全 文 :广 西 植 物 Guihaia 25(5):431— 436 2005年 9月
栽培罗汉果遗传多样性的 ISSR分析
周俊亚1,唐绍清1
(1.广西师范大学生命科学学院,广西桂林 541004;2
, 向悟生2,宾晓芸1
薯 毳广西植物研究所,广西桂林54106)
摘 要 :应用 ISSR分子标记对 62份雌株和 13份雄株栽培罗汉果样品进行了遗传多样性分析 ,用 13条 ISSR
引物进行扩增,共得到 88条扩增带 ,其中 64条是多态性的。计算了样品间的相似性系数 ,分别对雌雄株做了
主成分分析,并用 UPGMA法进行聚类分析 。结果表明主要的栽培品种青皮果 、红毛果和爆棚籽 的遗传多样
性很低 ,它们的品种 内样品间相似性系数平均值分别为 0.958、0.952和 0.988,但有少数形态差异较大的样品
具有较大的遗传差异 ;而茶山果和冬瓜汉具有较高的遗传多样性,品种 内样品间的相似系数平均值分别为
0.879和 0.829;雄株也具有较高的遗传多样性。
关键词:罗汉果 ;栽培品种;遗传多样性;ISSR
中图分类号 :Q943.2 文献标识码 :A 文章编号 :1000—3142(2005)05—043卜O6
Genetic diversi ty of cul tivated Luohanguo
(Siraitia gros venoriZ)based on ISSR markerl fl 0 1 flK /,
ZHOU Jun—ya ,TANG Shao—qing ,
XIANG W u—shenge,BIN Xiao—yun1
(1.Colege of Life Sciences,Guangxi Normal University,Guilin 541004,China;2.Guangxi Institute of
Botany,Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and Academia Sinica,Guilin 541006,China)
Abstract:Luohanguo(Siraitia grosvenorii),a liana species Of Cucurbitaceae,is locally economic important cul—
tivated plant,endemical ly distributing in Southern China.The genetic diversity was analyzed using inter—sim—
pie sequence repeat(ISSR)technique,that a total of 62 female from eight cultivars and 13 male individuals were
collected.Employed with 13 ISSR primers,88 scorable amplified bands were detected,of which 64 were poly—
morphic.Principal components analysis(PCA)was conducted for females and males respectively,and dendro—
gram was constructed using an unweighted pair—group method with arithmetical averages(UPGM A)method
and Nei& Li similarity coefficient.The results demonstrated that a high degree of similarity among the major
cultivars Qingpiguo,Hongmaoguo and Baopengzi,with 0.958,0.952 and 0.988 of mean similarity coefficient of
intra-cultivars respectively,which indicated that they were low genetic diversity.However,the cultivars Chas—
hanguo and Dongguahan showed a relatively high genetic diversity,with mean similarity coefficient Of 0.879
and 0.829.The male individuals also had a high level of genetic diversity.
