全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(4)：356— 361 2005年 7月
银杏分子技术的研究进展
莫昭展，曹福亮，汪贵斌
(南京林业大学森林资源与环境学院 ，江苏南京 210037)
摘 要：综述了近些年来分子技术在银杏研究中的应用情况，对银杏的遗传多样性、进化地位、品种鉴别、遗
传连锁图谱、雌雄鉴别及其它相关研究进展进行了介绍，并对当前研究 中存在 的问题和今后的发展方向作了
进一步探讨 。
关键词：银杏 ；分子技术；研究进展
中图分类号：Q949．9 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2005)04—0356—06
Research advances in
on Ginkgo
molecular biology
biloba
M O Zhao—zhan，CAO Fu一[iang，W ANG Gui—bin
(College of Forest Resources and Environment，Nnnjing Forest University，Nanjing 210037。China)
Abstract：In this paper，the research status on Ginkgo biloba by molecular biology technology were reviewed，
including genetic diversity，phylogeny，cuhivar discrimination，genetic linkage map，gender discrimination，and
other prospects of this species．The present issue and future development were also discussed．
Key words：Gi nkgo biloba；molecular technology；research advances
银杏(Ginkgo biloba L．)是现存裸子植物中与
恐龙同时代的最古老的孑遗植物，被公认为“活化
石”，是中国特有的珍贵树种。银杏全身是宝，集食
用、药用、材用、保健 、观赏于一体，是一个重要的多
用途特种经济生态型树种(曹福亮，2002)。近些年
来，随着分子技术的进步，尤其是 DNA分子标记的
新技术不断涌现，有关银杏分子生物方面的研究报
道也日渐增多。本文综述了近些年来分子技术在银
杏研究中的应用情况，希望能为今后深入开展银杏
的分子生物学研究提供参考。
1 银杏遗传多样性的研究
我国是世界上银杏资源最为丰富、分布广泛的
国家，其它国家的银杏均引种自中国。然而，银杏的
最后避难所在哪儿?银杏的遗传基础如何?怎样更
好地保护银杏资源?多年来，人们这些问题进行过
各种深入研究，但却未得出令人信服的答案。由于
银杏极少出现形态分化，因此必须借助于分子手段。
Tsumra(1997)等用银杏大配子体组织对编码
12个酶系的同工酶进行遗传分析，用 lO个酶系的
l2个位点分析日本神庙和寺庙附近 98株古树的等
位酶变异。分析表明，日本不同区域银杏存在较大
变异，银杏是在不同时期以种子形式引入并种于庙
宇和神庙附近。
郑阿宝(2000)利用 RAPD标记对浙江天 目山
及重庆金佛山银杏群体及部分栽培品种进行研究。
两个群体分别为 24％和 23 ，总的基因多样性为
0．332 5，其 中 95．5 存 在于种群内。Ruhul等
(2002)利用 RAPD及 RFLP技术对美国东部的银
收稿 日期 ：2004—07—06 修订 日期：2004一10—12
基金项目：江苏省科技项目“银杏和何首乌资源遗传分析及药用新品种选育”(BG2OO413)
作者简介：莫昭展(1974一)·男·广西博白人，讲师．博士生．从事生物教学与研究工作。E-mail：zhaozhangmt~hotmail．corn
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4期 莫昭展等：银杏分子技术的研究进展 357
