全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(4)：339— 342 2003年 7月
基因枪介导甘蔗遗传转化几个影响 因素的研 究
秦新 民，叶 云，于 兰
(广 西师范大学生命科学学院 ，广西桂林 541004)
摘 要 ：用基因枪 GJ1000介导将 Bt基 因转入甘蔗嫩叶 、I型愈 伤组织 和 Ⅱ型愈 伤组织 。结 果表明 ，用 Ⅱ型
愈伤组织作为受体最用利于转化；气体压力、轰击距离 、轰击次数和真空度对转化效率有不同程度的影响。条
件优化后 ，得到了大量的抗性 愈伤组 织和一些抗性植株 ，转化率分别 为 34．9 和 3．36 。
关键词 ：甘蔗 ；基 因枪 ；遗传转化 ；抗性植株
中图分类号 ：Q943 文献标识 码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2003)04—0339—04
Factors affecting microprojectile bombardmentl-
mediated transformation 0f sugarcane
( acch 厂 7 D [el rum ／一 一 ，●，．● ● ＼
QIN Xin—min，YE Yun，YU Lan
(College of Li Science，Guangxi Normal University，Guilin 54 1004，China)
Abstract：Tender leaves，I—type calli andⅡ一type calli were transformed with Bt gene by MicroprojectiIe bom—
bardment GJ 1000．The results showed that U—type calli aS receptor was propitious to transformation．The ef—
ficiency of transformation was varied with gaS pressure，distance of bombardme- t，time of bombardment and
degree of vacuum．After optimizing these factors，a large number of resistant calli and some resistant plantlets
were obtained．The efficiency of transformation are 34．9 and 3．36 respectively．
Key words：sugarcane；microproject le bombardment；genetic transformation；resistant plantlet
基因枪转化技术是由二十世纪 8O年代末逐渐
发展起来的一种基 因转 化 的方法 ，它 的最 大优点 是
无明显的宿主限制，几乎适用于任何受体材料 ，另外
它 只需要简单的组织 培养 ，不必 经过 复杂 的原生 质
体的制备和培养阶段 ，为植物 基 因转 化工作 提供 了
一 种更为简化的手段 。对于对农杆 菌不敏感的单子
叶植物来说 ，基因枪技术更为一种理想的转化方法，
人们 利用 该 方 法 已经 获 得 了 水 稻、小 麦、玉 米
(Christou等 ，l99l；Vaisil等 ，l999；Wan等 ，l995)
等转基因植株。在甘蔗的遗传转化研究方面，美国
的 Maretzki等(1990)首次用基因枪把 GUS基因导
入甘蔗愈伤组织 ，并得到 r瞬时表达。澳大利亚的
Bower等(1992)用基 因枪法把由 Emu启动子调控
下 的 GUS基 因导 入 到甘 蔗 的胚 性 愈 伤组织 中，l6
周后获得 了转 基因植株 。国内这方 面的研究则 相对
较少 ，目前获得转基 因植株 的报道仅见 一例 (张树珍
等 ，2001)。然 而在 上述报道 中其基 因转化效率都 比
较低 ，如何将微弹对轰击的植物材料的损伤降至最
小，同时使受体能有效分化是提高基 因枪转化效率
的关键所在。因此，对基因枪转化的参数条件进行
优化，对建立高效的甘蔗的遗传转化体系有较大的
意义。本文对受体材料、轰击距离、轰击次数、气体
收稿 日期 ：2002一l2—02 修订 日期 ；2003—02—2O
基金项 目；广西 自然科 学基金 资助 项 目(20007007)
作者简介：秦新民(1956一)，男，广西灵川人，博士 ，研究员 ，从事植物分子生物学研究。
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340 23卷
压力和真空度这几个影响转化率的关键因素进行了
比较 ，试图建立⋯个 合适 的甘 蔗基 因枪 高效 转化 系
统 。
1 材料与方法
1．1菌种与质粒
