全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(6)：513— 516 2002 年 11月
应用正交设计建立青花菜植株的再生体系
徐 晓峰 ，黄学林
(中山大学生命科学学院生物系 ，广东广州 510275)
摘 要：通过 Ll6(4s)iE交试验，研究最适合青花菜 2周龄下胚轴愈伤组织诱导和不定芽发生的植物生长调
节物质的种类和浓度组合。结果发现在 NAA、6-BA、TDZ和 KT四种激素中，NAA对下胚轴愈伤组织发生
指数、不定芽发生频率的影响作用最大，确定以 MS+NAA 0．25 mg／L+6-BA 0．25 mg／L+TDZ 0．01 mg／L
(琼脂 0．aN，蔗糖 aN，pH5．8)作为单因子试验的培养基。NAA、6-BA和 TDZ浓度的单因子试验结果表明
最适合下胚轴的培养基配方 为 ：MS+NAA 0．1 mg／L+6一BA 1．0 mg／L+TDZ 0．06 mg／L(琼脂 0．aN ，蔗糖
3N，pH5．8)。
关键词：青花菜；植株再生；正交试验
中图分类号 ：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2002)06—0513—04
Establishment 0f broccoli plant regeneration
system with orthogonal design
XU Xiao—feng，HUANG Xue—lin
(School of Life Science，Zhongshan University，Guangzhou 510275，China)
Abstract：Different kinds and concentrations of 4 plant hormones were tested with orthogonal design-L16(40)
for their optimal effect on shoot regeneration and callus inducement in broccoli hypocotyls．The results showed
that the effect of the four plant hormones to shoot regeneration frequency and callus formation index is in the
order of NAA> TDZ> KT> 6-BA and NAA~>TDZ> KT> 6一BA respectively，and the best medium for broc—
coil hypocotyl culture is MS+NAA 0．1 mg／L+6-BA 1．0 mg／L+TDZ 0．06 mg／L+agar 0．aN containing
sugar 3 (pH5．8)．
Key words：broccoli)plants regeneration；LI6(4 )
前人对青花菜组织培养再生体系已作了一定的
研究，但所采用的品种各不相同，外植体的种类、大
小、生理年龄也不一致 ，所用激素种类、组合及浓度
也不一样。国外 Anderson等采用花芽，Jonson等
用叶片、中肋和茎作外植体，研究了青花菜的植株再
生体系建立的可能性[1，23；国内钟仲贤、陈澍堂采用
花蕾及各种花器官(花柄、萼 片、花瓣、子房、花药)，
李曙轩、裘文达采用室外青花菜的叶片、中肋及花序
柄，王怀名采用无菌苗的花蕾 、子叶、子叶节、胚根和
下胚轴作为外植体 ，分别研究青花菜试管苗无性繁
殖的合适条件[0~5)。近年来 ，人们采用种子发芽无
菌苗作研究材料，它能够获得生理状态 比较一致的
外植体 ，有助于人们深入探讨植物生长调节物质对
外植体愈伤组织分化和不定芽发生的作用。同时采
用正交试验 比较各种常用激素组合及配比浓度的优
劣 ，就能确定最适合外植体愈伤组织诱导 以及芽分
化的培养基配方 ，只有这样才能建立起高效的植株
再生体系。
收稿 日期：2001—09—10
作者简介：徐晓峰(1970一)，男 ，浙江衢州人，博士，讲师，植物学专业 ，现工作单位 ：广东省珠海市前 山梅溪双龙 山，农业科学研
