全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(2)：200— 203 2006年 3月
转 SOD基 因烟草中 SOD酶活力对逆境的
耐性及其遗传学特征
周 玮1一，周 波3，杨 雪1一，候思名 ，刘明求 ，刘飞虎
(1．云南大学 生命科学学院，云南 昆明 650091；2．云南大学 现代生物学研究中心 ，云南 昆明 650091；3．湖南
龙山县食品药品监督管理局 ，湖南 龙 山 416800；4．中国科学院 昆明植物研究所 ，云南 昆明 650204)
摘 要：温度、pH、酶抑制剂 H202和 KCN均对转 SOD基因烟草及其子代(s1和 F1)的SOD活性有影响。
在这些不利条件下 ，转基 因 SOD高表达烟草品系的 SOD耐性 明显优于对照品系 ，且其 S1、F1能很好地保持
亲本的这种优势 。
关键词 ：转基因烟草；SOD；耐性；遗传学特征
中图分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2006)02—0200—04
The tolerance to adversity stress and its heredity
characteristics 0f SoD activities in transgenic
tobacco lines with SOD gene
ZHOU W ei 一，ZHOU Bo。，YANG Xue ”，HOU Si—ming ，
LIU Ming—qiu ，LIU Fei—hu
(1．School of L fe Sciences，Yunnan University，Kunming 650091，China；2．Modern Biology Research Center，Yunnan
University，Kunming 650091，China；3．Longshan Food and Drug Administration of Hunan Province，，I ongshan
416800，China,4．Kunming Institute o r Botany，Chinese Academy o r Sciences，Kunming 650204，China)
Abstract：The conditions such as temperature，pH，enzymatic inhibitor Hz Oz and KCN affected SOD activities
of the leaves in near isogenic tobacco lines(including transgenlc lines with SOD gene in chloroplast and non—
transgenic line)and their S1 progenies or F1 hybrids． Under these unsuitable condition．transgenic tobacco
lines with overexpressed SOD gene showed obvious advantages in SOD tolerance over that of non—transgenic
line，and these advantages could be passed down to their S1 progenies or F1 hybrids．
Key words：transgenic tobacco；SOD；tolerance；heredity characteristics
植物在进化过程中形成了由非酶抗氧化剂和抗
氧化酶类组成的内源保护系统以免受活性氧类的伤
害。目前在植物体内已发现的抗氧化酶类有超氧化
物歧化酶 (SOD)、抗坏血酸 过氧化物酶 (APX)、谷
胱甘肽还原酶(GR)等。一般认为 SOD是植物体内
防御氧毒害的关键酶，它的活性与植物生长发育
(Rizhsky等，2003)、细胞膜系统结构和功能稳定性
(Alen等，1997)密切相关。近 年来 的研究表 明，采
用转基因技术将编码 SOD的外源基 因导入植物体
内进行表达，可以提高转基因植物的生物量(Samis
等，2002)，并增强植物本身的耐性与抗逆性(Gupta
等，1993；McKersie等，1993；Rennenberg等 ，1994；
收稿 日期：2004一l1—29 修回日期：2005—08—25
基金项目：云南省人才~ [Supported by Foundation for Excellent Scholar of Yunnan Province]。
作者简介：周玮(1977一)，女 ，湖南永顺县人 ，在读博士 ，主要从事植物生理生化、遗传育种、生物信息学研究。
*通讯作者(Author for correspondence)
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 周 玮等 ：转 SOD基因烟草中 SOD酶活力对逆境 的耐性及其遗传学特征 201
Tanaka等，1996；Van Camp等 ，1996；Van Breuseg—
em等 ，1999；McKersie等 ，2000)。但转基 因植物体
内SOD活性发生变化的同时，其本身对逆境胁迫的
