全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(1)：121一 l25 2008年 1月
红豆杉离体细胞四倍体的诱导
李丽琴，付春华，王 圣，栗茂腾，余龙江
(华中科技大学 生命科学与技术学院，武汉 430074)
摘 要：细胞大规模培养被认为是 目前生产紫杉醇最有希望 的替代途径之一，获得更高产的细胞系，可降低
细胞大规模培养生产紫杉醇的成本，加速其产业化进程。药用植物多倍体与二倍体相比具有根，茎，叶和花果
的巨型性，抗逆性强，次生代谢产物含量提高等特性。本研究通过同步化培养和秋水仙素诱导处理，成功建立
了红豆杉四倍体细胞系并且经过 7个周期 的继代证明了该细胞系的稳定性。结果显示，用浓度为 750 mg／L
的秋水仙素处理 3 d可以得到稳定传代的四倍体细胞系，其四倍体细胞比例稳定在 62．5 。进一步对其次生
代谢产物紫杉醇的检测显示该四倍体细胞比对照二倍体细胞具有更高的合成紫杉醇的能力。
关键词：红豆杉细胞；秋水仙素；四倍体；染色体；紫杉醇
中图分类号 ：Q943．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)01-0121一O5
Tetraploid induction 0f vitro Taxus chinensis cell
LI Li—Qin，FU Chun-Hua，Ⅵ NG Sheng，
LI Mao—Teng．YU Long—Jiang
(College of Li Science and Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：Large-scale culture of Taxus cell is considered to be one of the most promising alternative methods to produce
taxo1．Heavy producing cel line can cut down the cost of taxol production and promote the process of industrializatior~
Compared with diploid，multiploid medicinal plant has the characteristics of giantism，which express in roots，stems，leav—
es，flowers and fruits，strong antireversion force and high contents of secondary metabolites．This research established
tetraploid chinensis cel line by the methods of synchronization culture and inducing treatment of colchicine．Through
7 cycles subcultures，stability was demonstrated．Results showed that treating the chinensis cels with 750 mg／L col—
chicine could get stable tetraploid cell line whose tetraploid cell rate maintained in 62．5 ．Further to detect taxol，its
secondary metabolite，tetraploid cel line had stronger ability to produce taxol compared with diploid cel line．
Key words：Taxus chinensis cel；colchicine；tetraplont；chromatosome；taxol