究中心，邮编：519070。 *为通讯作者
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514 广 西 植 物 22卷
1 材料与方 法
1．1植物材料
“正盐水”322(F1)青花菜(Brassica oleracea L．
var．italica)种 子经常规消毒 后 ，接种 在 1／2 MS培
养基上，27±1 0C下暗培养 2～3 d后萌发待用。取
2周龄 的无菌苗 下胚 轴 (切 成 0．8 cm 左 右 )作为 外
植体 。
1．2正 交试验 L16(4s)设计
表头设计和各 因子水 平状 况见 表 1。各处理 的
培养基 均 以 MS作 为基 本 培 养 基 ，附 加 30 g／L蔗
糖 ，0．65 琼脂 粉 ，pH 为 5．8。培养基配制表 (略)。
表 1 L16(4 )正交设计
Table l The orthogonal design L16(4 )
结果分析的指标：正交试验 L16(45)中，外植体
培养 4周后 ，统计各处理 的愈伤组织 发生指数 CFI
(Callus formation index)、不定 芽 发 生频 率 (bf)和
平均每块愈伤组织诱导出的不定芽数 目(bn)。通
过统计分析 ，挑选 出最佳 组 合 ；并 以此为基 础 ，进行
单因子试验 ：NAA浓度 ；6-BA浓 度 ；TDZ浓度 。以
培养 4周后统计 CFI和 bf作为指标，确定愈伤组织
诱导和不定 芽产 生的最佳 培养基 配方 。
愈伤组织发生指数c兀 一奎 萋釜每囊笑 暑 簧笺墼× 。
不定芽发生频率c r =透 × 00％
． 出芽总 数
一诱 酉 趸芽 两
2 结 果
2．1正交试 验 LI6(4 )的结果
愈伤组 织诱 导 的正交 试验结 果见 表 2、3。综 合
表 1、2、3可 看出 ，各 因素不 同水 平对 愈伤 组织 发生
指数、不定芽发生频率的影响大小分别是：NAA>
TDZ> KT> 6一BA 和 NAA> KT> TDZ> 6一BA。
且它们的存在均会 提高愈 伤组织的发生指数。其
中，NAA是最主要的因素 ，不加 NAA就诱导不出
愈伤组织 。根据对愈伤组织的观察 ，随着 NAA浓
度的提高，愈伤组织量随之增加。外植体在 0～15 d
内受伤细胞开始脱分化启动，其切口两端逐渐膨大，
出现不规则分化、生长迅速的细胞团，呈现哑铃状；
第十五天开始 ，整块愈伤组织的颜色逐渐从绿色变
表 2 L16(4 )试验结果
Table 2 The experiment result of L16(4 )
处理号 Disposals 1 2 3 4
CFI 100 100 100 38．9 86．1 55．6 100 100 100 100 66．7 66．1 0
bf 0 27．8 0 0 0 13．9 0 41．7 66．7 86．1 19
． 4 0 0
表 3 Ll6(4 )试验 结果分析
Table 3 The analysis of L16(4 )
成无色，并且愈伤组织表面出现了肉眼可见的绿色
小点，最后 ，这些小点分化成了小芽，切割小芽转入
生根培养基能长成正常的小苗。
综上所述 ，确定 培养基配方 MS1(MS+NAA
0．25 mg／L+6-BA 0．25 mg／L+TDZ 0．01 rag／L)
是该实验中愈伤组织诱导的最佳组合培养基 。以下
的单因子试验均以 MS1为基础来进行，除非另有说
明 。
2．2单 因子试验 结果
2．2．1 NAA 对下胚 轴 不 定 芽发 生的 影响 从 图 1
可知，NAA对不定 芽的影响较大，当其 浓度 达到
1．0 mg／L，能诱导外植体愈伤组织产生，继续在原
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6期 徐晓峰等：应用正交设计建立青花菜植株的再生体系 515
瓣
埭
蠹
翅
椒
0．0l 0．025 0．05 0．1 0．Z5 0．b l
NAA浓度 (mg／L)
— ●卜一不定芽发牛频率 Rate of explants wi th shoot