菌种为 DH5 ，质粒为 pBIWIQ一5，其上含 NPT
丌基 因和 由 Mas一35S双启 动子 调控 的 Bt(Cry I B)
抗虫基因(秦新 民等 ，l 999)。
1．2轰击受体的选择
以台糖 22为材料 ，于 田问取其 生长健壮 的尾梢
部分 ，在无菌状态下将一l、一2片 叶 ，剪 成 l ClTI×l CITI
大小的片段 ，置于 M1(MS十1． rag／I 2，4-D十3O
g／L蔗糖 +7 g／L琼脂 粉 ，pH5．8)培养基 上 ，26℃
黑暗条件 下诱 导愈伤 组织 ，2周后 叶 片上长 满了致
密的 白色愈伤组织 (I型 愈伤 组织 )，将其 转移 到新
的诱导培养基 M．上继 代培养 ，20 d左 右发育 成 淡
黄色 、松脆的胚性愈伤组织 (1I型愈伤组织)。
1．3抗生素敏感性实验
选取新 鲜的一l、一2片叶和继 代培 养 20 d的胚性
愈伤组织 ，接种于含 不同卡 那霉 素 (Kin)浓度 的 M
培养基中进 行 卡那霉 素 抗性 测 定 。卡 那霉 素 设 5、
l0、20、30、40、50、100、200、300 mg／L 9种 浓 度 梯
度 ，并 以不含卡那霉 素 的培养 基作 为对 照 ，共 1O种
处理 ，培养 1个月后观察其生 长情况 。
1．4质粒 DNA的提 取
按碱裂解法 (金冬雁 等 ，l 992)大 量提取质粒 ．将
质粒 DNA浓度调 至 l ug／t~L，置于一2O。C下贮 存备
用 。
1．5基因枪轰击
无菌状态 下 制 备 钨 粉 的甘 油 溶 液 ，浓 度 为 6O
mg／mL。每次轰击前 取 5O L悬 浮液 ，依 次加入 5
L质粒 DNA(1 ug／uL)，0．1 M 亚 精胺 2O L和
2．5 M CaC1 50 L，旋涡振荡 l rain。离心去上清 ，
分别用 l O L 7O 酒精和 l5O L无水酒精洗涤 1
次；加入 6O L无水酒精，每次轰击取 l0 L悬浮
液。
设置真空度一0．09 MP、一0．095 MP；轰击距离
4． ClTI、 ．5 CITI；气体压力 7 MP、8 MP；轰击次数为
l、2、3次 ；以嫩 叶 、T型 愈伤 组 织 、n型愈 伤组 织 3
利t材料作为受 体 ，进行 不 同组 合 的轰击 。其 中以嫩
叶作为受体材料的轰 击压力均 为 9 MP。
1．6恢 复培 养
将轰击后 的材 料转 入 愈伤 组织诱 导培养基
M ，在 26℃ 、光 照和黑 暗两种不同条件下培养 l～2
周 ，培养基 中不加卡那霉素 等选择 压力 ，以利于受轰
击愈伤组织 的恢复及充 分表达外源基 因。
1．7抗性筛选
1．7．1预 筛选 将基 因枪轰击后 的愈伤 组织转入不
含 Km 的愈伤组织 诱导培养基 M1培养 l～2周 ，让
其充分分化 出新 的胚 状体 ，然后转 入 含 Km 的愈伤
组织诱导培养基 中。
1．7．2成 苗 筛选 约半 个月后 将生长 良好 的愈伤组
织转入成茁培养基 M2(MS+Km 10 mg／I +30 g／[
蔗糖 +7 g／L琼 脂粉 ，pH5．8)进 行抗 性筛选 ，并设
对照 。26℃ ，每 天光 照 16 h，光 强 1 500 lx进行 选
择培养 。
1．7．3生根 筛选 待 M 培养 基上分 化 的绿 芽长到
2 CITI左 右 时 ，将 其 转 入 含 Km 的 生 根 培 养 基 M
(MS+Km 10 mg／L+NAA l mg／L+30 g／L蔗糖
÷7 g／L琼脂粉 ，pH5．8)，于 26。C，每天光 照 l6 h，
光强 l 500 lx进行生根筛选 。
2 结果及分析
2．1抗生素浓度 的确定
接种在 2O、30、40、50、100、200、300 rag／L Km
的 M 培养基 中的甘蔗叶 』 和胚性愈伤组织都逐渐
褐化变黑死 亡 ；在 10 mg／I Km 的 M 上胚性 愈伤
组织则 能分 化 出少 量 白化 苗 ；而在 5 mg／L Km 中
的胚 性愈伤 组织除 了分化 出白化苗之外还有少量绿
苗 ，同时叶片也能分化 出少量愈伤组织 ；对照 中长出
的则全部都是绿苗。由此确定 10 mg／L的卡那霉
素 浓度作 为抗性筛选 的浓度 。
2．2抗性植株 的获得 ’
成苗筛选 15～20 d后 ，抗性胚 性愈伤组织上 开
始分化出芽，未转化的愈伤组织逐渐变褐死亡，呈水
渍状坏死或只分化 出白化苗，用未带载体 (未包埋
DNA)的微弹轰击的愈伤组织也逐渐褐化死亡。只
有部分有质粒 DNA轰击的愈伤组织能继续发育成
胚状体，并能进一步发育成绿色的幼苗。而生根培
养是更严格的筛选，只f 部分绿苗能分化出不定根 ，
而其他的则逐渐坏死。
2．3受体 材料对转化的影 响
嫩I1l 、T型和 1I型愈伤组织轰击 后 ，转 入 M 培
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4期 秦新民等：基因枪介导甘蔗遗传转化几个影响因素的研究 !!