紫杉醇(Taxo1)为红豆杉属(T~xus)植物中分离
出的一种二萜类生物碱化合物，具特殊的抗癌药效，
以其独特的抗癌机制、优良的疗效以及尖锐的供需矛
盾备受世人关注(De Furia，1997；Augusto等，2005；
Michael等，2005)。紫杉醇主要靠化学半合成法获
得，但半合成前体仍需依赖有限的红豆杉资源，因此，
细胞大规模培养被认为是 目前生产紫杉醇最有希望
的替代途径之一(Oksman等，2004)。但目前细胞大
规模培养尚未用于紫杉醇的生产，因为细胞大规模培
养生产紫杉醇的成本仍高于天然提取 ，这也是 目前世
界相关领域研究共同面临的问题 (Oksman等，2004；
Vanisree等，2004)。因此，要提高红豆杉细胞大规模
培养生产紫杉醇的市场竞争力，最终实现产业化生
产，必须获得更高产的细胞系。
染色体是基因的载体，由于染色体数 目的增加，
基因重新组合并通过酶的作用会影响到一系列蛋白
质的合成及其各种性状，多倍体与二倍体相比具有
根，茎，叶和花果的巨型性，抗逆性强等特性(张爱民
等，2005)。药用植物染色体倍性的变化往往会导致
次生代谢产物含量的变化，这就有可能获得有效成分
收稿Et期 ：2006—04 10 修回日期：2006—12—23
基金项 目：中国博士后基金(2003031490)[Supported by Science Foundation for Postdoctor of china(2。o303449。)]
作者简介：李丽琴(1979一)，女，湖北咸宁人，硕士研究生，研究方向为植物细胞培养
通讯作者(Author for corresp0ndence，E—mail：yulongjiang@hust．edu．cn)
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含量较高的药用植物新类型。我国于 2O世纪 7O年
代开始将这一技术用于药用植物的品种改良，在实践
中发现，大多数多倍体中次生代谢产物的含量都有所
增加。高山林等(1996)在研究丹参多倍体性状和药
树质量的关系时报道，丛根类型的丹参多倍体品性不
仅产量增加，而且丹参酮的平均含量远高于对照组。
刘选明等(1995)对获得的同源四倍体黄花菜进行分
析后认为，四倍体的蛋白质含量、含糖总量等LL$1应
的二倍体大幅度提高。王建军等(1998)报道，四倍体
莳菜氨基酸含量及叶绿素含量均比二倍体高。相对
于诱发多倍体植株而言，离体组织细胞染色体加倍由
于具有容易控制实验条件和重复实验结果，提高工作
效率，减少嵌合体等优势而逐渐受到重视(李贤等，
1998；郭启高等，2000)。因此本研究拟利用秋水仙素
对中国红豆杉悬浮细胞进行诱导培养，希望能得到高
产紫杉醇的红豆杉四倍体细胞系，为大规模细胞培养
生产紫杉醇提供合适的材料。
1 材料和方法
1．1供试细胞株及培养条件
取华中科技大学生命科学学院资源生物与生物
技术实验室继代培养的，分散性良好，同一来源的中
国红豆杉(Taxus chinensis)悬浮培养细胞，培养基
为改良MS培养基。
1．2同步化处理及细胞有丝分裂指数的测定
同步化的处理采用梅兴国等(2001)的方法，即
固体培养 7 d后在 4℃处理 24 h，再转入液体培养
基恢复培养 24 h时。同步化的水平用细胞有丝分
裂指数进行评价，在同一时期细胞有丝分裂指数越
高可以认为细胞同步化水平越高(陈超等，2005)。
细胞有丝分裂指数的测定：取红豆杉细胞用碱性品
红染色，压片，于显微镜下观察细胞时相，每个样本
计数 1000个以上细胞，分别计数分裂期和非分裂期
细胞，最后分别计算分裂指数。细胞分裂指数(oA)
一 分裂期细胞数／全部细胞数×100 9，6。
1．3秋水仙素处理
采用三种秋水仙素浓度(终浓度)：500、750、1 000
mg／L。具体步骤：红豆杉细胞经同步化处理，在正常
条件下恢复培养 24 h，然后分别用含有三种不同浓
度的秋水仙素的液体培养基悬浮培养，2～3 d后用
新鲜液体培养基清洗细胞 3次，重新接种到新鲜液
体培养基中继续悬浮培养。每隔 20 d继代 1次。