杏遗传多样性作了分析。采样点有三处：宾夕法尼
亚 l2株 ，尼亚加拉瀑布和华盛顿特区各 2株。结果
表明，宾夕法 尼亚银 杏的多 态位点 百分率 为 5 。
三个采样点各取 2株进行分析时，发现尼亚加拉瀑
布的 2株银杏与华盛顿群体有 45 差异性条带。
经 F检验证实，宾夕法尼亚及华盛顿特区的银杏遗
传结构极为相似(P>0．999 9)，而与尼亚加拉瀑布
银杏不同(P<0．05)。葛永奇 等 (2003)利用 ISSR
对中国 3个可能的野生群体(浙江天 目山、贵州务川
和湖北大洪山，各 l5个单株)及江苏泰兴(15个单
株)和美国纽约(6个单株)的栽培银杏群体的遗传
多样性进行了研究 。结 果表明，自然群 体的多态位
点百分率较高，为 57 (贵州务川1)和 5O (浙江天
目山、湖北大洪山)，而栽培群体则较低，为 34 (江
苏泰兴)和 24 (美国纽约)。在 3个群体中，总变
异的 l5 存在于群体间。
可以看出，银杏确实存在遗传多样性，其中自然
群体的遗传多样性高于栽培群体，但这种多样性主
要存在于群体内部，群体之间的差异较小，说明银杏
群体存在较强的奠基者效应，它们都起源于少数个
体，在漫长的繁衍过程中逐渐产生变异。依据孑遗
植物避难所较其后裔具有更高的遗传多样性(Lew—
is，1995；Comes，1998)，那么贵州务川1极有可能为银
杏的最后避难所。由于银杏具有极强的萌芽更新能
力，极易进行无性繁殖，其分布区域可能存在人为活
动干扰，加上采样策略和分析手段的不同，导致最后
的结论数据有差异。显然，已有的研究结果并未能
彻底解决问题，还需要在以下几个方面作出努力：扩
大研究群体对象，重点是一些人迹罕至的银杏自然
分布区；适当扩大样本数(每群体 3O株以上)(李昂
等，2000)，注重其代表性 ；提高研究 手段 (Camacho
等，2001)；并结合野外生境、群落结构调查等。
2 银杏进化地位的研究
由于裸子植物之间的亲缘关系相对较远，由于
同型现象及形态特征上的过度趋异导致很难区分祖
征和衍征 ，给银杏进化地位的研究带来了不确定性 。
分子标记技术的发展给解决这一难题带来了希望，
其研究的对象有叶绿体、线粒体和核基因组的核苷
酸或氨基酸序列及叶绿体基因组的排列方式等。
Palmer等 (1982)研究 了银杏叶绿体基 因组
(cpDNA)的限制图谱及包含核糖体 和 l7种编码蛋
白的基因图谱。银杏 cpDNA大小为 158kb，同大多
植物一样，有两个反向重复序列(IR)，IR大小为
l7kb，基 因排 列顺 序 也 与 大 多种 子植 物一 致
(Raubeson，1992)。在裸 子植物中，针叶植物的 cp-
DNA只有一个 IR，这与银杏不同，据此可将针叶植
物划为一单系类群，其中不包括银杏，这一结果与传
统分类相一致(Strauss，1988)。cpDNA 中存在基
因的缺失或插 入，如研究 发现在被 子植物 cpDNA
中存在 chlL基因(编码叶绿素酸酯还原酶，与黑暗
条件下叶绿素合成有关)缺失。通过与包括银杏在
内的众多植物的 cpDNA比较发现，chlL基因缺失
特征为个体衍征(Suzuki，1992)。cpDNA的核苷酸
顺序及其编码的氨基酸顺序也为系统学提供了大量
信息，rbcL基因(编码 RuBP羧化酶大亚基)则是分
子系统学 中研究最为详尽的一个基因(Manhart，
1994)。rbcL基 因进化速率较慢 ，适于科 以上分类
研究 。Hasebe(1992)等首 次对包 括银 杏在 内的裸
子植物各纲的 rbcL基因进行了研究，证明现存裸子
植物为一单系类群。由于信息点较少，利用氨基酸
序列信息所构建的裸子植物的系统发生树缺乏统计
学支持。核苷酸序列信息表明，银杏与苏铁亲缘关
系最近，而密码子第 l、2位核苷酸信息则进一步验
证 了 这 一 点，其 bootstrap支 持 率 达 8O 以 上
(Goremykin，l996)。相对而言，针叶树的 cpDNA
研究较为深入，因此对银杏、苏铁、买麻藤等 cpDNA
