全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(2)：121— 124 2005年 3月
根癌农杆菌对苜蓿的转化及其特性
文Jl明志
(长沙大学生物技术研究所，湖南长沙 410003)
摘 要：通过胭脂碱型根癌农杆菌 C58和 T37菌株通过共培养和离体感染苜蓿下胚轴和子叶，研究表明，外
植体的生理状态对转化的促进作用明显优于酚类化合物As和复合酚类化合物处理。与感受态外植体相比，
当外植体处于非感受态时，即使通过酚类化合物活化农杆菌 基因，其致瘤率也明显降低。可溶性蛋白质
含量和游离氨基酸含分析表明，T37和C58转化细胞系可溶性蛋白含量相近，但 T37转化细胞系游离氨基酸
含量比C58转化细胞系高得多，这与 T37和 C58转化细胞系生长特性有关。T37菌株的这种特性对于改良
苜蓿品质具有非常重要的现实意义。
关键词：苜蓿；根癌农杆菌；感受态 ；酚类化合物
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)02—01 21一O4
The Ag robacterium tumefaciens。mediated trans。·
formation and characteristics 0f M edicago sativa Cn C lSlCS t
LIU Ming—zhi
(Institute of Biotechnology，Changsha University．Changsha 4 1 0003，China)
Abstract：By in vitro infecting hypocotyls and cotyledons with nopaline—type Agr06df￡Pr “7 tumefaciens strain
C58 and T37．we concluded that the promotional role of physical status of explants was obviously prior to that
of acetosyringone and complex phenolic compounds． Compared t()competent explants，non-competent explants
had an obvious lowered tumorigenic frequency，even if acetosyringone and complex phenolic compounds were
treated to activate vir gene of A．tumefaciens．The analysis of soluble protein contents and free amino acid
contents showed that T37 and C58 transformed cell line had similar soluble protein contents．but T37 trans—
formed cel1 1ine had much higher free amino acid contents than C58 transformed cel1 Iine and this was correla—
ted to their growth characteristics．The characteristic of T37 strain might be used to improve the quality of
M edicago sativa．
Key words：Medicago sativa；Agrobacterium tume
．
faciens；competence；phenolic compounds
苜蓿作为最重要的豆科牧草，在全世界范围内
种植。虽然大多数双子叶植物对农杆菌的感染和转
化敏感，但是，对于苜蓿来说，农杆菌转化苜蓿获得
成功的例子仍然有限(吕德杨等，2000；黎茵等，
2003；Shahin等，1986)，大多数情况下，是通过外源
基因直接导入原生质体实现转化的(黄绍兴等，
l991)。影响农杆菌转化苜蓿的因素目前研究得仍
然不多。本实验使用两种野生型 C58和T37转化
苜蓿材料，研究了菌株、外植体的生理状态和酚类化
合物对转化的影响。同时，通过对两种转化细胞系
与正常愈伤组织细胞系的生长特性、可溶性蛋白含
量以及游离氨基酸含量进行了分析，研究表明，T37
转化细胞系中总游离氨基酸的含量比正常细胞系和
C58转化细胞系高得多，目前还不能完全解释导致
这种差异的原因，但是 T37菌株的这种转化特性却
是可以利用的，如利用T37转化苜蓿后得到转化瘤组
收稿日期：2003—10—27 修订 日期：2004—03 22
作者简介：刘明志(1 963一)．男 ，湖南岳阳市人，博士，副教授．细胞生物学和细胞工程专业。
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织，通过诱导获得具有高游离氨基酸含量的转化植
株，家畜食用经过这种改良苜蓿后，对于提高家畜的
瘦肉率和苜蓿作为牧草的价值有非常重要的意义。
1 材料与方法
1．1供试菌种及其活化
本文使用的供试菌株为野生型根癌农杆菌
(Agrobacteriurn turnefaciens)C58和T37以及治愈
型菌株 LBA40ll，来 自于兰州大学细胞研究室。
C58和T37分别含有pTiC58和 pTiT37质粒，两者