1．4细胞染色体倍性的鉴定
用 0．004 mol／L 8一羟基喹啉室温下预处理 3 h，
0．007 5 mol／L KC1前低渗处理 30 rain，盐酸室温
下酸解 15 min，卡诺氏固定液(乙醇 ：冰醋酸 一3 l
1)固定材料 3～5 h，最后用碱性品红染色 5 min，压
片，镜检，拍照。随机观察 4O个分裂相细胞。加倍
率=四倍体细胞数／40个分裂相细胞数。
1．5细胞生长率的测定
以继代培养 7次后的细胞为实验材料，培养 2O
d为一周期，每 3 d取样一次称量细胞干重(mDW)。
细胞干重(mDw)即新鲜细胞放入 4O℃烘箱里烘至
恒重的数值，每个数值均为 3个平行样的平均值。
1．6细胞死亡率的测定
以液体悬浮培养 20 d为一周期，每 4 d取样一
次分析，参见梅兴国等(2001)进行。取细胞悬浮液
在砂芯漏斗过滤。1 g细胞 在 0．05 Evans Blue
浸泡 10 min。用蒸馏水洗至无色，在 4 mL 1 SDS
(50 oA甲醇配成)50℃保温 30 min，加入 2 mL蒸馏
水稀释。振荡后在 8 000 r／min离心 3 min。取上
清液，以 600 nm处的吸光值为细胞死亡率。Evans
Blue对衰老或死亡的细胞具有很好的染色效果，而
对健康或活力高的细胞基本不染色，因此，常用于鉴
定细胞的死亡程度。
1．7培养细胞中紫杉醇含量的测定
使用 HPLC测定细胞中紫杉醇含量，具体方法
参见余龙江等(2000)。将鲜细胞冷冻干燥至恒重，
称取 100 mg干细胞，用 3 mL CH3OH—CH C1 混合
液(1：1)浸泡，超声处理 10 min，取出浸提液，向其中
加入 CH C1z2．0 mL、水 8．0 mL、(NH4) SO,饱和溶
液 l_0 mL，振荡萃取，收集 CH C1 层液体，4O℃下
真空干燥，最后用 1．0 mL CH OH重新溶解蒸干残
留物后进行 HPLC检测。HPLC仪为法国Gilson公
司全自动高效液相色谱仪，色谱柱为C-18反相柱，柱
温为 25℃，流动相为甲醇 ：水=7：3，流速为 1．0
mL／min，紫杉醇标准品由美国 NCI提供。第一次
测定是在秋水仙素处理后恢复培养的第 24 h。其
它均在继代培养的第 2O天取样分析。
2 结果与分析
2．1低温处理对细胞同步化和细胞死亡的影响
在预实验中，红豆杉细胞没有经过同步化处理
而直接用秋水仙素诱导，结果获得四倍体的比例并
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不理想，即使用终浓度为 1 000 mg／L的秋水仙素处
理 5 d，得到的四倍体比例也只达 6O 9／6。由于秋水
仙素处理的浓度过高，时间过长，对细胞的毒害作用
较大而导致细胞死亡率增加 ，细胞生长量明显减少。
秋水仙素的作用机理是通过与微管蛋 白结合 ，抑制
微管蛋白聚集成纺锤丝，从而干扰细胞的正常有丝
分裂 ，因此只对处于分裂期 的细胞有 加倍 的作用。
如果细胞的分裂指数不高则只有通过增加秋水仙素
的浓度和作用时间来达到提高加倍率的目的，但同
时又会导致秋水仙素对细胞的毒害作用增强，不利
于细胞的恢复培养。因此本实验考虑用同步化的方
法来使细胞达到同步分裂，提高细胞的分裂指数，从
而提高红豆杉细胞 的加倍率 。
细胞同步化主要有化学方法 (如磷 酸盐饥饿法
和羟基脲阻滞法)和物理方法(如低温和辐射等)。
据梅兴国等(2001)、周爱文等(2001)、刘华等(2000)
报道，低温诱导红豆杉细胞不仅可达到较高的细胞
分裂指数而且对细胞的毒害作用最小。本实验中，
红豆杉细胞经低温处理使细胞分裂指数提高到
8．5 (对照组 ．2 )，同步化水平增高。恢复培养
24 h后细胞死亡程度与对照相比没有明显区别 。
2．2秋水仙素处理浓度和处理时间对加倍效果的影响
从表 1看出，随着秋水仙 素的浓度在一定范围
内增高和处理时间的延长，加倍率逐渐升高。但是
秋水仙素浓度在 1 000 mg／L时，随着处理时间的延
长，加倍率反而降低。因此，在低浓度短时间的处理