耐性是否也有所改变?为此 ，本文研究 了转 SOD基
因烟草及其 后代 (S1和 F1)的 SOD酶活性对提取
后的贮存条件和处理条件的响应，以了解温度、缓冲
液 pH 及酶抑制剂等对 SOD活性稳定性的效应，探
讨转 SOD基因烟草体内SOD对逆境胁迫的耐性和
遗传学特征。
1 材料和方法
1．1材 料
转 SOD基 因烟草(Nicotiana tabacum)品系及
其近等基因对照品系(从澳洲引进)：(1)Fe—SOD叶
绿体高表达品系(Fe—SODh)；(2)Mn-S0D叶绿体高
表达品系(Mn-S0Dh)；(2)Mn—SOD mRNA逆转录
低表达品系(Mn—SOD1)；(4)非转基 因对照品系(对
照)；高表达品系(1)、(2)的自交一代(S1)及转基因
品系杂交一代 (F1)(杂交组合：(1)×(2)、(2)×
(1)、(1)× (3)、(3)× (1)、(2)× (3)、(3)× (2))
1．2 SOD的提取
SOD提取液的组成为 50 mmol／L pH7．8磷酸
缓冲液(含 0．1 mmol／L EDTA；0．3 (w／v)Triton
X一100；4 (w／v)pvp)(现代植物生理学实验指南，
1999)，反应液 的组成为 2．5 mL 50 mmol／L pH7．8
的磷酸缓冲液 +200 L 3O mmol／L dl一甲硫氨酸 +
100 L 0．003 mmol／L EDTA+100 L 1．5 retool／
L核黄素(现配)+100 L 2．25 mmol／L NBT(刘祖
祺等 ，1994)；四个生长期的 SOD活性 以开花后期为
最高(另文发表)，因此文中 以开花后期材料为样 品
进行分析 ，选取 1．0 g植株中部叶混合样 ，去掉叶脉
后 ，加入 3倍于样品量的 SOD提取液。冰浴上研磨
成匀浆，于 4℃下、以 11 424×g条件下的 BECK—
MAN J2一MI冰冻高速离心机 中离心 2O min，上清
液即为粗酶液，即时测定后置于冰箱一25℃条件下
冰冻，以备后面各种处理所需。
1．3转基因烟草品系及其 S1、F1的 SOD活性对贮
存条件和抑制因子的响应
1．3．1冰箱贮存务件的影响 SOD粗酶液分别在
冰箱一25℃条件下冰冻7 d，4℃条件下冷藏 10 h、36
h后测定酶活。
1．3．2 SOD 的热稳 定性 SOD粗 酶液分 别放 在
2O℃、3O℃、4O℃、5O℃、6O℃条件下的快速恒温数显
水浴锅 中处理 15 rain后测定酶活。
1．3．2 SOD的耐酸碱性 SOD粗酶液分别按 1体
积酶液：9体积缓冲液(缓冲液的 pH分别调至 2，4，
6，7，8，10，12)混合 ，于 3O℃水 浴锅中处理 15 rain
后测定酶活 。
1．3．4 H2O2的影响 SOD粗酶液分别与 1．562 5
mmol／L、3．125 mmol／L、6．25 mmol／L H2 02等体
积混合，于 3O℃水浴锅中处理 15 min后测定酶活。
1．3．5 KCN 的影 响 SOD粗 酶 液分 别 与 6．25
mmol／L、12．5 mmol／L的 KCN等体积混合，于 3O
℃水浴锅中处理 15 min后测定酶活。
1．4 SOD活性的测定
SOD活性用 NBT光化还原法(现代植物生理
学实验指南，1999)测定 ，在盛有 3 mL反应混合液
的试管 中，加入适量处理后的 SOD粗酶液 ，混匀后
放在试管架上 。5500光 照度下照光 15 rain后 ，取
出试管，采用 UV一755B紫外分光光度计迅速测定
OD。 。值。以不加酶液(用相同体积的缓冲液代替)
的反应液试管照光为最 大还原管 ，不 照光的作空 自
管。SOD活性计算，以能抑制 NBT光还原反应
5O 的酶量为 1个酶活单位(U)，酶活性以 U／mg
蛋白表示，按公式 SOD活性=[(OD 。 一OD。 。)／
ODmax-1／[-(5O )×3 mL反应 混合液 中加入的蛋
白质的量(rag)3计算酶活。
2 结果与讨论
2．1冰箱贮存条件的影响
不同材料在相同条件下提取的原始粗酶液活性
约在 38 U ·mg 蛋 白 (如对 照 、(Mn—SOD1×Fe—
SODh)F1)～45 U ·mg- 蛋 白(如 (Mn-SODh×Mn-
SOD1)F1)之间，其它材料间活性较接近。经过冰箱
贮存后，呈现出原始的酶活>冰冻 7 d后的酶活>
冷藏 10 h后的酶活>冷藏 36 h后的酶活的趋势
(图1)。冰冻 7 d后，大多数材料的酶活变化不大；
冷藏 10 h后，对 照、Mn—SOD【、(Mn—SODl×Fe_
SODh)F1的活性丧失最快，下降3O 左右；冷藏 36
h后，酶活只能保留原来的 3O ～5O ，并以 Mn—
SOD1品系下降最快。相对于对照品系，2个转基因
高表达品系的SOD活性在贮存过程中丧失较慢；而
Mn—SOD1品系的酶活则丧失较快；S1酶活丧失情
况接近其亲本；F1酶活丧失情况介于双亲之间。3
维普资讯 http://www.cqvip.com
202 广 西 植 物 26卷
个转基因品系明显地影响了其后代的耐性特征。对
冰箱贮存条件而言 ，转基 因高表达品系 SOD活性的
耐性更强 ，而转基因低表达品系的 SOD活性的耐性
变弱。SOD酶活测定前的贮藏环境是影响测定结
果的重要因素之一 ，冰冻对活性影 响较小但解冻费
时；冷藏方便但对酶活影响大，尤其是长时间放置。
因此应当在分离提取后 马上测定 ，尽量避免贮存条
