全 文 ：书广 西 植 物 Ｇｕｉｈａｉａ ３２（４）：５４２－５４７ ２０１２年 ７ 月
ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－３１４２．２０１２．０４．０２２
基于ＳＮＰ分子标记的凹叶木兰
遗传多样性初步研究
王佳媛１，吴传芳２，唐 亚１＊
（１．四川大学 建筑与环境学院，成都６１００６５；２．四川大学 生命科学学院，成都６１００６５）
摘 要：凹叶木兰是我国特有的木兰属植物，仅分布于我国四川和云南两省相邻地区，目前已被列入中国物
种红皮书名录，属易危物种。该研究以采自四川南部麻咪泽和美姑大风顶两个自然保护区的野生凹叶木兰为
材料，利用以ＰＣＲ和测序为基础的ＳＮＰ分子标记方法，初步研究了凹叶木兰的遗传多样性。结果表明：在扩
增出的４条５１０ｂｐ长的序列上，平均在７３ｂｐ左右的序列长度上能够检测到一个ＳＮＰ位点，说明两个自然保
护区内不同居群的凹叶木兰具有较高遗传多样性；序列间相似度达９７％，与引物所对原序列相似度达３６％，
表明该序列适宜进行凹叶木兰遗传多样性研究。研究结果为进一步开展凹叶木兰遗传多样性的研究及其保
护政策的制定提供了参考。
关键词：木兰属；遗传多样性；植物保护；ＰＣＲ；ＳＮＰ标记
中图分类号：Ｑ９４９．７４７．１，Ｑ１６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－３１４２（２０１２）０４－０５４２－０６
＊ Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙｓｔｕｄｙｏｎ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆ Ｍａｇｎｏｌｉａ
ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａ（Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ）ｔｈｒｏｕｇｈ ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒ
ＷＡＮＧ Ｊｉａ－Ｙｕａｎ１，ＷＵ Ｃｈｕａｎ－Ｆａｎｇ２，ＴＡＮＧ Ｙａ１＊
（１．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６５，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｃｈｕａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００６５，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａｉｓ ａ ｓｐｅｃｉｅｓ ｅｎｄｅｍｉｃ ｔｏ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｉｓ ｌｉｓｔｅｄ ｏｎ ｔｈｅ Ｒｅｄ Ｌｉｓｔ ｏｆ ｖｕｌｎｅｒａｂｌｅ ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｉｔ ｉｓ
ｏｎｌｙ ｆｏｕｎｄ ｉｎ ｌｉｍｉｔｅｄ ｌｏｃａｌｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｓｉｃｈｕａｎ ａｎｄ Ｙｕｎｎａｎ ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ．Ｕｓｉｎｇ ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｍａｍｉｚｅ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ
Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｍｅｉｇｕ Ｄａｆｅｎｇｄｉｎｇ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｓｅｒｖｅ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ｉｔｓ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉ－
ｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＳＮＰ）ｍａｒｋｅｒ，ｂａｓｅｄ ｏｎ ＰＣＲ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈ－