下，由于对细胞的伤害并不严重，所以加倍率逐渐升
高，而在高浓度长时间的秋水仙素处理下，细胞受害
严重，从而导致了加倍率的降低。
1、2号处理方式得到的四倍体细胞比例小于
O ，在以后的继代过程中，占多数比例的二倍体细
胞可能会在生长中占优势从而抑制四倍体细胞的生
长，因此并不是得到可以稳定遗传的四倍体细胞系
的理想材料。由3、4、5、6号 4种处理方式得到的细
胞的四倍体比例均大于5O ，本实验选择这 4种方
式处理的细胞进行继代培养 ，以检验通过这 4种细
胞在继代过程中染色体的稳定性，最终获得四倍体
比例长期稳定 的细胞系。
以后的7次继代培养过程中，在每个周期的第
5天取样进行染色体倍性的鉴定(根据实验经验，液
体悬浮培养第 5～7天的细胞获得 中期有 丝分裂相
的几率最高)。3号处理方式的细胞的四倍体细胞
比例逐渐减少至 5O 以下。图 1是 4、5、6号处理
方式的细胞在 7次继代过程中四倍体比例的变化，
四倍体的比例最后都稳定在 5O％以上。图 2为红
豆杉细胞二倍体与四倍体的染色体数目的比较。
表 1 不同浓度秋水仙素和处理时间下红豆杉细胞加倍率
Table 1 Ploidy effect of different density and inducing
time of colchicine on TaXU5 chinensis cell
屡
器
圉
80
1 2 3 4 5 6 7
细胞继代次数Subculture tj s
图 1 继代过程 3种处理方式的细胞四倍体比例变化
Fig．1 Variation of tetraploid cell rate inducing by 3
kinds of different methods during subcultures
2．3秋水仙素处理对细胞死亡率和细胞生长量的影响
由图3、4可知，用第 5、6种方式处理的细胞其
生长量与对照相比明显下降，细胞死亡率升高，且观
察细胞和培养基颜色变黄，粘度增大；用第4种方式
处理的细胞其生长量和死亡率与对照无明显差别。
说明秋水仙素高浓度长时间的处理会导致细胞代谢
机能紊乱从而迅速导致细胞大量死亡，而适量浓度
的秋水仙素处理一定时间对细胞的生长不会产生太
大的影响，因此第 4种处理方式 ，即 750 mg／L处理
3 d，是最适宜的得到红豆杉细胞四倍体的方法。
2．4秋水仙素处理对细胞中紫杉醇含量的影响
由图 5可知，秋水仙素处理 24 h后，用 3种方
式处理的细胞的紫杉醇含量与对照组相比均有显著
的提高，以第 6种处理方式的含量最高。在以后的
继代过程中，3种处理方式的细胞的紫杉醇含量均
逐渐减少，第 6种处理方式的细胞的紫杉醇含量下
降得最快，最终稳定在 0．18 mg／g。第 4种处理方
式的细胞虽然在一开始产生的紫杉醇没有其他两种
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图 2 红豆杉细胞二倍体与四倍体染色体数目比较
Fig．2 Comparison of chromosome number Between diploid and tetraploid of Taxus chinensis cell
a．二倍体 2n=2x=24(×4OO)；b．四倍体 2n=4x=48(×4OO)。
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
培养天数Cu I ture days(d)
图 3 秋水仙素处理后的细胞死亡率
Fig．3 Cel death rate after inducing by eolehieine
2 5
毛 ·。
’
1 5
言1
． 0
0 5
4 6 8 10 12 14 16 18 20 22
培养天数 CuIture days(d)
图 4 秋水仙素处理后的细胞生长曲线
Fig．4 Cell growth CUrve after inducing by eolehieine
多，但是在以后的继代过程中紫杉醇含量下降趋势
比较缓慢，最终稳定在 0．25 mg／g，高于其他两种处