Key words:Siraitia grosvenorii;cultivar;genetic diversity;ISSR
罗汉果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C.Jeffr—
er ex A.M.Lu et Z.Y.Zhang)是单性 、雌雄异株的
葫芦科(Cucurbitaceae)植物。它的果实是传统中
药,用于治疗支气管炎 、急慢性咽喉炎、哮喘和感 冒
收稿 日期 :2004-04-20 修订 日期 :2004一l1—16
基金项目:国家 自然科学基金(Supported by the National Natural Science Foundation of China,Grant No.30260013)
作者简介:周俊亚(1979-),女 ,广西桂林 人 ,硕士生 ,研究方向:分子生态学 。
’通讯作者(Author for Correspondence,E-mail:shaoqing@mailbox.gxnu.edu.cn)
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等。罗汉果中所含甜度极高的甜味物质是一种低卡
路里的理想天然甜味剂 (李典 鹏等 ,2000),对肥胖
症 、糖尿病患者是理想的糖替代 品。广西北部的永
福县、临桂县是传统的罗汉果产地 ,是栽培罗汉果的
起源地(周良才等,1981),罗汉果是当地的经济支柱
之一。近年来广西北部的融安县、融水县、龙胜县和
灵川县的种植面积在逐步扩 大,广东北部 和贵州南
部也有少量种植。
ISSR(inter—simple sequence repeat)是一 种新
型的分子标记(Zietkiewicz等 ,1994),具有很高的稳
定性和多态性(Tsumuray等,1996;Fang等,1997),
已成功应用于某些重要经济植物的遗传多样性研究
(Blair等,1999;钱 韦等,2000;Martins等,2003;马
朝芝等 ,2003)。对罗汉果 的研究主要集中在化学成
分、甜味素提取、栽培技术和病毒防治等方面 (李典
鹏等,2000;斯建勇等,1996;余丽娟等,2003;杭玲
等,2003;蔡健和等,2001),而缺乏在遗传多样性方
面的研究报道。我们 应用 ISSR分子标 记对 75份
栽培罗汉果样品进行了分析 ,目的在 于研究栽培罗
汉果的遗传多样性 ,为栽培罗汉果种质资源的保护
和利用提供科学的依据。
1 材料与方法
1.1植物材料
实验材料采 自广西永福县龙江 乡、临桂县茶洞
乡和融安县雅瑶乡。在每一栽培农户处取样避免品
种重复(即每个品种只取一份样 品),相同的采集地
点同一品种的取样不 超过 3份。采集 到的植株叶
片,插入水中带 回实验室 ,存放 于一7O℃超低温冰箱
中备用。总共采集到 75份样品:雌株样品62份,其
中 61份分属青皮果 (Q)、红 毛果 (H)、爆棚籽 (B)、
茶山果(C)、冬瓜汉(D)、马铃果(M)、长滩果(T)、拉
江籽(La)8个品种 ,另有 1份样 品系不确定 ,以当地
习惯花皮籽(Ha)命名;雄株(Y)样品 13份。各样
品的编号和采集地见表 1。
1.2总 DNA提取、引物筛选与 PCR扩增
采用 CTAB法(Doyle等,1987)提取罗汉果叶
总 DNA。
实验所用 ISSR引物均 由上海生工公 司合成 ,
引物序列参照加拿大哥伦比亚大学(UBC)公布的
第九套 ISSR引物序列。从 69个引物中选出 13个
扩增条带清晰、多态性带明显、背景清晰、反应稳定
的引物用于全部 75份 DNA样品的扩增,各 ISSR
引物名称及序列见表 2。
ISSR扩增反应条件经过比较和优化确定为 25
L的 PCR反应 液内含:约 3O~5O ng模板 DNA,
1U Taq酶,1×PCR缓冲液,2.0 mmol/L MgC12,4
种 dNTPs各 0.2 mmol/L,0.5#mol/L引物。PCR
扩增程序为 94℃预变性 3 min,接着进行 40个循环:
94℃变性 1 min,52℃退火 5O S,72℃延伸 2 min,循
环结束后 72℃延伸 7 min。扩增产物用 1.5 的琼脂
糖凝胶 电泳分离,用 Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ
Marker作为标准分子量对照,溴化乙锭染色,复 日
FR一980凝胶成像仪上观察照相、记录。
1.3数据分析
ISSR是显性标记 ,同一引物的扩增产物中电泳
迁移率一致的条带被认为具有同源性,按照相同迁
移位置上有扩增带记为 1、无带记为 0的方法记录
电泳谱带,仅清晰、可重复的并且长度在400~2 000
bp范围内的扩增 带才被记 录。用 NTSYS-pe ver—
sion2.02软件(Rohlf,1998)计算了 Nei等(1979)相
似性系数,通过 该软件 的 Eigen程序分别对雌株和
雄株做主成分分析(PCA),并进行单株的 UPGMA
聚类分析。
2 结果与分析
2.1所有样品的多态性分析
用 13个 ISSR引物对 75份样 品的总 DNA 进