的进一步研究将更有助于了解银杏的进化地位。
Hiesel等(1994)对植物线粒体基因组(mtD-
NA)中 COXm基因(编码细胞色素 C氧化酶第三大
亚单位)序列进行了研究。由 COX m基因的 381个
核苷酸序列构建的系统发生树同样表明了银杏与苏
铁亲缘关系最为相近。
Hori等(1985)利用核基因5S rRNA序列构建
了包括银杏在内的分子系统发生树，结果也是银杏
与苏铁亲缘关系最为接近。但由于信息位点较少，
基因序列较短(120bp)，这一结果缺乏统计学支持。
核基因 18S rRNA序列结果支持银杏和苏铁作为一
单系类群，bootstrap支持率为 76 (Chaw，1995)。
Doyle等(1994)利用 18S和 26S rRNA部分序列信
息先将针树类与苏铁聚为一类，然后再与银杏聚为
一 类，bootstrap支持率为 88 。Troitsky(1991)报
道了银杏 4．5S，核 5S以及叶绿体 5S rRNA基因序
列，结果支持银杏与苏铁聚为一类。
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358 广 西 植 物 25卷
3 银杏 品种分 子鉴别 和遗传连锁
图谱的构建
3．1银杏品种分子鉴别
目前我国银杏栽培品种(系)已达百余个以上，
从分子水平上去鉴定、比较、评价这些宝贵的资源，
对更好地保护和利用银杏具有重要意义。
毕春侠(1998)分析 了银杏 lO个品种 的过氧化
物同工酶酶谱，发现不同品种在酶带及 Rf值上存在
差异，据此将这 lO个品种划分为 4个类群。
谭晓风(1998)以 l5个银杏栽培品种的胚乳为
材料，利用 RAPD方法使用 l2个引物扩增出了2O
条多态性谱带，并确定了 2O个标记基因型。通过聚
类分析将这些品种划分为 4个类群，与较早期的 3
大类分类系统(佛手、马铃、梅核)基本吻合。冯晓黎
(2002)应用同样方法，利用 6个引物确定了49个标
记基因型，对 l7个栽培品种进行了鉴别和分类。通
过聚类分析将其分为两大类，结果与形态分类有所
不同。刘叔倩 等 (2001)以银 杏叶 片为材料，用
RAPD方法使用 l5个引物对 28个银杏栽培品种
(系)进行了遗传多样性检测和遗传分析，其多态位
点百分率为 3O．5 9，5。样品间的相似性较高，遗传变
异较小，在取相似系数域值 0．87的条件下，可将它
们分为 2个类群，但没有进一步地与传统分类相比
较。桂仁意(2004)以41个银杏栽培种为材料利用
筛选出的24对 RAPD引物对所有 41个样品进行
RCR扩增出多态性条带 43条，多态位点百分率为
24．6 9，5；利用筛选 出的 14对 ISSR引物对所 有 41
个样品进行 RCR扩增出多态性条带 3l条，平均每
条引物扩增清晰条带数为 12．9条，多态位点百分率
为 17．2 9／6；ISSR所揭示的银杏栽培群体的遗传多
样性高于 RAPD分析所得的结果，而且其所估算参
数的标准差要低于 RAPD所估算出的值，因此，在
研究银杏品种亲缘关系上，ISSR分子标记技术比
RAPD分子标记技术更为合适；聚类分析结果表明，
运用分子标记所进行的分类结果与传统的分类结果
不相吻合。
利用单倍体胚乳为材料进行分子鉴别时，由于
能区分纯合和杂合位点，因此较二倍体材料更为高
效。但因银杏童期长，取样会受到限制。银杏栽培
群体的遗传多样性较 自然群体低，要注重对自然群
体资源的利用。
3．2遗传连锁图谱
谭晓风等(1998)用 RAPD分子标记构建了第 l
张银杏分子遗传图谱。该图谱共有 62个 RAPD标
记，19个连锁群，总长度为 829．1 cm，覆盖了银杏
基因组的 1／3。桂仁意(2004)也进行了银杏遗传连
锁图谱构建的研究，获得的连锁图谱的遗传跨度为
l 742．20cM，覆盖整个基因组大小的 79．2 9，6。连锁
图标记间的平均距离为 10．82cM。最大的连锁群
图距为 261．2cM，最 小的 连锁群 图距 为 62．4cM。
其中，相邻连锁位点间图距最大的为 42cM，大于
40cM的作图盲区也只一个。在银杏遗传图谱构建
