全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(3)：493— 496 2OO7年 5月
EST—CAPS标记在尾叶桉×细叶
桉 F1中分离的研究
张照远 一，甘四明1*，李发根1，李 梅 ，胡哲森2
(1．中国林业科学研究院 热带林业研究所 ．广州 510520；2．福建农林大学 林学院，福州 350002)
摘 要 ：对 7个 EST—CAPS标记在尾叶桉 X细叶桉 Fl中分离的研究表明：5个 EST—CAPS标记呈 1：1的分
离 ，但其中 1个偏离孟德尔分离(a一0．05)；另外 2个 EST—CAPS标记呈 1：1：1：1的分离 ，且均符合孟德尔
分离。孟德尔正态分离的 EST—CAPS标记 比例达 85．7 ，偏分离标记 比例为 14．3 ，表明 EST—CAPS标记
是一种可靠的遗传标记，可用于桉属树种遗传图谱构建和相关研究。另外，探讨了偏分离的可能原因。
关键词：EST-CAPS；桉树 ；分离
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2007)03—0493—04
tion of EST-CA~ markers in an interspecific
CROSS 0f— calyptus ,phylla X E．tereticornisIZu uro iz l u t
ZHANG Zhao-YuanI，2，GAN Si—Ming1*，LI Fa-Gen1，LI MeiI，HU Zhe-Sen2
(1_Research Institute of Tropical Forestry，Chinese Academy of Forestry，Guangzhou 510520，China；
2．College of Forestry，F ian Agriculture and Forestry University，Fuzhou 350002，China)
Abstract：Segregation of EST—CAPS markers was investigated by using an interspecific cross of Eucalyptus
UtOpitylla X E．tereticornis Smith and seven ESTS derived from E．tereticornis．The results showed that five
EST—CAPS markers had a segregation ratio 1：1，four out of which segregated normally at a M endelian mode
(a一0．05)．while the left two EST—CAPSs segregated 1：1：1：1 at a M edelian inheritance mode．The rela—
tively high ratio of normal segregating EST—CAPS markers(6／7：85．7 )implies that the marker type could
be reliably used as genetic marker in genetic mapping and the related studies in Eucalyptus species．In addi—
tion，the possible causes of EST—CAPS segregation distortion were discussed．
Key words：EST—CAPS；Eucalyptus；segregation
切割扩增多态性序列(cleaved amplified poly—
morphic sequences，CAPS)也称 PCR—RFLP，其利
用基因组片段在酶切位点上的碱基变异，对该片段
的 PCR产物进行限制性 内切酶酶切从而产生等位
片段 (或等位基 因)的多态性 (Tragoonrung等，
l992；Konieczny等，l993)。CAPS是一种简便、可
靠、共显性的分子标记技术 (Konieczny等，l993)。
基于表达序列标签(expressed sequence tags，EST)
进行 PCR的 EST—CAPS可对具有基因功能的EST
片段进行分析，目前已在品种鉴定(Calderwood等，
1996)、基因定位(weiland等，2003)、标记辅助选择
(Moury等，2000)、遗 传 图谱 构建 (Nikaido等，
2000；Temesgen等，200l；Tani等，2003；Konovalov
等，2OO5)等方面得到了广泛的应用。
收稿日期：2005—09—01 修回日期 ：2006—02—20
基金项目：国家自然科学基金 (30371173)；国家“863”计划 (2006AA100109)；广东省自然科学基金 (O11386)[Supported by the National Natural
Science Foundation of China(3037l173)；National High Technologies Research and Development Program of China(2006AA100109)：NaturaI Science
Foundation of Guangdong Province(011386)]