ｎｉｑｕｅ．Ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ（５１０ｂｐ ｌｅｎｇｔｈｓ）ｔｈａｔ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ，ａ ＳＮＰ ｌｏｃｕｓ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｏｎ ｅｖｅｒｙ ７３
ｂｐ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｎ ａｖｅｒａｇｅ，ｗｈｉｃｈ ｓｕｇｇｅｓｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ Ｍ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｎａｔｕｒｅ ｒｅｓｅｒｖｅｓ ｈａｄ
ａ ｈｉｇｈ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｏ ９７％，ａｎｄ ３６％ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉ－
ｆｉｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗａｓ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｍａｋｉｎｇ ｐｒｉｍｅｒｓ，ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｗａｓ
ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｏｆ Ｍ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｏｕｌｄ ｐｒｏｖｉｄｅ ｕｓｅｆｕｌ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｐｏｌｉｃｙ ｍａｋｉｎｇ ｏｎ Ｍ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａｏｒ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍａｇｎｏｌｉａ；ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ；ｐｌａｎｔ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ；ＰＣＲ；ＳＮＰ ｍａｒｋｅｒ
生物多样性是地球上最珍贵的资源之一，是人
类社会赖以生存和发展的基本食物、药物和工业原
料的主要来源和保护生态环境的重要基础。物种的
遗传多样性既是维持其繁殖活力和适应环境变化的
＊ 收稿日期：２０１１－１２－０１ 修回日期：２０１２－０４－１９
基金项目：高等学校学科创新引智计划（Ｂ０８０３７）［Ｓｕｐｐｏｒｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｉｎｔｅｌｅｃｔｕａｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ ｉｎ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｉｇｈｅｒ
Ｌｅａｒｎｉｎｇ（ｔｈｅ Ｐｒｏｊｅｃｔ １１１）（Ｂ０８０３７）］
作者简介：王佳媛（１９８７－），女，陕西咸阳人，在读硕士研究生，主要从事植物、森林生态等研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｗｊｙｓｕｎｎｙ＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ。
＊通讯作者：唐亚，教授，博士生导师，主要从事环境生态学和植物学研究，（Ｅ－ｍａｉｌ）ｔａｎｇｙａ＠ｓｃｕ．ｅｄｕ．ｃｎ。
基础，又是其它一切多样性的基础和核心部分
（Ｓｐｉｅｓｓ，１９８９）。天然群体高水平遗传多样性的存
在是群落稳定的基础，而物种的受威胁和灭绝是以
其遗传多样性的消失而产生的。如今，在珍稀濒危
物种的保护受到栖息地破坏与破碎化威胁的同时，
具有严格地理分布限制的特有种的保护成为生物学
家们关心的一个重要问题（Ｇｅ等，２００３）。因此，针
对这些特有种开展遗传多样性研究成为当务之急。
凹叶木兰（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａ）是木兰科（Ｍａｇ－
ｎｏｌｉａｃｅａｅ）木兰属（Ｍａｇｎｏｌｉａ）落叶乔木，其天然分布
主要集中于四川中部的峨眉山和二郎山、南部的小
凉山以及相邻的云南东北部（中国植物志编辑委员