中，受银杏自身的遗传变异限制，很难建立一个永久
性的作图群体，只能用单体胚乳组织；目前建立的银
杏遗传图谱密度偏低，远不能满足数量性状基因定
位的要求 。
4 银杏雌雄鉴别及相关研究
银杏童期长，实生树定植后需 2O～25 a才能开
花结果。因银杏种子在 成熟时具有 一种特殊 的臭
味，所以作为绿化树种只需雄株，而以生产白果为目
的则需要大量的雌株。因此，有很多关于银杏雌雄
株性别鉴别的形态学、生理生化指标、同工酶谱、化
学药剂处理和染色体核型鉴定等方面的研究报道
(程晓建等，2002)，但这些研究结果都不理想。银杏
雌雄差异源于内遗传物质差异，因此可直接从 DNA
水平出发，寻找性别差异。
王晓梅等(2001)应用 150个 10bp的随机单引
物及 llO对双引物组合，对雌雄 2个 DNA池(各有
lO株)进行 RAPD分析，获得了 1个与雄性相关的
RAPD标记，该引物序列为TGATCCCTGG。同时
还利用 AFLP技术，应用 48个引物组合，筛选与银
杏性别相关的分子标记。其中 3个引物组合各提
供了 1个与雌性相关的分子标记。经 Southern点
杂交证实有两个标记(E2／M5和E5／M3)为银杏雌
性基 因组所特有。
为进一 步了解银杏 的雌雄 差别，张建业等
(2002)克隆了银杏雄株全长 LEAFy基因，该基因
序列与 genebank中银杏雌株 LEAFy基因核苷酸
和蛋白质序列同源性都高达 99 9，6。该基因含 2个
内含子，3个外显子。与雌株 LEAFY基困相比较，
雄株 LEAFY基因少 3个碱基，突变均在植物该基
因的非保守区内。
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4期 莫昭展等：银杏分子技术的研究进展 359
MADS—box基因是广泛存在于动植物体中的
调节基 因家族，也是 目前植物界了解最 多的调节基
因家族，在植物的花分生组织、花器官及各种营养器
官中有不同形式 的时空表达模式 (蔡 小钿，2000)。
Muriel Jager等对银杏 的 MADS-box基因进行了研
究。在银杏基因组中存在大量 MADS—box基因，推
测这与基 因重复有关。将 MADS—box基因之一
GBM5克隆并测序，发现它与拟南芥(Arabidopsis
thaliana)的 AGAMOUS基 因同源 ，在花器 官及营
养器官中均有表达 。目前 genebank上已有大量银
杏 MADS-box基因序列数据。
5 其它研究进展
孙天恩等(2000)用细胞光度术(Cytophotome—
try)定量分析了银杏细胞核 DNA的含量，认为其二
倍体细胞核 DNA有质量 为(19．40+0．78)×10
g，其 C值为(9．7O+0．62)×10 g。知道 了银杏细
胞核DNA的质量可以大致估计其基因组的大小。
平均 1．0×10 g相当于0．965×10。个碱基对，因此，
银杏 细胞 核 DNA 大 约有 18．721×10。个 碱基 对
(bp)。这对于银杏基因工程的操作有重要参考价值。
植物细胞器中存在 mRNA编辑现象。在高等
植物叶绿体中，C—U的转变发生于特定位点，它们
位于蛋白质编码区，并能改变 mRNA的编码产物。
Jorg Kudla等(1999)等报道了 psbE操纵子的 RNA
编辑模式，发现了4个 C—U编辑位点，有 2个是银
杏所特有的，其中 1个位于顺反子间隔区。这点非
常令人惊奇 ，因为这是在植物 叶绿体 中第 1次发现
存在于非编码区的 RNA编辑位点。Jorg Kudla等
对此进行了分析，认为它没有生理功能，可能是进化
的遗留产物，或者因与其它编辑位点类似而被编辑
因子识别。Hiesel等(1994)将银杏 COXⅢ基 因的
cDNA与 mtDNA序列比较发现，在 mRNA编辑过
程中，共有 21个 C转换成 了 U。虽然这种转换 在
维管植物中较为普遍，但就转换的核苷酸相对数量
而言，银杏是最多的。
银杏自身具较强 的抗病、抗虫能力。黄虎等
(2001)从银杏的叶片中纯化获得了 1个抗真菌蛋白，
把它命名为 GAFP1。它能够抑制水稻纹枯病菌和棉