— ◆一 不定芽／愈伤组织块数 Shoots／Ca1 1 US
图 1 不同 NAA浓度对下胚轴不定芽发生的影响
Fig． 1 Effects of NAA concentration on shoots
regeneration to hypocotyl
2．2．2 6一BA对 下胚 轴 不定 芽发 生 的影 响 细胞 分
裂素是诱导愈伤组织培养基中可调节幅度最大的植
物生长调节物质之一。从图 2可知，当只改变 MS1
培养基中的 6-BA浓度时，低浓度的 6一BA(O．1 rag／
L)其诱导的不定芽发生频率最低 ；随着 6-BA浓度
的提高，不定芽发生频率显著增加 ，平均每块愈伤组
织的不定芽数也随之提高 ；当 6-BA 的浓度为 1．0
mg／L时，下胚轴的不定芽发生频率和平均每块愈
伤组织的不定芽数达到最大，继续增加 6-BA的浓
度，外植体的不定芽发生频率和平均每块愈伤组织
的不定芽数明显减少，并且开始出现畸形不定芽。
2．2．3 TDZ对下胚轴不定芽发生的影响 从表 4可
知极低浓度的 TDZ(0．005 rag／L)就能诱导不定芽
产生，一半左 右 的外植体 能被诱 导 出不定芽；当
TDZ浓度达到 0．02 mg／L时，外植体的不定芽发生
赫
铂
6一BA浓度 (mg／l )
— ■一 不定芽发生频；缸 Rate of explants wi th shoot
— ◆一 小定芽／愈伤卦I织块数 Shoot s／Cal1US
图 2 不同 6-BA浓度对下胚轴不定芽发生
频率 和不定 芽数影 响
Fig．2 Effects of 6-BA concentration on shoot
frequency and shoots to hypocotyl
频率为 100 ，随着 TDZ浓度的继续提高，平均每
块愈伤组织 的不定 芽数显著增加，0．06 mg／L的
TDZ平均每块愈伤组织的不定芽数最多(7．8个／愈
伤 组织)。
表 4 不 同 TDZ浓度对下胚轴不定芽发生的影响
Table 4 The effect of TDZ concentration on the shoot
regeneration from hypocoty1
TDZ、 不 数
(mg／L) frequency( ) Ca11us numbers
3 讨 论
正交设计是多因素分析的有利工具，可以用较
少的实验次数得到较多的信息，从而选出主要因素
及其最 优水平( 。本实验 通 过正交 设计确定 了
NAA、6-BA、TDZ和 KT四种激素对愈伤组织发生
频率和不定芽发生的影响作用大小，并结合单因子
试验选出了最佳培养基配方
生长素可以影响植物的多种生理功能，目前已
经鉴定出一些生长素诱导的特异基因表达的变化。
一一一一一
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5l6 广 西 植 物 22卷
人工合成的 NAA在高温高压下 比较稳定 ，不易被
破坏 、分解，而且它诱导器官发生 的活性 比 IAA强
数倍 ，所以在植物组织培养中使用十分广泛。细胞
分裂素(CK)是腺嘌呤的衍生物，它对细胞 的分裂和
分化有明显效果，并与生长素共同调控细胞 的伸长
和分裂 。
近些年来 TDZ作为一种特殊的植物生长调节
剂广泛用于植物离体培养 ，是一种具有很强细胞分
裂素活性的苯基脲型化合物。深入了解 TDZ对植
物组织培养的生理反应影响有助于人们更好地理解
植物本身的形态发生过程。目前 TDZ对离体植物
形态反应的调节机制仍然不清楚( 。TDZ能非常
有效地引起一系列的生理反应 。在植物离体培养
时 ，与别的植 物 生 长调 节剂 相 比 ，极 低 浓 度 的 TDZ
就能使多种植物体系的愈伤组织生长速度增加数十
倍 ，提高细胞分裂速率 ，诱导不定芽发生及提高不定
芽数量(8]。另外 ，人们还发现在许 多植物种类上
TDZ能够代替生长素和细胞分裂素 的共 同作用 ，诱
导体细胞胚胎发生，并且 比其它植物激素的诱导速
度更快c7，9~II]。
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