件对 SOD活性测定造成的不利影响。
喜
兰
言
3}g专
《
口原始浓度 口 冰冻 口 冷藏10小时 ●冷藏36d、时
掣
炮
图 1 冰箱贮存对 POD活性的影响
Fig．1 Effect of different P0D activity
不同材料的原始酶活性按图中顺序依次为38．84、42．58、42．12、
41．15、42．59、40．75、43．98、42、43、38、45．25、41．63U ·mg 蛋
白。图中不同条件下的酶活丧失情况均以各自原始的SOD活
性为参照(设为 100 )。
The original activities of different materials were 38．84、42．58、
42．12、41．15、42．59、40．75、43．98、42、43、38、45．25 and 41．63
U ·mg- protein according tO the orders in figure 1。respectively．
Every activity percentage in different conditions was calculated
on the basis of its own original activity．
2．2 SOD的热稳定性
不同温度条件下酶活的总体趋势是 5O℃的酶
活<4O℃的酶活<3O℃ 的酶活<2O℃的酶 活(图
2)，酶液在 6O℃下处理 15 rain后 出现大量 肉眼可
见的沉淀。从热处理后 的酶 活丧失 的情况分 析，即
使在 2O℃下进行处理 15 rain后 SOD活性丧失都
很明显。随着处理温度的升高，酶活逐步降低。当
温度达到 5O℃ 时，对 照品 系活性最低 ，这表 明转
SOD基因烟草 品系在高温条件下 的热稳定性优 于
对照品系 ，并且这种热稳定 优势在转基 因品系的后
代中略有加强，尤其是杂交后代(F1)。
2．3 SOD的耐酸碱性
缓冲液 pH 为 4～1O时 ，SOD显示 出最高活性
(图3)，随着 pH值的上升或下降，酶活急剧降低。
酶活的最适 pH 值依次为 ：(Mn—SODh×Fe-SODh)
F1、(Fe-SODh× Mn-SOD1)F1、(Mn-S0Dl× Fe—
S0Dh)F1是 4；对照 品系 、Fe-SODh品系 S1、Mn—
S0Dh品 系 S1是 6；(Fe_SODh×Mn-SODh)F1、
(Mn-SODh x Mn-SOD1)F1是 7；Fe-SODh品系、
Mn-S0Dh品系、Mn-S0Dl品系、(Mn-SODl×Mn-
SODh)F1是 8。不 同材料 的最适 pH 不同，因此常
用的 pH7．8条件下测定 S0D活性将会导致测定结
果产生偏差。pH值为 2时，对照品系、3个转基因
亲本 品系、Fe-SODh和 Mn-SODl组合 的 F1 SOD
活性完全丧失；而 pH值 为 12时，仅 Mn-SOD1品系
的酶活为零 。从 pH2～12的处理结 果看，转 S0D
基因高表达品系及其后代的 SOD活性的耐酸碱性
更好。
芝
瞽
兰
1皿
趟 喜
)}g莒
《
口 20℃ 口 30℃ 日 40℃ ■50℃
图 2 不同温度处理后的 SOD活性变化
Fig．2 Changes of S0D activities caused
by different temperatures
口PH2 rlpH4口PH6 mpH7圈PH8 l~H10 HI2
图 3 不同 pH缓 冲液处理后的 S0D活性变化
Fig．3 Changes of SOD activities caused by
buffer solutions of different pH
2．4 SOD对 H2o2和 KCN的反应
从图 4，5可见 ，(1)抑制剂 H O 处理后 的SOD
活性损失非常严重 (图 4)，浓度达到 6．25 mmol／L
时，一部分材料的酶活性完全丧失。虽然 SOD活性
丧失严重，但仍能看出转基因品系略有优势，其后代
∞ ∞ 柚 加 0
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 周 玮等 ：转 SOD基因烟草中 SOD酶活力对逆境的耐性及其遗传学特征 203
的优势则不明显。3种 SOD同工酶类型中仅 Mn—
SOD对 H O 不敏感 ，而 Cu，Zn—SOD和 Fe—SOD均
对 H O 敏感 ，推测可能是植 物材料 的 Mn—SOD含
量较少所致 。(2)KCN 对 SOD 活性 的影 响不 如
H O 显著(图 5)。3种 SOD同工酶类型中仅 Cu，
Zn—SOD对 KCN敏感 ，因此抑制剂 KCN影 响的主
要是 Cu，Zn—SOD 的活性 。转基 因品 系对抑 制剂
KCN的耐性比对照品系强，在其后代中体现得更为
明 显 。
喜
兰
黔
!ig专
《
口 1．5625llM 口 3．125nlM 一 6．2511M
． 丌^-1． m
图 4 不同浓度 H2O2处理后的 SOD活性变化
Fig．4 Changes of SOD activities caused by
Hz Oz at different concentration
口 6 25mM — I2 5mM
图 5 不同浓度 KCN处理后的 SOD活性变化
Fig．5 Changes of S0D activities caused by