作者简介：张照远(1980-)，男 ，河南信阳人，硕士研究生 ，主要研究方向为森林培育学 。
通讯作者(Author for correspondence，E-mail：smggan@pub．guangzho~g(L cn)
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桉树(Eucalyptus)是重要的工业用材树种，其
遗传图谱构建和相关的基因组研究越来越受重视
(Gratapaglia，2004)。但桉树遗传图谱构建仍存在通
用性标记不多、图谱密度较低的问题。目前桉树表达
序列标签测序已获得丰富的基因组资源，如 Genesis
已对 183 000余条 巨桉 (E．grandis)ESTs测序
(Strabala，2004)。因此，如何利用现有 ESTs资源
提高桉树遗传图谱的质量并开展比较基因组研究，
是一个紧迫的研究课题 ，EST-CAPS无疑是一项可
供选择的技术。
目前，EST-CAPS仍未用于桉树遗传图谱构
建，并且 EST—CAPS标记对桉树遗传图谱构建的可
行性(如遗传方式和分离比例等)也无研究。本文利
用来 自细叶桉 (E．tereticronis)的 7个 ESTs片段 ，
研究了 EST—CAPS在尾叶桉 (E．urophyla)×细叶
桉 F 中的遗传方式，以探索 EST-CAPS标记用于
桉属树种的遗传连锁图谱构建的可行性。
1 材料和方法
1．1材料
包括尾叶桉(0030)×细叶桉(4305)F。代谱系
的2亲本和 l3O株子代。该群体扦插后保存于广东
省新会市大泽镇(1l3。O2 E，22。32 N)，该批材料同
时也用作遗传图谱构建(Gan等，2003)和无性系选
择(甘四明等 ，2005)。
来自细叶桉备选 EST序列 54个，下载自Gene—
bank(htp：／／www．ncbi．nlm．nih．gov／)，引物设计通
过 Primer 3软件进行(http：／／www．frodo．wi．mit．
edu／primer 3／)，引物合成由上海生工公司完成。引
物筛选用 2亲本进行，能在 1个或 2个亲本中扩增
出一条清晰谱带的引物再用于酶的筛选。最后有 7
对引物用于正式扩增(表 1)。
备用限制性内切酶 3O种，购自上海生工公司
(16种)和北京鼎国公司(14种)。限制性内切酶的
初筛用 2亲本进行，复筛用 2亲本和 6个子代进行。
最后有 7种酶分别用于正式扩增产物的酶切(表 1)。
1．2 DNA提取、PCR反应和 CAPS酶切
DNA提取采用 CTAB法(Doyle等，1990)，稍有
改进(Gan等，2003)。PCR采用 lO L反应体系：lO
×Buffer 1．0 uL(100 rnmol／L Tris—HCI(pH 9．O)，100
mmol／L KC1，0．5 NP一40，80 retool／L(NH4)2S04，
25 mmol／L M 04)，0．2 mmol／L dNTPs，前 向和后
向引物各 0．05／~mol／L，DNA模板 2 ng，Taq DNA聚
合酶 l单位。PCR反应程序：94℃预变性4 min；94
℃变性 30 S，56℃或 6O℃退火 30 S，72℃延伸 l
min，进行 35个循环；最后 72℃延伸 10 min。
酶切反应体系为 l0 L：适合于各酶的 10×
Buffer 1．0 L，限制性内切酶 5单位，PCR产物 5．0
L。37℃恒温 4 h。酶切产物在含有溴化乙锭的
2．5 琼脂糖凝胶上 电泳，电泳缓冲液为 0．5×
TBE。电泳结果采用 Photoprint 215SD成像系统
(法国 Vilber Lourmat Co．)存盘并打印记录。
1．3 CAPS标记统计
标记位点按“EST名称 一酶”记录 ，酶切后的独
立分离谱带(不同等位基因)按从大到小分别记录为
“1”、“2”和“3”等以统计亲本和个体的基因型。标记
位点在杂交子代中的分离是否符合孟德尔遗传通过
X。适合度检验进行(a一0．05)。
2 结果与讨论
备选 54对 EST引物 中，有 35对能在 1个或 2
个亲本中扩增出一条清晰的谱带，谱带大小均不同
程度地大于原 EST序列中引物包含的序列长度(详
细结果未列出)。通过引物一酶筛选，3O种限制性
内切酶中，有 7种能分别对 7个 EST的 PCR产物
进行酶切并在亲本和子代中产生等位片段的多态性
(表 1、2)。图 1显示了 2亲本和部分子代个体的
CD668835 PCR产物经 MspI酶切的结果。
从表 2看 出，7个 EST—CAPS标记在尾叶桉 ×
细叶桉 F。中的分离主要有三种方式。一是 2亲本
的 PCR产物 均被 酶切，产生 2条 在亲本 间呈多态
的、在子代独立分离的谱带，子代中存在 4种基因
型，其分离比例为 1：1：1：1，如 CD668626一MvaI；
二是 1个亲本的PCR产物被完全酶切，另一亲本的
PCR产物既有被酶切的、也有未被酶切的，从而产
生 2条在亲本间呈多态的、在子代独立分离的谱带，
子代中存在 4种基因型，其分离比例为 1：1：1：
1，如 CD668837一BsuRI。三是 1个亲本的 PCR产物
被完全酶切 ，另一亲本 的 PCR产物既有被酶切 的、
也有未被酶切的，从而产生 1条在亲本间呈多态的、
在子代分离的谱带，子代中存在 2种基因型，其分离
比例为 1：1，这包括其余的 5个标记。
对 7个F_ST-CAPS标记在子代中分离的X 适合