行扩增 ,所有扩增反应均重复两次 ,两次 PCR扩增
产物重复性好且稳定,扩增得到的条带数及多态性
带数见表 2。总共记录到了 88条扩增带(平均每个
引物 6.7条),其中64条是多态性的,多态条带比率
(PPB)为 72.73 。引物 UBC811得到的条带数最
少,为 3条 ;引物 UBC840得到的条带数最多,为 1O
条。其中引物 UBC866扩增得到的带型见图版 I。
2.2品种及雄株的遗传 多样性分析
根据得到的 0,1矩阵,计算样品间的 Nei和 Li
相似性系数。品种及雄株的平均相似性系数见表
3。结果表明青皮果、红毛果、爆棚籽的样品间相似
性系数很高,平均值分别为 0.958、0.952和 0.988。
这三个品种的品种内存在多个样品间没有遗传差异
的情况:青皮果 Q3等 5个样品之间、Q8等 4个样
品之间、Q1与 Q16及 Qll与 Q15之间,红毛果 H3
等 l2个样品之间以及爆棚籽B2等4个样品之间的
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5期 周俊亚等:栽培罗汉果遗传多样性的 ISSR分析 433
相似性系数为 1.O,即无遗传差异。茶山果、冬瓜汉
及雄株的遗传差异较大,相似性系数平均值分别为
O.879、O.829和0.877;两个长滩果样品间的相似性
系数为 0.969,而两个马铃果样品间无差异。
表 1 实验材料的名称和来源
Table 1 List of materials used in the study
编号 品种 采集地 编号 品种 采集地
Code Name Places of collection Code Name Places of collection
Q1 青皮果 龙江乡周村 Zhoueun,Longjiang B1 爆棚籽 龙江乡周村 Zhoucun,Longiiang
Q2 Qingpiguo 龙江乡周村 Zhoucun,Longjiang B2 Baopengzi 龙江乡驿马村 Yimacun,Longjiang
Q3 龙江乡周村 Zhoucun,Longjiang B3 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong
Q4 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong B4 龙江乡佳祥村 Jiaxiangcun,LonNiang
Q5 茶洞乡保和村 Baoheeun.Chadong B5 龙江乡 保安村 Bao’ancun,LonNiang
Q6 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong B6 龙江乡其竹村 Qizhucun,LonNiang
Q7 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong B7 龙江乡龙隐村 Longyincun,Long~iang
Q8 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong B8 龙江乡上维村 Shangweicun,Lon gjiang
Q9 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong C1 茶山果 龙江乡驿马村 Yimacun,I onNiang
Q1O 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong C2 Chashanguo 龙江乡驿马村 Yimacun,Longjiang
Q11 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong C3 龙江乡驿马村 Yimacun,Longjiang
Q12 龙江乡其竹村 Qizhucun,Longjiang c4 龙江乡龙隐村 Longyincun,Lon gjiang
Q13 龙江乡其竹村 Qizhucun,I on~iang C5 雅瑶乡大琴村 Daqincun,Yayao
Q14 龙江乡龙隐村 I ongyincun,I ongjiang D1 冬瓜汉 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong
Q15 龙江乡上维村 Shangweicun,I ongjiang D2 Dongguahan 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong
Q16 龙江乡佳祥村 Jiaxiangcun,I ongjiang D3 茶洞乡自石 口 Baishikou,Chadong
Q1 7 龙江乡拉江村 Lajiangcun,Longjiang D4 龙江乡佳祥村 Jiaxiangcun,Longjiang
Q18 龙江乡保安村 Bao ancun.I ongjiang D5 龙江乡龙隐村 Longyincun,Longjiang