理方式的细胞。用第 4种方式，即用浓度为 750
mg／L的秋水仙素处理 3 d可最终得到四倍体比率
稳定在 62．5 的四倍体红豆杉细胞系。利用这种
方式处理的细胞相对于其它几种方法而言，细胞生
长量最高，死亡率最低，产生紫杉醇的能力最强，继
代稳定性较好，是较为理想的获得高产紫杉醇的四
1 2 3 4 5 6 7
继代次数 SubcuIture tj『fes
图 5 继代过程中紫杉醇含量的变化
Fig．5 Variation of taxol during the
process of subcultures
倍体红豆杉细胞系的方法。
3 讨论
利用秋水仙素进行染色体加倍具经济、方便、诱
变作用专一性强等特点，在多种植物上曾获得成功，
并育成了一些优良品种。对离体培养的细胞或组织
进行诱变处理，产生的变异效果更加明显。本实验通
过对离体培养的中国红豆杉细胞系进行同步化和秋
水仙素处理，得到了四倍体细胞数稳定在62．5 的红
豆杉四倍体细胞系。不同浓度及时间的秋水仙素处
理对红豆杉细胞的染色体倍性有显著影响，随浓度或
时间的增加，获得四倍体细胞系的比例也增大。在统
计检验中，二者虽不存在显著的互作效应，但试验结
果大体表现为随处理时间和浓度的同步递增。
在秋水仙素处理后 24 h，红豆杉细胞中紫杉醇的
产量提高了近 1O倍。引起这种现象的原因可能是秋
水仙素对细胞分裂的抑制导致了细胞代谓 紊乱，引起
细胞死亡率的增加。紫杉醇含量的增加是红豆杉细
∞ ∞ ∞ ∞
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胞应激性抗病反应的结果。四倍体细胞比例稳定在
5O 9／5以上的细胞系的紫杉醇含量升高可能有两方面
的原因：第一，红豆杉细胞与其他的植物细胞相比有
其明显的特殊性，能合成紫杉醇。紫杉醇作为一种抗
有丝分裂剂，在有丝分裂过程中，能促进微管蛋白迅
速聚集成纺锤丝，并阻止纺锤体的解聚，从而干扰细
胞的正常分裂，因而 具较 好 的抗 肿瘤 细胞的 作用
(Woo等，1994)。秋水仙素也是一种抗有丝分裂剂，
但其作用机理与紫杉醇却刚好相反，它是通过与微管
蛋白结合，抑制微管蛋白聚集成纺锤丝，并抑制纺锤
体的形成，从而干扰细胞的正常有丝分裂(Oriol等，
2004)。秋水仙素的处理会引起红豆杉细胞紫杉醇产
量明显增加的原因也可能是红豆杉细胞 自身产生的
紫杉醇对于纺锤体的作用与秋水仙素相反，外源秋水
仙素的添加会促使细胞生产更多的紫杉醇与秋水仙
素的作用相拮抗，以减少秋水仙素对细胞的毒害作
用。据周嘉裕(2002)和余龙江等(2002)的报道，离体
组织材料加倍中，秋水仙素使用的最适浓度为0．01 9／6
～ O．O5 ，但在我们的预实验中，低于0．05 9／6的浓度
的秋水仙素几乎不能引起红豆杉四倍体细胞的出现。
这从另一个方面佐证了我们的这个推测。第二，刘宝
等(2000)在研究中发现，多倍体在形成过程中通过甲
基化水平对基因的表达进行调控，实现遗传二倍化。
因此，在药用植物次生代谢过程中则有可能会使某些
基因沉默，导致某些次生代谢水平降低，从而向着另
外的次生代谢产物的方向发展。
本研究通过同步化培养和秋水仙素诱导处理，成
功建立了红豆杉四倍体细胞系并经 7个周期的继代
证明了该细胞系的稳定性。结果显示用浓度为 750
mg／L的秋水仙素处理 3 d可得到稳定传代的四倍体
细胞系，其四倍体细胞比例稳定在62．5 9／6。进一步对
其次生代谢产物紫杉醇的检测显示该四倍体细胞比
对照二倍体细胞有更高的合成紫杉醇的能力。并成
功获得了产量达 0．25 mg／g的高产细胞系，为推动细
胞大规模培养生产紫杉醇提供了很好的原材料；在后
面的研究中，可利用这一材料通过进一步对细胞培养
过程中甲基化水平及紫杉醇合成过程中关键酶类如
HMGCoA还原酶(HMGR)、GGPP合酶、紫杉二烯合
酶、细胞色素 P45o氧化酶等的表达活性进行分析，更
深入地探索细胞多倍体提高紫杉醇产量的机理。
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