花炭疽病菌菌丝的生长，与蛋白质数据库中已知的蛋
白质没有同源性，可能是 1个新的抗真菌蛋 白。
在银杏转基因研究方面，张伦等(1999)报道，发
根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)可侵染银杏
幼叶、幼芽、幼茎，其中 AlOO，15834菌株侵染率最
高，可达 l8．5 ，形成毛状根。此毛状根能合成农
杆碱。刘树楠等(1998)报道了同样的结果，并且证
明银杏毛状根还具有合成银杏黄酮和银杏内酯的能
力。Dupre—P等(2000)建立 了一个用农杆菌 (A．tu—
mefaciens)转化银杏的系统。将胚和携带有报道基
因 gus和选择基因 nptlI的质粒载体 pTHW136的
农杆菌共同培养，当用 1．5个月大的胚在盐浓度低
的培养基上培养时，可获得最高转化率 45 。
在银杏 DNA文库构建方面，黄代青等(2002)
首次采用染色体微分离微克隆技术 ，构建 了银杏第
l染色体 DNA文库，约含有 75 000个重组子，插入
片段的平均大小为 800bp。
植物 rDNA是由高度重复的序列组成的多基
因家族，在 nDNA、epDNA及 mtDNA中都存在，目
前最常用的是核 rDNA。陈月琴等(1999)测定了银
杏 l雌株 rDNA ITS区全序列共 l 172bp，其中
ITSl为 788bp，ITS2为 226bp，5．8S基 因为 l58bp
对测验结果与从 Genbank中获取 的栽培于意大利
的银杏 rDNA ITS的序列进行 比较，并采用计算机
分析进行序列的排列与分析，结果表明，形态上很少
变化的银杏，其个体之间有明显的分子差异，不同产
地栽培株 rDNA ITS区序列的核苷酸差异高达 25 。
6 问题和展望
由于分子标记技术具有快速、微量、特异性强、
准确可靠等特点，且不受生育阶段、供试部位、环境
条件、贮藏等因素的影响，获得的大量分子数据能直
接反映遗传物质差异而且对数据的评价相对容易，
因此广泛应用于银杏进化地位、遗传多样性、品种鉴
别、银杏遗传图谱构建及雌雄鉴别等研究。不过现
有的分子标记数据虽然支持将银杏与苏铁聚为一
类，但分子标记数据还较少，且 bootstrap支持率不
高。另外应用形态特征对裸子植物进行分支分类研
究的报 道很 多，研究 结果 存 在争议 (Rothwel，
l994)，且与分子标记数据结果差异都比较大。当分
子标记数据积累到一定程度时，可结合形态特征数
据对银杏的进化地位作出正确评价。在银杏遗传多
样性研究中 ，虽然得出了一些结论 ，但重点是要扩大
研究范围，注重对银杏 自然分布区的实地调查。在
雌雄及品种分子鉴别上，则需要发展简单、可靠并能
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36O 广 西 植 物 25卷
进行早期检测的手段。
有关银杏雌雄性别决定和开花调控的分子机理
现在所知甚少。在银杏遗传图谱构建中，受银杏 自
身的遗传变异限制 ，很难建立一个永久性的作图群
体，只能用单体胚乳组织；目前建立的遗传图谱密度
偏低，远不能满足银杏数量性状基因定位的要求，若
要对银杏基因组进行深人研究 ，必须发展分子标记 ，
构建高密度的遗传图谱。在银杏转基因研究中，目
前还没有合适的植物再生体系。
毫无疑问，银杏的分子生物方面的研究已取得
了一定的进展，为银杏的开发和应用奠定 了良好 的
基础。随着分子技术的发展，当人们对银杏的资源
有更全面的了解 ，对银 杏的 DNA序列有更 多的认
识，弄清银杏体内基因如何控制合成有用的特殊次
生代谢产物之后，可将这些特殊基因转人合适受体
进行表达，生产次生代谢产物。若能进一步完善银
杏体细胞胚培养系统，也可对银杏进行遗传转化，培
育出符合人们需要的银杏植株。随着体细胞胚克
隆、各种组织器官培养和繁殖体系的日趋完善，以及
酶工程、发酵工程在银杏上的应用，银杏将在医药、
农业、园艺、林业上发挥 出更大的作用。
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