KCN at different concentration
综上所述 ，贮藏环境 、温度、缓冲液 pH 及酶抑
制剂对 SOD活性都有影响。在本文实验涉及的不
利条件下 ，转基因 SOD高表达烟草品系及其后代的
SOD活性及耐性明显优于对照品系；而转基因 SOD
低表达烟草品系相对于对照品系则不具优势。这说
明利用转基因技术导人编码(或抑制)某种类型
SOD的外源基因既可以提高(或降低)SOD表达产
物的总量 ，又能通过改变此类 SOD同工酶的含量从
而增强(或削弱)SOD本身在不利条件下的耐性，这
些改变能遗传给后代 ，并且 S1、F1较好地保持从亲
本获得的这种特性 。
参考文献 ：
中国科学院植物生理研究所 ，上海市植物生理学会．1999．现
代植物生理学实验指南[M]．上海：科学 出版社 ，314—394．
刘祖祺，张石城．1994．植物抗性生理学[M]．北京 ：中国农业
出版社 ，371—372．
Alen RD，Webb RP，Sehake SA． 1997． Use of transgenic
plants to study antioxidant defenses[J]．Free Radic Biol
Med，23(3)：473—479．
Gupta AS，Heinen JL，Holaday AS et a1．1993．Increased re—
sistance to oxidative stress in transgenic plants that overex—
press ehloroplastie Cu／Zn superoxide dismutase[J]．Proc
N“fZ Acad Sci USA，90(4)：1 629—1 633．
McKersie BD，Chen Y，de Beus M ，et a1．1993．Superoxide dis-
mutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic al-
falfa(Medicago sativa L．)[J]．Plant Physiol，103(4)：1 155
— 1 163．
McKersie BD，Murnaghan J，Jones KS，et a1． 2000．Iron-su—
peroxide dismutase expression in transgenic alfalfa increases
winter survival without a detectable increase in photosyn—
thetic oxidative stress tolerance[J]．Plant Physiol，122(4)：
1 427— 1 437．
Rennenberg H ，Polle A． 1994． Protection from oxidative
stress in transgenic plants[J]．Biochem Soc Trans，22(4)：
936——940．
Rizhsky L，Liang H，Mittler R．2003．The water-water cycle is
essential for chloroplast protection in the absence of stress
[J]．Jour Biol Chem，278(40)：38 921—38 925．
Samis K ，Bowley S，M cKersie B． 2002．Pyramiding Mn-super-
oxide dismutase transgenes to improve persistence and bio—
mass production in alfalfa[J]．Jour Exp Bot，53(372)：1 343
— 1 35O．
Tanaka K，Aono M，Saji H et a1．1996．Stress tolerance of
transgenic N icotiana tabacum with enhanced activities of
glutathione reductase and superoxide dismutase[J]．Biochem
Soc．rran5，24(2)：200．
Van Breusegem F，Slooten L，Stassart JM ，et a1．1999．Over-
production of Arabidopsis thaliana FeS0D confers oxidative
stress tolerance to transgenic maize[J]．Plant Cell Physiol，
40(5)：515—523．
Van Camp W ，Capiau K，Van Montagu M ，et a1． 1996． En-
hancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco
plants overproducing Fe-superoxide dismutase in ehloro-
plasts[J]．Plant Physiol，112(4)：1 703—1 714．
鲫 的 蚰 0
u 暑cu3Ju厶 I^ u《
一零一静 阻掣牲
维普资讯 http://www.cqvip.com