会，１９９６），常生长于海拔１ ４００～２ ５００ｍ的阔叶林
中（补举才，１９９６），是我国特有的一种木兰科植物。
凹叶木兰有重要的药用与观赏价值；同时，由于木兰
科植物的外部形态和内部结构具有许多原始特征，
因此，凹叶木兰也是研究被子植物系统发育和起源
的珍贵材料（徐志豪等，２００３）。目前凹叶木兰自然
居群分布范围狭窄，居群数量少（罗红梅，２００７），根
据ＩＵＣＮ（国际自然与自然资源保护联合会）公布的
物种红皮书名录等级和标准，凹叶木兰被列入了中
国物种红皮书名录，属于易危物种；１９８７年该种被
列为四川省三级保护植物。
到目前为止，国内外关于凹叶木兰的研究较少，
已有的研究主要包括罗红梅（２００７）基于蜡叶标本进
行的叶片解剖结构研究、茎解剖学研究及遗传多样
性研究；王静等（２００９）在四川南部大风顶地区开展
的种群生态学、保护现状及针对性保护措施的研究。
仅有的遗传多样性研究为利用随机引物扩增进行的
ＲＡＰＤ（Ｒａｎｄｏｍｌｙ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ ＤＮＡ）分
析（罗红梅，２００７）。但 ＲＡＰＤ为显性标记，难以区
别纯合体和杂合体，有时带型不稳定，重复性差。随
着人类基因组测序工作的完成，作为第三代分子标
记技术，单核苷酸多态性（Ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙ－
ｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＮＰ）以其分布广泛、数量众多、易于批
量检测等优点显示出广阔的应用前景。目前，ＳＮＰ
标记已广泛应用于基因作图、疾病相关性分析、群体
遗传学及药物研究等领域（陈冬等，２００８），应用
ＳＮＰ标记在草本植物中的研究也在大规模的展开
（Ｒａｆａｌｓｋｉ，２００２）。近年来，ＳＮＰ研究开始应用到林
木这类重要的多年生木本植物中，并已对松（Ｐｉｎｕｓ
ｓｐｐ．）、杨 （Ｐｏｐｕｌｕｓ ｓｐｐ．）、黄 杉 （Ｐｓｅｕｄｏｔｓｕｇａ
ｓｐｐ．）、云杉（Ｐｉｃｅａｓｐｐ．）等４属７个树种的核苷酸
多样性特征进行了初步解析（褚延广等，２００８）。而
利用ＳＮＰ对凹叶木兰进行遗传多样性分析的研究
尚未见报道。本研究采用以ＰＣＲ和测序为基础的
ＳＮＰ分子标记手段，对凹叶木兰的遗传多样性进行
了初步研究，为针对该珍稀、易危植物制定保护措施
提供一些基本信息。研究过程和结果可为日后进一
步开展遗传多样性研究提供参考。
１ 材料与方法
１．１材料
研究所用的２９个凹叶木兰个体的嫩芽样品（表
１）于２００７年分别随机采自四川雷波县麻咪泽省级
自然保护区（２２个）和美姑县美姑大风顶国家级自
然保护区（７个）。样品采集后即置于有硅胶的密封
袋中保存，防止ＤＮＡ降解。引物筛选所用正对照
杨树叶片采自四川大学望江校园内。
表１ ＤＮＡ测序样品信息
Ｔａｂｌｅ １ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ
ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
样品编号
Ｎｏ．
样品
生境
Ｈａｂｉｔａｔ
采样地
Ｓａｍｐｌｉｎｇ
ｓｐｏｔ
海拔
（ｍ）
Ａｌｔｉｔｕｔｅ
经度
（°）
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
纬度
（°）
Ｌａｔｉｔｕｄｅ
１ 村庄附近 大风顶 １ ８１２ ２８．７６３４４ １０３．１７３９４
２ 人工林 麻咪泽 ２ １５２ ２８．４１７３８ １０３．３１７３１
３ 原始森林 麻咪泽 ２ １９１ ２８．４４６６４ １０３．３１５８０
４ 放牧地 麻咪泽 ２ ２６９ ２８．４３７２７ １０３．３２５６９
１．２方法
１．２．１基因组ＤＮＡ提取 基因组ＤＮＡ采用大连
宝生（ＴａＫａＲａ）公司的 Ｇｅｎｏｍｅ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＤＮＡ提
取试剂盒分批提取。对所提取的基因组 ＤＮＡ 标
号，贮存于－２０℃冰箱中备用。
１．２．２引物获取与筛选 美国加州大学戴维斯分校
（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓ）的 Ｍｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｌｕｏ
实验室从ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）的毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒ－