均为胭脂碱型菌株，含有致瘤基因(oncogene)作为
选择性标记基因。LBA40ll是不含有毒性基因
(virulence gene)的菌株。
菌株活化时，从 YEB固体培养基取 l～2环菌
落接种于YEB液体培养基上，于28℃l00 rpm的
旋转振荡器上散射光培养，培养 l6～24 h，当OD值
在0．4～0．8时，可进行离体感染。为提高转化频
率，在YEB培养基中加入不同的酚类化合物处理以
活化 vir基因。处理为：(1)加入 20 umol／L乙酰丁
香酮(As)；(2)分别加入羟基苯 甲酸、焦性没食子
酸、没食子酸、香草醛及邻苯二酚各 50 p．g／L；(3)不
加任何化合物。
1．2供试植物材料
本实验所用植物材料为大叶紫花苜蓿(Medi—
cago sativa ssp．sativa)。
1．3农杆菌介导的转化
取由种子萌发至第 9天和第 2O天的子叶与下
胚轴与农杆菌共培养后，利用羧苄青霉素(Cb)杀死
农杆菌，然后在SH(Schenk等，l972)无激素培养培
养，30 d后，观察瘤组织的形成。瘤组织转移至不
含Cb的SH无激素培养基上继代培养，得到激素自
主性生长的瘤组织。在不含农杆菌的相应 YEB液
体培养基中处理的外植体在SH无激素培养上的生
长作为对照。
1．4苜蓿正常愈伤组织细胞系诱导
苜蓿无菌实生菌下胚轴切段接种于含2．0 g／L
CH+4．0 mg／L 2，4一D十1．0 mg／L KT的 SH培养
基上诱导愈伤组织，转移含 1．0 mg／L 2，4一D+0．25
mg／L KT的SH培养上继代，得到稳定的愈伤组织
细胞系。
1．5苜蓿转化细胞系与正常细胞系的生长特性测定
在一定时间间隔，苜蓿正常愈伤组织细胞系与
C58和T37转化系生长量以鲜重和干重的增加表
示。鲜重和干重的增加以终重／始重一l表示。以时
间天(d)作为横坐标，以鲜重和干重增加作为纵坐标
绘制 T37和C58转化瘤组织细胞系和正常愈伤组
织细胞系的生长曲线。
1．6可溶性蛋白质含量测定
(1)组织中的可溶性蛋白质含量测定：参照
Bradford(1976)的染料结合法。用 BSA作为标准
蛋白质。
(2)游离氨基酸含量分析：取 l g材料加入8
的磺基水杨酸在低温(4℃)研磨提取，30 000 g离
心30 min，上清液加入等体积 lO 三氯乙酸，过夜，
离心除去沉淀，上清液用 4 的磺基水杨酸稀释到
一 定浓度，用日立 835—50型氨基酸组成分析仪测定
氨基酸的组分与含量。
2 结果与分析
2．1苜蓿子叶、下胚轴外植体的离体转化
下胚轴和子叶与经活化和未经活化的致瘤农杆
菌感染处理后的致瘤率如表 l所示。
表 1 不同致瘤根癌农杆菌对萌发至第9天的
苜蓿下胚轴和子叶致瘤率的比较
Table 1 Comparison of oncogenesis of alfalfa hypocotyls
and cotyledons in 9 days after germination induced
by different strains of A r06nf￡已r “7
不经农杆菌感染的对照处理以及用治愈型菌株
LBA401l感染子叶和下胚轴外植体后，在SH无激
素培养基上，不能形成转化瘤组织，然后逐渐褐化坏
死。C58菌株为强致瘤性菌株，其致瘤率高达
97．7 ～lOO ，且与两类酚类化合物的活化预处理
没有直接的关系，即酚类化合物对转化无促进作用。
T37菌株为弱致瘤性菌株，其致瘤率要低得多，而经
酚类化合物活化处理后，其致瘤率明显升高。此外，
As和复合酚类对致瘤率没有明显差别。从上表中
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2期 刘明志：根癌农杆菌对苜蓿的转化及其特性 l23
可以看出C58菌株对萌发至第 9天的苜蓿下胚轴
和子叶的致瘤率几达 100 ，这可能与材料的生理 1
状态相关，即材料是否处于适合于转化的感受态。 主’
用强致瘤性 C58菌株感染萌发至第 2o天的苜
蓿下胚轴和子叶，结果表明农杆菌对第2o天的外植 专
体的致瘤率与第9天的外植体的致瘤率有很大不同
(表 2)。
表 2 致瘤根癌农杆菌 C58对萌发至第2O天的
苜蓿下胚轴和子叶的致瘤作用
Table 2 Oncogenesis of alfalfa hypocotyls and cotyledons
in 20 days after germination induced by C58
strain of Agrobacterium turnefaciens
下胚轴
Hypocotyls
子叶
Cotyledons
AS活化 75
复合酚活化 76
未活化处理 58
AS活化 35
复合酚活化 31
未活化处理 24
从表 2可以看出，虽然 C58为强致瘤 C58菌
株，但使用第2O天的苜蓿下胚轴和子叶外植体作为
转化的受体材料，其致瘤率要较第 9天的下胚轴和
子叶的致瘤率要低得多。经用 As和复合酚类化合
物对农杆菌活化预处理后，农杆菌对外植体的致瘤
率也没有明显提高。
图 1 苜蓿 T37和 C58转化细胞系与正常愈伤组织
细胞系在无激素培养基上的生长曲线比较
Fig．1 Comparison of growth curves between alfalfa
T37 and C58 transformed ceIl line and normal
caIlus ceIl line in hormone—free mt dium
“●一●”T37转化细胞系 T37 transformed cel line；“▲一▲”