度检验表明，其中 6个符合孟德尔遗传(a=0．05)
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3期 张照远等：EST-CAPS标记在尾叶桉×细叶桉 F 中分离的研究 495
(85．7％)，1个(CD668433一EcoR130I)(14．3％)偏离盂
德尔遗传分离，表明EST-CAPS是可靠的遗传标记。
本研 究在 54对备选 EST引物中有 35对
(64．8％)能够成功地进行 PCR扩增，这与欧洲赤松
表 1 引物、PCR片段大小和限制性内切酶
Table 1 Primers，size of PCR products，and restriction enzymes
注：*片段大小根据 100bpDNA marker估算 Note： Fragment size is deduced with comparison tO the 100 bp DNA Ladder
表 2 EST-CAPS标记位点统计及其分离的适合度检验
Table 2 EST—CAPS markers and test of goodness of fit for their segregation among sibs
注： 片段大小根据 100 bp DNA marker估算；一 偏离孟德尔遗传分离(a=0．05)。
Notes： Fragment size is deduced with comparison to the 100 bp DNA Ladder~ Segregation is aberrant significantly from the expectation(a=0．05)
MP，P2⋯ ⋯ ·-26个子代 26sibs⋯ ⋯ ⋯ -M
750bP
500bP
250bP
图 1 标记 CD668835一MspI的不同等位片段在 2亲本
和部分子代个体的分离情况
Fig．1 Profile of marker CD668835一MspI
over the parents and 26 sibs
M：DNA长度标定的 Marker：P 母本；Pz：父本。
右边箭头示酶切后的电泳片段。
(Pinus sylvestris)和火炬松(P．taeda)中 66．7％(60／
90)(Komulainen等，2003)、火炬松利用苗期 eDNA的
58％(50／85)(Temesgen等，2001)的比例近似，但比
云杉 (Picea abies)中 75．9 (41／54)(Ach6re等，
2004)、火炬松利用木 质部 eDNA的 76．0 (57／75)
(Temesgen等，2001)低。这可能与 EST建库植株与
试验材料的亲缘关系以及引物设计的特异性有关。
本研究虽然利用了 3O种限制性内切酶，但 54对引
物只得 到 7个 在子代 分离 的 EST—CAPS标记
(1 3．0 )，比利用 SSCP(single strand conformation
polymorphism，单链构象多态性)和 CAPS两种技
术对松树(24／90=27 )(Komulainen等，2003)和
云杉(19／54=35．2 )(Ach6re等，2004)的效率低
很多。另外，CAPS虽然在技术上较简单，但需要筛
选大量的限制性 内切酶，因此 比较费时(Temesgen
等，2001)。所以，需要利用更灵敏、更省时的技术检
测 EST多态性，如 SSCP和 DGGE(denatured gra—
dient gel eletrophoresis，变性梯度凝胶电泳)，这是
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我们下一步进行桉树遗传图谱构建中将要开展的工
作。
根据 EST序列设计的引物对基因组 DNA进
行 PCR扩增时，扩增产物通常会比目标 EST片段
长，这在以往的报道中普遍存在，如火炬松的EST
作图(Temesgen等，2001)和豌豆 (Pisum sativum)
的EST-CAPS作图(Konovalov等，2005)，主要是由于
内含子的存在。引物设计时尽量利用 EST序列 3 端
的 3OObp将有助于去除内含子(Temesgen等，2001)。
本研 究 EST-CAPS标 记 偏 分 离 的 比例 为
14．3 9／5，属中等水平，高于日本柳杉(Cryptomeria “一
ponica)中9．1 (2／22)的水平(Nikaido等，2000)，但
低于日本柳杉 19．9 和 31．3 (Tani等，2003)以及
火炬松 4O．6 ((36+29)／(85+75))(Temesgen等，
2001)的比例。同其它标记技术一样，EsT_CAPS的
偏分离普遍存在。标记偏分离的原因可能是多方面
的，如亲本遗传差异较大(Byrne等，1995；甘四明等，
2001)、分离群体偏小(Carlson等，1991)、致死基因的
存在(Mukai等，1995；0’Leary等，1998)和亲本杂交
过程中存在染色体结构的重排、缺失、插入和突变
(Kasha等，1970；Faure等，1993)等。
总结以上，EST—CAPS是一种简便、可靠的共
显性分子标记技术，在桉属中符合孟德尔遗传方式，
可以作为遗传图谱构建等分子生物学研究的工具。
中国林业科学研究院热带林业研究所吴坤明和
昊菊英副研究员进行 了杂交和育苗工作，广东省新会
市大泽镇林业站对试验材料保存提供 了大力协助，特
此致谢 !