ｐａ）ｕｎｉＧｅｎｅ数据库中下载了毛果杨的单基因序列，
并将其与拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ）基因序列
对比，发现其中一段共有序列。由于毛果杨（杨柳
科）与拟南芥（十字花科）为系统位置跨度很大的两
种植物，该段序列共有的现象说明了此段序列具有
高度的保守性，故推断在凹叶木兰的基因序列中也应
存在该段序列。据此，Ｍｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｌｕｏ实验室为我们
的这一研究设计出２２５对引物。在本研究中，我们随
３４５４期 王佳媛等：基于ＳＮＰ分子标记的凹叶木兰遗传多样性初步研究
机选取了１０对引物（表２），并从已提取的凹叶木兰
样品基因组中随机选择一个作为模板、以杨树模板
为正对照，对１０对引物进行复选，最终选定了条带
清晰、无杂带的３５６号引物（图１）用于本实验。
２０μＬ引物筛选ＰＣＲ扩增体系为：１０×ＰＣＲ缓
冲液２μＬ（ＴＩＡＮＧＥＮ公司），模板基因组 ＤＮＡ ２
μＬ，ｄＮＴＰｓ ０．２μＬ，ＭｇＣｌ２１．２μＬ（ＴＩＡＮＧＥＮ公
司），双向引物各０．２μＬ，Ｔａｑ酶０．２μＬ（ＴＩＡＮ－
ＧＥＮ公司），ｄｄＨ２Ｏ １４μＬ。ＰＣＲ反应在 ＡＬＳ１２９６
ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）上完成。扩增条件：９４℃预变性
４ｍｉｎ；９４℃变性１５ｓ，５０℃退火１５ｓ，７２℃延伸４５
ｓ，循环４０次。
表２ １０对引物编号及其序列
Ｔａｂｌｅ ２ Ｓｅｒｉａｌ ｎｕｍｂｅｒ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｅｎ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ
引物编号Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ． 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ 引物编号Ｐｒｉｍｅｒ Ｎｏ． 序列Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
１－１ ＡＴＣＡＡＴＧＡＣＴＣＧＣＣＴＧＣＴＣＴ ３５６－１ ＣＴＧＣＧＡＡＣＡＡＴＧＡＧＡＧＧＴＧＡ
１－２ ＧＣＡＧＡＴＣＴＧＡＣＡＣＣＴＧＧＡＧ ３５６－２ ＴＣＣＣＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＴＧＧＡＡＧ
１０８－１ ＡＧＧＴＴＧＡＴＧＣＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣ ３６７－１ ＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＴＴＴＧＴＣＡＴＣＡ
１０８－２ ＧＡＡＣＴＴＡＧＧＣＧＣＴＴＣＡＴＴＣＧ ３６７－２ ＡＡＡＴＧＡＡＴＣＧＣＴＴＣＣＣＴＧＴＧ
２７０－１ ＴＣＡＡＣＡＡＧＴＴＣＡＧＧＣＧＡＣＡＧ ４５３－１ ＣＡＡＧＡＡＣＣＡＡＡＣＴＴＧＧＧＣＡＴ
２７０－２ ＣＴＣＣＧＡＡＴＣＴＣＡＣＣＣＧＡＴＴＡ ４５３－２ ＡＧＧＴＧＧＴＣＴＣＡＡＴＴＴＣＡＣＧＧ
２８６－１ ＣＴＴＧＴＧＡＡＧＣＧＴＧＴＣＣＴＣＡＡ ４６６－１ ＡＧＧＣＧＡＣＡＧＣＣＡＧＡＡＴＴＡＧＡ
２８６－２ ＧＴＣＡＧＴＣＴＧＣＣＧＡＣＴＡＡＧＧＣ ４６６－２ ＣＣＧＴＧＡＡＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＧＧＣ
３１８－１ ＴＧＣＴＧＡＧＧＡＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＴ ５５２－１ ＡＧＣＣＴＧＧＧＡＡＣＣＴＴＣＴＣＡＴＴ
３１８－２ ＣＣＧＣＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＡＣＧＡＴ ５５２－２ ＧＡＴＣＡＡＴＴＧＧＧＡＣＣＴＧＴＧＣＴ
图１ 引物筛选结果
Ｆｉｇ．１ Ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ
下排和上排第二条条带为以凹叶木兰为模板进行ＰＣＲ的扩增
结果；上排其余条带为正对照，即以杨树因组ＤＮＡ为模板进行
ＰＣＲ的扩增结果，引物顺序同凹叶木兰。
Ｌｏｗｅｒ ｓｔｒｉｐｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｅｃｏｎｄ ｏｎｅ（ｏｎ ｔｈｅ ｌｅｆｔ）ｏｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｒｏｗ ａｒｅ
ｔｈｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｔ ｕｓｅｄ Ｍ．ｓａｒｇｅｎｔｉａｎａａｓ ｔｅｍｐｌｅｔｅ；ｔｈｅ ｏｔｈｅｒ ｏｎｅｓ
ｏｎ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｒ ｒｏｗ ａｒｅ ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｔ ｕｓｅｄ Ｐｏｐｕｌｕｓｓｐ．ａｓ ｔｅｍｐｌｅｔｅ．
Ｐｒｉｍｅｒ ｏｒｄｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｔｗｏ ｓｅｔ ｏｆ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ．
１．２．３ＰＣＲ扩增及目的片段回收 引物选定后，以
所提取的凹叶木兰基因组ＤＮＡ为模板，用选定的
３５６号引物进行目的片段扩增。由于要对所扩增的
目的片段进行测序，为避免Ｔａｑ酶引起的碱基突变
而造成测序结果不准确，本实验选用体积比为４∶１
的Ｔａｑ酶与Ｐｆｕ高保真酶混合酶。４０μＬ ＰＣＲ反
应体系包括：１０×ＰＣＲ缓冲液４μＬ（ＴＩＡＮＧＥＮ公
司），基因组 ＤＮＡ 模板 ４μＬ，ｄＮＴＰｓ ０．４μＬ，
ＭｇＣｌ２２．４μＬ（ＴＩＡＮＧＥＮ公司），双向引物各０．４
μＬ，Ｔａｑ酶混Ｐｆｕ酶０．４μＬ（ＴＩＡＮＧＥＮ公司），ｄｄ
Ｈ２Ｏ ２８μＬ。ＰＣＲ反应在 ＡＬＳ１２９６ＰＣＲ仪（Ｂｉｏ－
Ｒａｄ）上完成。扩增条件：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃
变性１５ｓ，５０℃１５ｓ，７２℃延伸６０ｓ，循环４０次。
ＰＣＲ扩增后，采用Ｏｍｅｇａ胶回收试剂盒对目的片段
进行回收，进而进行之后的连接、转化等步骤；对暂时
不用回收的产物进行编号并贮存于－２０℃冰箱。
１．２．４连接、转化与测序 由于本实验中的ＰＣＲ产
物浓度达不到直接测序的要求，故采用传统的连接、
转化、涂板、检测、再测序的方法。具体过程为：将回
收的目的片段连接到ＰＭＤ １９－Ｔ载体中（连接体系
见表３），再将连接了目的片段的载体转入感受态细
胞内，置于 ＳＯＣ（Ｓｕｐｅｒ Ｏｐｔｉｍａｌ ｂｒｏｔｈ ｗｉｔｈ Ｃａｔａ－
ｂｏｌｉｃ ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）培养基中摇床培养１ｈ；将菌液均匀
地涂在加入氨苄（Ａｍｐ）的ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ ｂｒｏｔｈ）固
体培养基上，于３７℃条件下培养１２ｈ；对生长状况
良好的单菌落进行挑菌，最后进行菌落ＰＣＲ检测，
程序同２０μＬ ＰＣＲ反应体系，模板为枪头挑取的微
量菌体，ｄｄＨ２Ｏ的加入量为１６μＬ，其余成分不变。
选择菌落检测为阳性的菌液送北京三博远志生物技
术有限责任公司测序。
１．２．５分析方法 测序结果利用ＮＣＢＩ数据库中在
４４５ 广 西 植 物 ３２卷
线序列比对软件 ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ
Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）以及 ＥＢＩ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）网页中在线序列比对软件Ｃｌｕｓｔａｌｗ ２进
行样本序列与引物所对毛果杨序列的同源性比对以
及样本序列间相似性比对，找出ＳＮＰ位点。利用
ＤｎａＳＰ软件计算样本核苷酸多样性指数π，该指数
越高则遗传多样性越高。
表３ １０μＬ连接体系
Ｔａｂｌｅ ３ Ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（１０μＬ）
成分
Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ
加入量
Ａｍｏｕｎｔ（μＬ）
终浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ＤＮＡ片段 ５．０ ４．０ｇ／Ｌ左右
１０×Ｂｕｆｆｅｒ １．０ １０．０ｍｏｌ／Ｌ
ＰＭＤ１９－Ｔ载体 ０．２ ５０．０ｇ／Ｌ
Ｔ４连接酶 ０．２ ０．２Ｕ
ｄｄＨ２Ｏ ２．８ －
２ 结果与分析
２．１测序结果与毛果杨相似性比对
对２９个样本进行测序，最终得到４条有效序列
（表１）。表１测序结果显示，所测片段长度均为５１２
ｂｐ，与实验中根据毛果杨序列所设计的引物所对原