Q19 雅瑶乡大琴村 Daqincun,Yayao D6 雅瑶乡大琴村 Daqincun,Yayao
H1 红毛果 龙江乡周村 Zhoucun,LonNiang M1 马铃果 龙江乡其竹村 Qizhucun,Lon~iang
H2 Hongmaoguo 龙江乡周村 Zhoucun,Longjiang M2 Malingguo 龙江乡其竹村 Qizhucun,Longjiang
H3 龙江乡驿马村 Yimacun,Longjiang T1 长滩果 龙江乡龙隐村 Longyincun,LonNiang
H4 龙江乡佳祥村 Jiaxiangcun,LonNiang T2 Changtanguo 龙江乡其竹村 Qizhucun,LonNiang
H5 龙江乡拉江村 Lajiangeun,Longjiang Ha 花皮籽 Huapizi龙江乡其竹村 Qizhucun,LonNiang
H6 龙江乡保安村 Bao ancun,Longjiang La 拉江籽 Lajiangzi龙江乡龙舌村 Longshecun,Lon~iang
H7 龙江乡其竹村 Qizhucun,LonNiang Y1 雄株 Male 龙江乡周村 Zhoucun,LonNiang
H8 龙江乡安民村 An’mincun,Longjiang Y2 龙江乡周村 Zhoucun,Longjiang
H9 龙江乡龙隐村 Longyincun,Lon~iang Y3 龙江乡驿马村 Yimacun,Longjiang
H10 龙江乡龙隐村 Longyincun,LonNiang Y4 茶洞乡保和村 Baohecun,Chadong
H11 龙江乡上维村 Shangweicun,LonNiang Y5 龙江乡佳祥村 Jiaxiangcun,Longjiang
H12 龙江乡下龙院 XiMongyuan,I onNiang Y6 龙江乡拉江村 Lajiangcun,Lon~iang
H13 龙江乡下龙院 Xialongyuan,Longjiang Y7 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong
H1 4 雅瑶乡大琴村 Daqincun,Yayao Y8 茶洞乡仁义村 Renyicun,Chadong
H15 雅瑶乡大琴村 Daqincun,Yayao Y9 龙江乡保安村 Bao’ancun,Longjiang
H16 雅瑶乡黄金村 Huangjincun,Yayao Y10 龙江乡龙隐村 I ongyincun,Lon~iang
H17 雅瑶乡黄金村 Huangjincun,Yayao Y11 龙江乡上维村 Shangweicun,LonNiang
H18 雅瑶乡黄金村 Huangjincun,Yayao Y12 雅瑶 乡大琴村 Daqincun,Yayao
Y13 雅瑶乡黄金村 HuanNincun,Yayao
为了进一步分析品种及雄株的遗传分化程度,
利用相似矩阵,对雌株的各个品种和雄株进行了主
成分分析,第一和第二主成分之和分别解释总变异
的 13.59 和41.23 。得到的二维关系见图 1、图
z。从图 1可以看出:青皮果、红毛果和爆棚籽的大
部分样品集中分布在各 自的区域,样品间的差异较
小。但是红毛果的 H1、H12、H13和 H15以及青皮
果的Q4和 Q7独立于各 自的集中区外,说明与品种
内其他样品的遗传差异较大。红毛果集中分布的区
域较之其他品种距离远,说明其遗传关系较远;青皮
果(除 Q4和 Q7)和爆棚籽各自集中在相对距离较
近的区域,说明两者关系靠近。而茶山果和冬瓜汉
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的分布松散 、范围较广 ,样 品间的差异明显 ,遗传多
样性较高。图 2显示 :13份雄 株样 品分布松散 ,彼
此之间的差异明显 ,具有较高的遗传多样性 。
表 2 引物名称、序列及其对 75份样品的扩增条带统计
Table 2 Primers,their sequences and the
amplification on 75 individuals
H=(A、C或T)}V=(A、C或G);R=(A或 T);Y=(C或 G)
表 3 品种及雄株的遗传相似性
Table 3 Brief summary of genetic similarities
within cuhivars and males
2.3单株的 UPGMA聚类分析
根据 Nei和 Li相似性系数应用 UPGMA法进
行聚类分析,得到的单株遗传关系见 图 3。结果表
明:青皮果(除Q4和 Q7)、红毛果(除 H1、H12、H13
和 H15)、爆棚籽各自聚为一支,这三分支的节点具
有很高的相似性系数;茶山果、冬瓜汉及雄株的样品
没有聚类在一起;两个马铃果样品无差异且与两个
青皮果样品聚在一起,表明它们有较近的遗传关系;
两个长滩果样品形成分支聚在一起;拉江籽、花皮籽
取样数少,它们各自独立出来。
3 讨论
据周 良才等(1981)的调查 ,当时的主要罗汉果
栽培品种有青皮果 (占总产量的 75 )、长滩果、拉
8
。 。
墨
Q:
.
