全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(5)：673— 675 2007年 9月
百日草根尖和花药愈伤组织染色体制片技术
叶要妹，陈天花，齐迎春，杨 涛
(华 中农业大学 园艺林学学院 教育部园艺植物生物学重点实验室，武汉 430070)
摘 要：以种子萌发根尖和花药愈伤组织为材料 ，研究 了取样时间、预处理方法对百 日草染色体制片的影响。
结果表明：根尖上午 8：O0～9：O0，花药愈伤继代 3～5 d上午 9：O0～1O：OO为最佳取样预处理时间；采用三种
药剂预处理活体根尖，以4℃下饱和对二氯苯溶液或0．002 mol／L的8一羟基喹啉液预处理8 h效果最佳，花药
愈伤则以饱和对二氯苯溶液预处理 6 h效果最佳。本实验的预处理温度是固定 的，可克服预处理随季节和时
间温度的变化而带来的不稳定性 ，且百 日草花药愈伤染色体观察为首次报道。
关键词：百 日草 ；根尖；花药愈伤组织 ；预处理 ；染色体制片
中图分类号 ；Q94—336；$681．9 文献标识码：A 文章编号 ：1000-3142(2007)05-0673—03
Chromosome technique of root tips and
anther callus in Zinnia elegans
YE Yao—Mei，CHEN Tian-Hua，QI Ying—Chun，YANG Tao
(Key Laboratory of Horticultural Plant Biology of Ministry of Education，College of Horticulture and
Forestry Sciences，Huazhong Agricultural University，W uhan 430070，China)
Abstract：The roots of germinating seeds and anther callus were used to study the effects of the sampling time，the
pretreatment on the slide-preparation of the chromosomes in Zinnia elegans Jacq．The results indicated that the op—
tional root-sampling time was about 8：OO～ 9：00 am，anther calus about 9：OO～ 1O：O0 am for 3～ 5 d．Of the three
chemicals used to pre-treating the intravital root tips，P-Dichlorobenzene solution or 0．002 mol／L 8-Hydroxyquinoline
for 8 hours at 4℃ had the better effect，and anther calus P—Dichlorobenzene solution for 6 hours at 4℃．These
methods indicated that the number of metaphase chromosomes appeared more and chromosome spread wel1．The
temperature of pretreatment in the study was fixed，overcame instability of effect with variance of season and time．
Observation of chromosome of anther callus in Zinnia elegans Jacq．was first reported．
Key words：Zinnia elegans；apical root cell；anther callus；pretreatment；preparation of chromosome
百日草(Zinnia elegans Jacq．)原产美洲，以墨
西哥为分布中心。我国各大中城市常见栽培，但种
子都依赖国外进口，且价格昂贵，每年需要花费大量
外汇，因此，培育具有 自主知识产权的百 日草新 品种
显得尤为重要。但是，要培育新品种，必须有育种材
料 。花药培养是创新育种材料 的一种重 要手段 ，它
可迅速得到纯合的双单倍体，大大加速田间育种进
程。通过鉴定染色体的来源和倍性方法，可以识别
花药培养的材料好坏。染色体是遗传物质的载体，
要观察染色体数 目、大小、形态结构，依赖于染色体
制片技术。在染色体制片技术的各个环节中，预处
理至关重要。预处理的效果优良，既可以得到较多