始片段长度（５１０ｂｐ）相符。ＢＬＡＳＴ软件进行相似
比对结果显示，本实验所得凹叶木兰序列的确与毛
果杨序列相似，相似区域达３６％。利用Ｃｌｕｓｔａｌｗ ２
在线比对软件，将引物所对毛果杨序列片段与测序
序列一一进行比对，相似度分别为３０％、２９％、３０％
和２９％（表４）。４个样品的序列与毛果杨序列的相
似性一致。
表４ 相似度比对
Ｔａｂｌｅ ４ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
样品编号
Ｓａｍｐｌｅ Ｎｏ．
与毛果杨相似度
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ（％）
与１号样比较
Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｗｉｔｈ ｓａｍｐｌｅ １
ＳＮＰ位点数
ＳＮＰ Ｎｏ．
相似度 （％）
Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ
１ ３０ — —
２ ２９ １１ ９７．８５
３ ３０ ５ ９９．０２
４ ２９ ７ ９９．０２
２．２ＳＮＰ位点检测
运用Ｃｌｕｓｔａｌｗ ２在线比对软件，对测序结果进
行样本间纵向比较。结果显示（表４），样本间同源
性很高，相似度均在９７％以上。１号样本与２、３、４
号样本间的ＳＮＰ位点分别为：１１个、５个和７个，即
在５１２ｂｐ长度的序列上，ＳＮＰ位点平均至少达７
个，即平均每７３ｂｐ长度的片段上就存在一个ＳＮＰ
位点。利用ＤｎａＳＰ软件计算得出凹叶木兰样本核
苷酸多样性指数π为０．０１７８。
３ 结论与讨论
３．１对异常数据的讨论
对２９个样本的测序结果进行处理后发现，除４
个序列结果正常外，其余序列均为未插入目的片段
的空载体序列。未插入目的片段的可能原因是在涂
板过程中有部分没有连接入载体的目的片段残留在
平板上，这些片段粘在细菌表面随细菌一起培养，而
在挑单克隆进行菌落ＰＣＲ时，因模板中含有这些片
段，因此出现了ＰＣＲ假阳性的结果。为避免以上情
况出现，在测序之前除进行菌落ＰＣＲ检测外，还应
对菌液提质粒，以质粒为模板再进行ＰＣＲ，同时对
所提质粒进行酶切检测。本实验由于时间限制，只
进行了菌落ＰＣＲ检测，实验结果有局限性。但仅有
的４个数据仍在一定程度上反应出凹叶木兰遗传多
样性水平。
３．２利用ＳＮＰ进行凹叶木兰遗传多样性研究的可行性
由于ＮＣＢＩ数据库中木兰科植物的数据非常
少，在将得到的序列放在 ＮＣＢＩ上进行同源性比对
时，仅找到３条毛果杨的序列与所得的序列相近，同
源性均为３６％。这一方面验证了所扩增序列的正
确性，另一方面说明该段序列在植物进化中较为保
守，在杨树、拟南芥和凹叶木兰中都存在同源的部
分，但在保守的同时又存在差异，说明了该段序列在
不同的植物进化中又有一定的变异。因此，在日后
开展凹叶木兰遗传多样性的研究时，仍可采用该段
序列。
３．３凹叶木兰的遗传多样性及其地理原因
本研究运用在ＰＣＲ和测序基础上的ＳＮＰ分子
标记技术对凹叶木兰的遗传多样性进行了初步分
析。在５１２ｂｐ长度的序列上，ＳＮＰ位点平均达７个
以上，即平均每７３ｂｐ长度的片段上就存在一个
ＳＮＰ位点，核苷酸多样性指数π约为０．０１７８。Ｔｅ－
ｎａｉｌｏｎ等（２００１）对玉米１号染色体的２１个位点进
行研究，发现平均１０４ｂｐ中有一个ＳＮＰ，核苷酸多
样性指数π为０．００６３～０．００９６；对毛果杨（Ｐ．ｔｒｉｃｈ－
ｏｃａｒｐａ）基因组序列的分析共发现１ ２４１ ２５１个ＳＮＰ
位点（包括插入和缺失），平均约每１ｋｂ ＤＮＡ存在
５４５４期 王佳媛等：基于ＳＮＰ分子标记的凹叶木兰遗传多样性初步研究
２．６个ＳＮＰ，核苷酸多样性指数π为０．０１６（Ｔｕｓｋａｎ
等，２００６）；拟南芥（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）核苷酸多样性指数
π为０．００７（Ｎｏｒｄｂｏｒｇ等，２００５）；水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉ－
ｖａ）核苷酸多样性指数π为０．００３５（Ｃａｉｃｅｄｏ等，
２００７）；挪威云杉（Ｐｉｃｅａ ａｂｉｅｓ）核苷酸多样性指数π
为０．００３９９（Ｈｅｕｅｒｔｚ等，２００６）。综上所述认为凹叶
木兰样品具有较高的遗传多样性。
凹叶木兰自然分布范围狭窄、居群数量少。基
于植物同工酶的研究，Ｋａｒｒｏｎ（１９９１）提出，受地理
条件限制的特有植物通常由于基因漂移与受限的基
因流而具有较低的遗传多样性，以此推论，凹叶木兰
的遗传多样性应该较低。但本研究的结果揭示出凹
叶木兰较高的遗传多样性，与Ｋａｒｒｏｎ（１９９１）的结论
不同，这部分说明居群分布范围不能直接体现凹叶