C58转化细胞系C58 transformed cel line；“×一×”正常细胞
系Normal calus cel line；左为鲜重表示的生长曲线The left one is
the growth curve indicated by fresh weight：右为干重表示的生长曲
线 The right one is the growth curve indicated by dry weight．
2．2苜蓿转化瘤组织的激素自主性生长特性
苜蓿正常愈伤组织细胞系转移到SH无激素培
养基上后，其生长明显减弱，生长非常缓慢，15 d后
逐渐变白变褐死亡。C58激素自主性生长的瘤组织
在继代培养过程中，由绿色致密状逐渐变为淡绿色
较松散的颗粒状。T37激素自主性细胞系为浅绿
色、颗粒状、较致密，同时伴随着少量根的分化。上
述激素自主性生长瘤组织，继代培养了一年仍然保
持激素自主性生长的特性。
表3 苜蓿转化细胞系与正常愈伤组织细胞系之间游离氨基酸含量的比较
Table 3 Comparison of different free amino acid contents between
transformed cell lines and normal callus cell line of alfalfa
Thr ser GIu GIy Ala Val № Ile lJe - Tyr Phe Lys Pr0 c
正常系 22．2 7．20 17．28 59．52 9．24 17．72 l4．7 6．48 6．96 5．76 6．30 11．34 u．76 4l_64
C58转化系 44．88 5．10 l1．82 26．52 3．12 17．O4 7．86 3．90 4．86 2．64 4 l4 6．48 5．34 2．10
T37转化系 102．25 18．6 5 46．30 lO7．85 8．75 137．1O 36．45 5．35 23．35 39．80 6．00 26．70 23．95 9．00
C58和 T37转化瘤组织和愈伤组织细胞系在
无激素培养基上的生长见图 l所示。
2．3苜蓿转化细胞系的生化特性
苜蓿正常愈伤组织细胞系的可溶性蛋白含量为
0．95 mg／gFW，C58转化系和 T37转化系的可溶性
蛋白含量分别为0．70 mg／gFW 和0．76 mg／gFW。
苜蓿T37转化系的可溶性蛋白质含量高于 C58转
化系，但是，两者的可溶性蛋白质含量均低于正常愈
伤组织细胞系。
正常愈伤组织细胞系的可溶性蛋白含量以及游
离氨基酸含量随培养基的种类和激素配比以及是否
在培养基中加人复合添加物所影响。
从表 3可以看出，C58转化细胞系总游离氨基酸
含量低于正常细胞系，而T37转化细胞系总游离氨基
酸含量大大高于C58转化细胞第和正常细胞系。
此外，苜蓿T37转化细胞系除半胱氨酸含量比
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C58转细胞系低外，其它所有游离氨基酸的含量均
比C58转化细胞系高，高几倍甚至十几倍(精氨
酸)。C58和T37同为胭脂碱性菌株，其苜蓿转化细
胞系在游离氨酸酸含量上为何出现如此差异还不能
完全解释。可能的原因是因为 C58和 T37菌株的
TiT-DNA在转化细胞系中差异整合和表达相关。
3 讨论
研究证实，酚类化合物 As和复合酚物活化 vir
区基因的表达是 T—DNA 的转移和加工所需的
(Stachel等，1985；l~oIton等，1986)。许多研究证
实，酚类化合物 As和复合酚类化合物对农杆菌介
导的遗传转化具有明显的促进作用(刘明志，1996；
Godwin等，1990；M athens等，1990)。因而酚类化
合物被广泛用于促进农杆菌介导的遗传转化实验。
酚类化合物对转化的促进作用主要表现在弱致
瘤菌株 T37菌株上。T37菌株对苜蓿外植体的致
瘤率，总的来说维持在较低的水平，其致瘤率为
7．7 ～27．3 。酚类化合物 As和复合酚类化合
物活化T37菌株后，对转化频率有比较明显的提高
(32．1 ～42．9 )。另一方面，农杆菌介导的遗传
转化与菌株的寄主范围、外植体材料的生理状态以
及pH值等密切相关。当苜蓿外植体处于非感受态
时(第20天时)，即使用强致瘤性根癌农杆菌菌株
C58和经过酚类化合物活化预处理，其致瘤率仍然
较低(9．7 ～1 6 )，甚至因酚类化合物的不良影
响，其致瘤率还有所降低(表2)。因此，外植体材料
的生理状态对转化的影响明显优于酚类化合物 As
和复合酚类化合物。
第2O天的苜蓿种子无菌苗外植体处于对农杆
菌的非感受生理状态。此时外植体由代谢活跃状态
转变为非活跃状态，对受伤反应已不那么敏感，可能
不能产生足够的酚类化合物活化农杆菌。但是，加
入酚类化合物活化农杆菌后，对非感受态苜蓿外植
体的转化却没有明显促进作用。由此可见，非感受
态苜蓿外植体的致瘤率之所以低，不仅仅因为非感
受态外植体受伤后未能产生足够量的酚类化合物以
活化农杆菌vir基因和促进T—DNA转移，而且与受
伤后的非感受态外植体细胞未能进行有效的细胞分
裂和进行T—DNA的加工整合相关。
从生长特性来看，虽然 C58为强致瘤性菌株，但
其苜蓿转化系在无激素培养基上的生长远远不及
T37转化系。从游离氨基酸含量来看，T37转化系的
高生物生长量特性与其高游离氨基酸含量密切相关。
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