的处于早中期分裂相的染色体，又可以使染色体分
散开，便于核型分析。预处理最常用的化学药物有
饱和对二氯苯、8一羟基喹啉、秋水仙素等。低温也作
为预处理 ，不同的植物所需的最适宜温度不同，如小
麦、油菜 1～5℃，水稻、玉米 6～8℃，处理时间在
20～40 h之间(利容千，1989)。
国内外有报道百 日草染色体数目都为 2n=24
(Ramalingam．等，1971；胡成华等，1991；黄少甫等，
收稿日期：2006·01—20 修回日期 ：2006—11—18
基金项目：国家“948”项目(2003一Z36)[Supported by the National“948”Plan of China(2003一Z36)]
作者简介：,t~-tf(1965一)，女，湖南平江人，硕士，副教授，在职博士生，主要从事园林植物栽培、育种研究，(E-mail)yymld@mail．hzau．edu．cn。
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l995；陈瑞阳等 ，2003)。黄少甫等(1995)在三种观
赏植物的染色体研究一文中介绍到百Et草根尖采用
对二氯苯预处理4h有清晰的染色体，但未交待当时
预处理环境的温度。实际上化学药剂处理的适宜时
间依不同的季节 、预处理环境温度而不同，一般温度
高有利于药剂的渗透。本试验以百 Et草根尖和花药
愈伤为材料，从取材时间、低温和药剂结合预处理等
进行了比较，目的在于探索出一套适合百 Et草根尖
和花药愈伤组织的染色体制片技术。
1 材料与方法
1．1材料
本试验采用的是百 Et草 J8栽培品种种子和 自
交系 S3代的花药愈伤组织 ，种子购于甘肃酒泉绿洲
种子公司。
1．2方法
l 2．1取材时间 取百 Et草 J8种子在培养室 25℃
萌发 24 h以上 ，待根尖长至 0．5～l cm时分别在上
午 8：00、8：30、9：O0、9：30、l0：O0、ll：00等时间取活
体根尖，用清水洗净待处理。取第 3、5、7、lO、l5 d
不同继代时间的百 Et草花药愈伤组织为材料 (张宝
红等 ，l996)，每次 9：O0～l0：O0取样。
1．2．2预处理试验 活体根尖长至 0．5～l cm时进
行预处理 ，设 3种药剂 ：饱和的对二氯苯液处理 4 h、
6 h、8 h(黄少甫等 ，l995；李光涛 等，2002)；0．05％
的秋水仙素液处理 5 h、7 h、9 h(张国莉等，2002)；
0．002 mol／L的 8一羟基喹啉液处理 4 h、6 h、8 h(杨
起简等，2003；陈庆富 ，2001)。花药愈伤采用饱和对
二氯苯液处理 4 h、6 h、8 h。预处理 温度为 4℃。
弃处理液后 ，用卡诺 氏固定液 固定材料 l8～24 h。
弃固定液，将材料用蒸馏水清洗 2～3次后置于
l mol／L盐酸中，在 6O℃条件下水浴 10 min。酸解
处理后及时将材料清洗 2～3次 ，然后取根尖 2 mm
左右或花药愈伤组织，用卡宝品红染色 20 rain。将
处理好的材料盖上盖玻片，在盖玻片上盖两层吸水
纸，用橡皮擦轻敲盖玻片，使材料充分分散均匀，取
效果较好的玻片显微镜下观察并摄影 。
位，一般为根尖的生长点。细胞处于分裂中期时，染
色体浓缩最短且形态特征清晰，此时取材制片有利
于染色体的观察和计数。大多数植物适宜的取材时
间为早上 8：00～ll：3O。经过反复试验 ，百 日草根
尖的取材时间在 8：00～9：30，处于中期分裂相细胞
最多。在最佳时间前取材 ，多数细胞核着色均匀 ，看
不见处于间期的染色体，或可见较长的染色体相互
缠绕，每条染色体包含 2条染色单体，核仁完整处于
前期；在最佳时间后取材，则染色体长度增长，移向
两极 ，有的细胞甚 至分裂成 2个细胞 。百 日草花药
愈伤组织不同继代天数细胞分裂显著不同，继代后
3～5 d取材 ，可确保有丝分裂指数较高，得到较多
可观察 、有价值的愈伤组织细胞。继代 7～10 d后
有丝分裂指数也较高，也可观察染色体并计数，但数
量减少 。继代 l5d后很难观察到染色体。
2．2预处理效果比较
根尖 9种预处理方法的处理效果可以看出，用
饱和对二氯苯液处理 4 h，染色体收缩不足，相互之
间容易粘连(图版 I：A)：6 h的染色体分裂相较多，
但染色体过长且 交叉 、重叠的较多 (图版 I：B)；以
饱和的对二氯苯处理 8h的效果最好 ，可观察到较多
的早 中期细胞分裂相 ，得到的染色体形态清晰、分散
度适中，染色体不易断裂且易分散在细胞表面(图版
T：C)；用 0．002 mol／I 的 8一羟基喹啉液处理 4、6 h
和 8 h的效果也较好 ，分别与饱和对二氯苯各个 时
间处理的染色体比较，染色体较长，缢痕区比较清
晰，同样处理 4 h、6 h的分散度不好 ，染色体交又粘
连的较多 ，8 h处理的染色体适 中(图版 I：D)；用秋