参考文献：
Acher~V，Rampant PF，Jeandroz S，et a1．2004．A ful saturated
linkage map of Picea abies including AFLP，SSR，ESTP，5S rD—
NA and morphological markers[J]．TheorAppl Genet，108(8)：
1 602— 1 613
Byrne M，Murrell JC，Alien B，et a1．1995．An integrated genetic
linkage map for eucalypts using RFLP，RAPD and isozyme
markersFJ]．TheorAppl Genet，91(6—7)：869-875
Calderwod SB，Baker MA。Carrol PA。eta1．1996．Use of cleaved
amplified polymorphic sequences to distinguish strains of Staph—
ylococcus epidermidis[J]．J Clin Microbiol，34(11)：2 860—
2 865
Carlson JE，Tulsieram LK，Glaubitz JC，eta1．1991．Segregation of
random amplified DNA markers in Fl progeny of conifers[J]．
TheorAppl Genet，83(2)：194—200
Doyle JJ，Do yle JL．1990．Isolation of plant DNA from fresh tisue
FJ-I．Focus，12(1)：13—14
Faure S，Noyer JL，Horry JP． 1993．A molecular ma rker-based
linkage map of diploid bananas(Musa accuminata)[J]．Theor
Appl Genet，87(4)：517—526
Can SM(甘四明)，Shi JS(施季森)，Bai JY(白嘉雨)，et a1．2001．
Segregation of RAPD markers：A case in interspecifc cross of
Eucalyptus(RAPD标记 在桉 属种间杂交一代 的分离方式研
究)[J]．ForeRes(林业科学研究)，14(2)：125—130
Can S，Shi J，Li M ，et a1．2003．Moderate-density molecular ma ps
of Eucalyptus urophylla and E tereticornis genomes based on
RAPD markers[J]．Genetica，118(1)：59-67
Gratapaglia D． 2004． Integrating genomics into Eucalyptus
breeding[J]．Genet Mol Res，3(3)：369—379
Kasha KJ，Kao KN．1970．High frequency haploid production in
barley(Hordeum vulgare)[J]．Nature，225：874—876
Komulainen P，Brown GR，Mikkonen M，et a1．2003．Comparing
EST-based genetic ma ps between Pinus sylvestris and Pinus
taeda[J]．TheorAppl Genet，107(4)：667-678
Konieczny A。Ausubel FM．1993．A procedure for mapping Ara—
bidopsis mutations using codominant ecotype-specific PCR-based
markers[J]．Plant J，4(2)：403-410
Konovalov F。Toshchakova E，Gostimsky S．2005．A CAPS ma rk—
er set for mapping in linkage group III of pea(Pisum sativum
L．)[J1．CellMol Biol Lett，10(1)：163—171
Moury B，Pflieger S，Blattes A，eta1．2000．A CAPS marker to as—
sist selection of toma to spotted wilt virus(TSWV)resistance in
pepper[J]．Genome，43(1)：137—142
Mukai Y，Suyama Y，Tsumura Y，et a1．1995．A linkage map for
sugi(CryptomeHa japonica)based on RFLP，RAPD，and
isozyme loci[J]．TheorAppl Genet，90(6)：835-840
Nikaido AM。Ujino T。1wata H，et a1．2000．AFLP and CAPS
linkage maps of Cryptomeria japonica[J1．Theor Appl Genet，
100(6)：825—831
O’Leary MC，Boyle TH．1 998．Segregation distortion at isozyme
lOCUS Lap 21 in Schlum bergera(Cactaceae)is caused by linkage
with the gametophytic self-incompatibility(S)locus[J]．J
Hered，89(3)：206—210
Strabala TJ．2004．Expressed sequence tag databases from forestry
tree species[M]／／Kumar S，Fladung M(eds)．Molecular Ge—
netics and Breeding of Forest Trees．New York：Food Products
Press．19— 51
Tani N，Takahshi T，1wata H，et a1．2003．A consensus linkage
map for sugi(Cryptomeria japonica)from two pedigrees，based
on microsatelites and expressed sequence tagsEJ]．Genetics，165
(3)：1 551— 1 568
Temesgen B，Brown GR，Harry DE，et a1．2001．Genetic ma pping
of expressed sequence tag po lymorphism(ESTP)ma rkers in lob—
loly pine(PinusfnPc )[J1．TheorAppl Genet，102(5)：664—
675
Tragonrung S，Kanazin V，Hayes PM 。et a1． 1992．Sequence-
tagged-site-facilitated PCR for barley genome ma ppingFJ]．T’^P·
orAppl Genet，84(7—8)：1 002—1 008
Weiland JJ。Yu MH．2003．A cleaved amplified polymorphic se—
quence(CAPS)marker associated with root—knot nema tode re—
slstance in sugarbeetFJ]．Crop Sci，43(5)：1 814—1 818
维普资讯 http://www.cqvip.com