养基上培养 10 d左右，再转人 Mz培养基 中筛选 。
嫩 叶作 为轰击受体 只获 得 了极少 的抗性 植株 ，而且
在生根 培养 的时候 很难 形成有效 f19g4．~．。而用 I型
愈伤组织 和 I型愈 伤组织作为受体进行 轰击则 获得
了较多的抗性植株 ，其 中 Ⅱ型愈伤组织的效果明显
优于 I型愈伤组织。以愈伤组织为受体的轰击，参
数均 为真空度 0．095 MP、轰击距离 5．5 cm、气体压
力 7 MP，轰击 2次 ，以此作为 比较 (表 1)。
表 l 受体材料对转化效率的影响
Table l Effect of receptor material on transformation
受体类型 TyI】e。f recept。r 嫩 叶 Fcnder 1eaves I型愈伤组织 I—type caIu s I型愈伤组 5 I tyt e callus
外植体数 Number of explants
抗一 愈{)j组i 【数 Number of resistant callus
愈伤组织转化率 Transformation efficiency( )
抗性植株数 Number of resistant plantlets
抗性植株转化 率 T ransformation efficiency( )
表 2 轰击条件对转化的影响
Table 2 Effect of bombardment on transformation
处 理 Treatment
轰击距离 Distance(cm) 4 5 5．5 4．5 5．5 4．5
轰击次数 Time 1 1 2 2 2
真空度 Degree of vacuum (MP) 一0．09 0．095 —0．095 —0．095 —0．09
气体压力 Gas pressu re(MP) 9 9 7 7 8
外植体数 Numbers of cxplants 102 104 132 1 49 164
抗性愈伤纽数 Number of resistant callu s 25 22 36 5 2 43
愈伤 l转化 簪Transformation eficiency( ) 24．51 21．1 5 27．2 7 34．90 26．22
抗性植株数 Number of resistant plantlets 1 1 4 5 3
抗性!植株转化 牢 Transformation efficiency( ) 0．98 0．96 3．03 3．36 1．83
2．4轰击条件对转化的影响
以 兀型愈伤组 织为材料 ，进 行不同的真空度 、气
体压力、轰击距离和轰击次数的比较 ，结果在各种组
合中，真空度一0．095 MP、轰击距离 5．5 cI1、气体压
力 7 MP，轰 击 2次所获得 的抗 性愈伤组织和抗性植
株都 是最 多的(表 2)。
讨 论
植 物受体 在遗传转 化 中起重 要 的作 用 ，在基 因
枪法介导的遗传转化中靶受体类型广泛，任何具有
潜在分生能力的组织或细胞都可以用基因枪进行轰
击转化 。 目前 ，单子叶植物 的基 因转化 以幼胚(徐子
勤，2001)和原生质 体 (Malhotra等 ，1994)作为受 体
的情况较多 。然而 ，在一 般 种植 条件 下甘 蔗很少 有
开花的现象 ，即使开花结实其种子很小 ，利用幼胚作
为受体材料操作 相对 困难 。虽然 原生质体是转化过
程 中外源 DNA 的理 想受 体 ，但 甘 蔗 的原 生质 体 培
养非常困难。而其组织培养技术已经比较成熟 ，所
以胚 性愈 伤组 织是 甘 蔗较 为 理 想 的轰 击 受体。
— — — —’ 。‘ —— —— 。。 ’。 。‘ ●’ 。。 -_ ● -- ● _。 _— —
]Robert等(1992)用愈伤组织作为轰击受体获得了
高效 转化 的转 基 因植 株 。本 研究 以嫩 叶 、I型愈伤
组织和 II型愈伤组织为受体进行转化，均获得了抗
性愈伤组织和抗性植株。其 中以 II型愈伤组织为
受体进行的转化 ，抗性 愈 伤 组织 获得 率达 34．9 ，
抗性植株获得 率 可达 3．36 。本 研究 还试 图用 幼
嫩叶片作为受体以缩短实验周期，但转化效率并不
是很理想，仅获得了一棵抗性植株，其转化条件还待
进一步研究 。
微弹轰击的速度是影响转化效率的又一重要因
素，而决定微弹速度的关键是气体压力和真空度。
气体压力越 大 ，微 弹 获得 的推 动 力越 大 ；真 空度 越
高，微弹飞行所受的阻力越小，速度就越大。由于微
弹会 对细胞 产生一定 程度 的伤 害 ，速度 过大会加 剧
这一影 响 ；另外 ，细胞在真空状态下也会受到一定 的
伤害，因而通过调整气体压力和真空度来获得合适
的速度是非常必要的。对受体进行多次轰击 ，增加
了获得外源基因的机会 ，但细胞所受到的伤害也会
变大。本研究表明 2次轰击对转化较为有利。
另外 ，轰击前对受体材料进行渗透处理 4 h，轰
(J ) J
。 。
％
L
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342 广 西 植 物 23卷
击后 再处理 24 h可 以提高 转 化效 率 。可能 是 由于
高渗处理使 细胞 质壁 分离 ，从 而 减轻轰 击 时钨粉 对
细胞的伤害 (徐 子勤 ，2001)。
参考文献 ：
金冬雁，黎孟枫．1992．分 子克隆实验指南 (第 2版)[M]．
北 京 ：科学 出版社 ，26—27．
Bower R．Birch R G． 1992． Transgenic sugarcane plants via
microprojectile bombardment[J]．Plant Journal，2：409
41 6．
Christou P， Ford T L． Kofron M． 1991． Production of
transgenic rice(Oryza sativa L．)Plants from agronomical—
ly important indica and japonica varieties via electric dis—