木兰遗传多样性的高低，同时也说明基于同工酶研
究的结论并不一定具有普遍意义。
罗红梅（２００７）运用 ＲＡＰＤ对凹叶木兰进行的
遗传多样性研究结果也揭示出该物种具有较高的遗
传多样性，本研究支持了这种结果。罗红梅（２００７）
研究结果还表明，凹叶木兰个体间的遗传距离与这
些个体所属居群间的地理分布间隔呈正相关，即两
居群间隔距离越大，遗传差异越大。
与凹叶木兰类似，不少乔木树种都具有种群分
布极为有限但遗传多样性较高的特征（Ｂａｒｔｉｓｈ等，
１９９９）。根据Ｍａｇｕｉｒｅ等（１９９７）的研究，对于具有高
遗传多样性、低种群数量特征的稀有植物，形成该特
征具有一系列可能因素：（１）在某些特殊情况下，种群
数量明显下降，而其遗传多样性没有经过足够长时间
降低至与自然状态下具有该数量大小的种群所应具
有的遗传多样性高低相符的状态；（２）基因系统对于
小种群条件的适应；（３）曾经连续的基因系统受到破
坏，如人类干扰；（４）鸟类传粉与高异交率结合而形成
的较高基因流。若基因流是相邻种群遗传结构的首
要因素，通常地理位置相近的种群间的遗传相似性比
地理位置间隔远的种群间高（Ｇｅ等，２００３）。结合罗
红梅（２００７）和本研究结果，我们推测，基因流是决定
凹叶木兰种群遗传结构的主要因素。
大量同工酶研究以及日益剧增的叶绿体ＤＮＡ
（ｃｐＤＮＡ）与线粒体ＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）研究结果表明，
受到“避难所”保护的植物类群其后代通常具有较高
的遗传多样性（Ｌｅｗｉｓ等，１９９５）。据考证，中生代白
垩纪地质运动使得四川盆地四周隆起，大、小凉山即
在此时形成，环境的变迁促使古生物物种得以繁荣
发展（刘金波等，２００６）。本研究样品采样地雷波麻
咪泽自然保护区，位于四川盆地西南边缘，凉山山系
主峰黄毛埂东坡，金沙江下游北岸，紧邻另一采样地
美姑大风顶国家自然保护区。两区地处小凉山，属
亚热带湿润气候类型。由于所属地理位置的特殊
性，采样地区以及周边广大区域成为第三纪或更古
老生物的“避难所”和各种生物分化的摇篮（刘金波
等，２００６；宋昭彬等，２００４）。这种特殊的地理和气候
条件很可能是采样地区的凹叶木兰种群具有较高遗
传多样性的主要原因。
３．４凹叶木兰保护建议
王静等（２００９）在四川南部嘛咪泽和大风顶地区
的调查结果显示，野生凹叶木兰居群分散且自然更
新状况差的主要原因是不适宜的生长环境与人为砍
伐、采集花芽及树皮。本研究结果表明，凹叶木兰具
有较高的遗传多样性，因此，目前遗传多样性并不是
限制凹叶木兰生长的首要条件。但随着野生凹叶木
兰生境因人为干扰造成破碎化程度的加剧，以基因
流作为主要控制因素的居群间的遗传结构，很可能
因地理位置的增大而产生较大差异，最终形成生殖
屏障而阻断居群间的基因交流而导致遗传多样性下
降。因此，原始生境保护、禁止人为砍伐是对凹叶木
兰进行原地保护的首要任务。由于凹叶木兰不同居
群间的遗传差异较大，因此在进行迁地保护时应注
意尽可能多地从凹叶木兰的不同生长区引种，从而
最大限度地保持其遗传多样性。
致谢 本研究所用样品由四川大学建筑与环境
学院博士生王静、张立芸、乔雪和硕士李晶、张松等
采集；美国加州大学戴维斯分校（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉ－
ｆｏｒｎｉａ，Ｄａｖｉｓ，ＵＳＡ）Ｍｉｎｇｃｈｅｎｇ Ｌｕｏ博士为本研究
提供引物资料并在实验过程中给予宝贵建议；四川
大学建筑与环境学院高辉副教授、生命科学学院赵
梓亦博士在实验过程中给予帮助。
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櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢櫢
９－１２
（上接第５３５页Ｃｏｎｔｉｎｕｅ ｆｒｏｍ ｐａｇｅ ５３５）
ｇｒｏｗｔｈ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ ａｎｄ ｓｉｌｖｅｒ ｎｉｔｒａｔｅ ｆｏｒ ｍｉｃｒｏｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｉ－
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２００３．Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｕｓ ａｎｄ ｐｌａｎｔｌｅｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｄｉａｎ－
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