0 0 .o.o6 B‘ o’08
First principal com ponent
图 l 罗汉果雌株的主成分分析图
Fig.1 Principal components analysis for females
图中字母代表的品种见表 1;第一主成分(7.6O )和
第二主成分(5.99 )变异占总变异的 13.59 。
The first(7.60 )and second(5.99 )principal components
account for 13.59 of the total variation.
First principal com ponent
图 2 罗汉果雄株的主成分分析图
Fig.2 Principal components analysis for males
第一主成分(24.46 )和第二主成分(16.77 )
变异占总变异的41.23 。
The first(24.46 )and second(16.77 )principal components
account for 41.23 of the total variation.
S 2 Q 7 ;
ho
“¨ :墨 。 。
。
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5期 周俊亚等:栽培罗汉果遗传多样性的 ISSR分析 435
江籽、冬瓜汉和红毛果 ,半野生的品种有茶山果和马
铃果 。我们 2003年对永福县龙江乡、临桂县茶洞乡
和融安县雅瑶乡的调查发现,现栽培面积最大的仍
是青皮果,红毛果的栽培面积次之,这两个品种的栽
培
个
裂
高
位
果已很难找到。相对而言,罗汉果的栽培品种资源
较为贫乏。
ISSR分析结果表明罗汉果的主要栽培品种青
O.89 O 95 1 5o
Sinfilarity Coefficient
图 3 75份栽培罗汉果样品间基于遗传相似性系数(Nei和 Li系数)的 UPGMA聚类图
Fig·3 UPGM A dendrogram for 75 indiViduals based OI3
. Nei& Li similarity coefficient
皮果、红毛果和爆棚籽的品种内样品间的遗传相似
性系数高,即遗传多样性很低。它们的遗传多样性
很低的现状与罗汉果的繁殖方法有关。罗汉果用种
子繁殖,其幼苗雄株占7O ,且难以鉴别雌雄,产区
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果农一般不采用。 目前普遍采用 的繁殖方法是压蔓
繁殖(钟仕强,1990),压蔓繁殖是营养繁殖方法 ,结
果使得许多植株之间没有遗传差异。来源于 4个村
(属永福县)的 5个青皮果样品之间和另 4个取 自2
个村(分属临桂县和融安县)的样品之间无遗传差
异 ,它们最终应是分别源 自同一罗汉果母株;来 自 9
个村(分属永福县和融安县)的 12个红毛果样品之
间也没有遗传差异。压蔓繁殖的结果使得主要栽培
品种青皮果、红毛果和爆棚籽的遗传多样性很低,加
速了品种的退化 。但也有少量的青皮果和红毛果植
株存在较大的遗传差异,如样品 Q3和 Q7(青皮果)
及 HI、HI2、H13和 H15(红毛果)。这些遗传差异
较大的样品往往在形态上有较大的差异 ,如 Q7的
果型较大,被果农称为大罗汉果 ,H12的果呈梨形 ,
HI3的果特别长 ,纵径可达 9 cm。这些形态上差异
较大的植株是有用 的遗传资源。
茶山果和冬瓜汉具有相对较高的遗传多样性。
茶山果是指栽培于油茶林中 ,能自然授粉的罗汉果 ,
属半野生类型 ,各地的茶山果是野生移栽 ,因此在遗
传上它们之间并没有特别的关系。果实为冬瓜型的
类型统称为冬瓜汉,我们所调查采集到的 6个冬瓜
汉样品,样品 DI、D2、D3是引 自临桂县茶洞 的野生
植株,D4是引自永福县龙江的野生植株 ,D5是引 自
贵州省黎平县 ,D6是引自贵州省三江县。从 图 2可
以看出它们之间的遗传关系与产地有关,同一地区
的关系较近,而不同地区的样品间差异明显。
雄株在产地不分品种 ,ISSR分析结果表明雄株
的平均相似性系数较低(0.877),聚类分析雄株样品
也未聚在一起,说明它们之 间存在较大的遗传多样
性 。
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