charge particle acceleration of exogenous DNA into imma—
ture zygotic embryos[J]．Bio／n f^ ，(9)：957—962．
Malhotra S D．1994．Biotechnology and Sugarcane[J]．Sug—
arCane，(3)：2— 4．
Maretzki A ，Sun SSM ，Nagai C．et a1．1990．Development
of a transformation system for sugarcane[J]．Proc Int As—
SOLPlant Tissue Cult，8：68．
Qin XM(秦新民)，Gao CW(高成伟)，Li CY(李春瑶)，et
(上接第 346页 Continue from page 346)
Hu SY(胡适宜 )．1993．Experimental methods in plant em—
bryology(I)determination of pollen viability(植 物胚 胎 学
实验方法(一)花粉生活力的测定)[J]．ChineseBulletin of
Botany(植物 学通报 )，10(2)：60～62．
Kling J． 1996． Could transgenic super crops one day breed
super weeds?[J]．Scinece，274：18O一181．
Qian YQ(钱迎倩)．Wei W(魏 伟)，Tian Y(田 彦)，et
“Z． 1999． Application and potential problem s of transgenic
crops(转基因作物在生产 中的应用及某些潜在问题)[J]．
Chin J Appl E7lviron Biol(应 用与 环境 生 物 学报 )，5(4)：
427— 4 23．
Richards AJ．1997c．Plant Breeding System[M]．London：
Chapman and Hal1．
Schefler JA，Philip JD．1994．Opportunities for gene transfer
from transgenic oilseed rape(Bra ssica napus)tO related spe—
n f． 19 9 9． Transformation of bacillus thuringiensis Cry IB
gene of B．campestris L．ssp．Chinensis(L．)Makina var．
Comma 71is Tsen et Lee(d~白菜苏云金芽孢杆菌 Cry IB基
因的遗传转化)[J]．Journal of Guangxi Norrnal Univer—
sity(广西 师范 大学学 报 )，17(3)：77—82．
Robert Bower，Robert G Birch． 1992．Transgenic sugarcane
plants via microprojectile bombardment[J]．The Plant
Journal，2(3)：409— 416．
V aisil IK ，Vasil V． 1999．Transformation of wheat via parti—
cle bombardment[J]．Methods in Mo Fc“ r Biology，1 1 1：
349— 358．
W an Y，W idholdm JM ，Lemaux PG．1995．Type l callus as
a bom bardm ent target for generating fertile transgenic
maize(Zea mays L．)[J]．Planta，196：7—14．
Xu ZQ(徐 子勤 )．2001．Transgenic Researches of Important
Cereal Species(重要禾谷类植物转基因研究)[J]．Progress
7 B o￡ f^， o og (生 物工程 进展 )，21(1)：59—74．
Zhang SZ(张树 珍 )，Zheng XQ(郑 学 勤 )．2001．Gentic Trans—
formation of Sugar cane Via Microprojectile Bombardment(基
因枪介导甘蔗遗传转化研究初报)[J]．Chinese Jounzal of
Tropical Crops(热带作物 学报)，3：35—41．
cies[J]．TransgenicResearch，3：263—278．
Snow AA， Anderson B， Jorgensen RB． 1999． Costs of
transgenic herbicide resistance introgressed from Bra ssica
napu s into weedy B．rapa[J]．Molecular Ecol，8：605～
615．
Song XL(宋 小玲 )，Qiang S(强 胜 )，Xu YH(徐 言红 )，et
a1． 2002． Biological characters of anthesis Echinochloa
spp．(稗类植物的开花生物学特性)[J]．Journal of Plant
Resources and Environment(植物 资 源与环 境学 报)．11
(3)：12— 15．
Wei W(魏 伟)，Qian YQ(钱 迎倩)，Ma KP(马克 平)．
1999．Gene flow between transgenic crops and their wild
related species(转基 物与野生亲缘种间的基因流)[J]．
Acta Bot Sin(擅 物学 报 )，41(4)：343—348．
维普资讯 http://www.cqvip.com