水仙素处理 5、7h和 9 h的染色体清楚，但分裂相较
少，染色体过于收缩，主缢痕和次缢痕不清晰，各条
染色体之间的形态差别不明显，无法作核型分析。
花药愈伤的三种处理 中，以饱和对二氯苯处理
6h的效果较 4 h、8 h的好，染色体形态清晰、分散度
适中，染色体不易断裂且易分散在细胞表面，观察到
百日草花药愈伤组织继代后染色体的数目有单倍体
12(图版 I：E)、二倍体 24(图版 I：F)、三倍体 36
(图版 I：G)、四倍体 48(图版 T：H)。
3 讨论
2 结果与分析
3．1取材时间
2·1取材时间和取材部位 取材时间的准确是染色体制片的关键。经过反
取材部位必须是植株生长活跃，分裂旺盛的部 复验证发现．百Et草的根尖最佳取材时间在 8
：00～
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5期 叶要妹等 ：百 日草根尖和花药愈伤组织染色体制片技术 675
9：00。但在实验过程中也发现外界 的环境，栽培品
种的差异对取材 时问都有影响。例如冬季 9：00左
右取材 ，可观察到较多 的中期相 ；而春季取材的时间
则需要稍稍提前 ，在 9：00时取材基本上只能观察到
末期相甚至细胞已经完成分裂。栽培品种差异的影
响表现在不同的栽培 品种其发芽势不 同，而且有丝
分裂周期不完全相同，即同时间选取的材料可能其
细胞处于不同的有丝分裂时期。为避免这种情况的
发生，对取材的时间设 立时问梯度即能保证得到适
宜的材料 。
F
图版 I 上排：根尖染色体形态图 对二氯苯处理A：4h；B：6 h；C：8 h；八羟基喹啉液处理D：8 h；
下排：花药愈伤细胞染色体数目；E：12；F：24；G：36；H：48。
Plate I Up：The morphology of chromosome p-Dichlorobenzene treatment A：4 h，B：6 h，C：8 h．8-Hydroxyquinoline
treatment D：8 h．Down：The number of chromosome of anther callus cells E：12；F：24；G；36；H：48．
3．2预 处理
从百 日草根尖不 同预处理方法的比较和经济节
约的原则来看 ，用饱和对二氯苯液或 0．002 mol／L
的 8一羟基喹啉液在 4℃下处理 8 h的效果最佳 ，染
色体分散度高，分裂相较多，染色体浓缩适中。本实
验也采用了饱和对二氯苯液在4℃下及室内环境下
各处理 4 h，但效果比黄少甫等(1995)报道的要差，
这可能与当时黄少甫等实验时室内的温度有差异相
关，本实验的预处理温度是固定的，且为低温。低温
和药剂的结合 ，不会随着季节和时间的不同而不同，
这可克服预处理随季节和时间温度的差异而带来效
果的不稳定性 。
4 结论
通过本试验总结出百 日草根尖和花药愈伤组织
的压片方法，即选取 8：()()～9：00根尖或继代 3～5 d
上午 9：∞～l0：00的花药愈伤组织一根尖4℃下饱
和对二氯苯或 0．002 mol／L的8一羟基喹啉液处理 8
h，花药 4℃下饱和对二氯苯预处理 6 h一卡诺氏固
定液固定材料 18～24 h一1 mol／L盐酸 6o℃水浴
1O min一卡宝品红染色 20 min，常规压片。采用这
种程序进行百日草根尖和花药愈伤细胞压片，可获
得理想的结果 。该方法简单 、可靠 、稳定 、重复性强 ．
且成本低 、效率高。
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察中，其从花侧面进入花内的频率达 9O ，极少数
从花顶端钻人。由此可见，单性木兰这种花瓣顶端
半合拢状的结构特征影响着昆虫的访花行为。单性
木兰雄花和雌花均有芳香气味，但雌花的访花昆虫
种类和访花频率比雄花少，且雌花和雄花共有的访
花者仅 6种，被证实传粉昆虫只有花蓟马，说明雌花
授粉的机会少，这可能是其结实率较低的主要原因。
(3)许多因素如光照、大风、温度、阴雨天气等都
可以影响访花者的数量 、行为和频率并进而影响植
物的传粉和座果(Wyat，1983)。由于历年气象资
料的缺乏，参照临近地区的历年气象记录推算出木
论国家级 自然保护区 4～8月为雨季，降雨量 占全年
的 73．7 (郑颖吾 ，1999)。从连续两年的气象因子
观测并参照历年气象记录，单性木兰花期正值雨季，
这就有可能影响其访花种类、数量和传粉效率，从而
影响其结实率。同时，同花期植物种类和数量也会
对单性木兰的访花者种类和数量、访花频率产生影
响。因此，对传粉不利的花期天气、传粉昆虫种类少
及存在同花期植物的竞争和外界不良环境是单性木
兰濒危的一个重要原因。
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