺
磷和铝毒诱导大豆大量分泌苹果酸、草酸和柠檬酸，
但体内内源有机酸含量较维持较高的稳定水平而
PEPP活性增加近 5倍(Dong等 ，2004)。
表 2 大豆叶片酸性磷酸酯酶的底物专一性
Table 2 Substrate specificity of purified acid
phosphatase from soybean leaves
表 3离子和代谢物对大豆叶片酸性磷酸酯酶活性的影响
Table 3 Efleets of ions and metabolites on the
activity of AP purified soybean leaves
离子和代谢物
Ions and
metabolitres
相对活性
Relativity
actlvlty
( )
3 讨论与小结
根据最适 pH将磷酸酯酶分为酸性磷酸酯酶和
碱性磷酸酯酶，植物碱性磷酸酯酶(如 6一磷酸蔗糖
磷酸酯酶，1，6一二磷酸果糖磷酸酯酶)常具有绝对专
一 性，而酸性磷酸酯酶专一性不强(Duf等，1994)。
从黑芥悬浮细胞中纯化得到的两种分解 PEP的磷
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476 广 西 植 物 25卷
酸酯酶，最适 pH 都为 5．6，属 于酸性磷 酸酯 酶，都
受 Pi强烈抑制 ，其中一种对 PEP的亲和系数大，有
较强的专一性，定位于液胞中，作用可能是再利用体
细胞内的磷 ，另一种对 PEP不专一，定位于细胞壁，
作用可能是分泌到胞外后分解 利用 有机磷脂(Duff
等，l989；l991)。从绿 豆 (Malhotra等，l990)和水
稻(郭振飞等，l994a)中纯化 的 PEPP性质相似，属
于碱性磷酸酯 酶，最适 pH 分别为 8．5和 8．7，不受
Pi影响，本文首次从大豆叶片分离纯化出水解 PEP
的酸性磷酸酯酶 ，其最适 PH5．8，有较宽的 pH催化
范 围 和 热 稳 定 性 ，被 Mg抖 、Mn抖 所 激 活，受
MoO 、r及较低浓度 PO 所抑制 ，以及水解对硝
基苯磷酸(pNPP)和 3一磷酸甘油酸(3-PGA)表现 出
较高的催化速度和专一性 ，能被刀豆球蛋 白亲和吸
附等，这些特性都与黑芥分泌型酸性磷酸酯酶相似，
但与之也有很大差异 ：r和 PO 也不能完全抑制大
豆 AP的活性，此外其对 PEP、pNPP、3-PGA的 Km
值都比黑芥 AP高出l5～20倍(Duff等，l989)。
大豆 AP对 PEP的亲和力低，其 Km值(1．09
mmol／L)远 大 于黑 芥 ，也 高 于 细 胞 内 PEP浓 度
(Malhmra等，l990)和 PK对 PEP的 Km值(郭振
飞等 ，l994a)，可见大豆 AP可能要分泌到细胞外起
作用，即使在细胞体内其活性也要受到细胞内PEP
浓度的调控，不能像黑芥 PEPP那样与 PK竞争
PEP而独立起作用 ，只有在 PK 主路受阻、细胞 内
PEP积累并且 Pi浓度降低到对 AP抑制作用较小
后才激发 ，与此推测 相符 的是 缺磷 培养 的长春 花
(Catharanthus roseous)悬浮细胞 内 PK的两个共底
物 ADP和磷含量分别 比对照低 8倍和 200倍 ，而此
时磷含量(0．03 mmol／I )对 AP的抑制作用也相对
较小(Ukaji等 ，l987)。
酸性磷 酸 酯酶 主要 定位 于液 胞 中(Duf等 ，
l994)，但胞质溶浆(Chen等，l988)和叶绿体(Mul—
ligan等 ，l980)等细胞器 中也存在，其最适酸性 pH
并不排斥其在非酸性 的环境 中起 作用 。由于大豆
AP专一性不强，并且对 3-PGA亲和力及专一性 常
数 比 PEPP还高 ，本实验所纯化的酶是否为 3-PGA
磷酸酯酶，抑或并非单一蛋 白?该酶的性质与 Ran—
dal等(1971)从甘蔗叶中纯化 的性质不 同，经非变
性 PAGE凝胶电泳也证实为单一的蛋白带(资料未
列出)，进一步的免疫检测以及组织分布 、亚细胞定
位 、专一性、酶蛋白的分子特性、活性 中心及精细调
控等研究在进行中。
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