全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(3)：382— 385 2009年 5月
离体条件下卡德丽亚兰的形态建成
丁 兰，李 娟，杨 红，祁林林
(西北师范大学 生命科学学院，兰州 730070)
摘 要 ：采用光学显微镜和电子显微镜技术对离体培养条件下卡德丽亚兰原球 茎产生及形态建成进行了系
统的细胞学观察。结果表明，离体培养条件下卡德丽亚兰原球茎起源于母原球茎表皮、亚表皮或中央薄壁细
胞，这些细胞形成胚性细胞后 ，通过不断的细胞分裂形成胚性细胞团，胚性细胞团保持细胞分裂的同时伴随着
胚性细胞的液泡化过程，形成了由上百个薄壁细胞组成的原球茎；原球茎通过芽端分生组织区形成，进一步分
化成芽，其下方有输导组织形成。这一过程几乎重演了其合子胚发育及分化的过程。原球茎生长过程中其薄
壁细胞通过叶绿体储存大量淀粉粒，而在以后的形态建成中淀粉粒逐渐降解。
关键词 ：卡德丽亚兰 ；形态建成 ；原球茎；离体培养
中图分类号：Q944—33 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2009)03—0382—04
Morphogenesis of the protocorm
of Cattleya hybird in vitro
DING Lan，LI Juan，YANG Hong，QI Li Lin
(Colege of Li Sciences，No~hwest Normal University，Lanzhou 730070，China)
Abstract：Formation and morphogenesis of the protocorms Of Cattleya hybrid were investigated in cytology by light
microscopy and electronic microscopy．The results indicated that the protocorms consist of numerous parenchymatous
cells coming from proliferation of few embryonic cells originated from epidermal cell or subepidermat cell or parenchy—
matous cell of mother protocorms．W hile protoeorm was cultured on differentiation medium，the meristematic dome
was formed at its anterior end，which developed into a bud subsequently．The differentiation of the conducting tissue
always occurred at the opposite end．The developmental mode of the protocorms in vitro is very similar to that of its
zygotic embryo．A lot of starch grains were accumulated in the chloroplasts of parenchymatous cells when the proto—
corms grew up and the starch grains were decomposed during the process of morphogenesis．
Key words：Catleya；morphogenesis；protoeorm；culture in vitro
目前已有数十个科，上百种植物在离体培养条
件下能诱导脱分化，并进行形态建成。但迄今为止，
离体培养条件下植物进行形态建成的机理仍未得到
完全的阐明。兰科植物是较特殊的一类植物，其合
子胚的发育以及离体培养中器官的形态发生和形态
建成都要经历原球茎这一特殊的发育阶段，与其它
科属植物相比为其独特性。原球茎被认为是一种具
有明显形态学结构的休眠态茎，可以把其看成是原
胚进一步发育的延伸阶段(Gilles等，l997)。目前，
对原球茎发育的研究集中在兰科植物不同种属的种
子萌发过程(Nishimura等，1981；Giles等，1997；
Hanako Yasunori，2004；Kitsaki等，2004；伍 成
厚等，2005；丁兰等，2007)，但研究兰科植物不同外
植体脱分化过程中原球茎产生、原球茎发育及其形
态建成的过程的报道还很少(叶秀 ，1995)，尤其是
亚显微水平上对原球茎发育的观察还未见报道。
卡德丽亚兰(Catleya)原产于南美洲，是洋兰
中花最大 、色彩最艳丽 的种类 ，是名贵的切花和盆
收稿日期：2008—03—21 修回Et期：2008—10—23
基金项 目：甘肃省教育厅科研基金(991—21)；西北师范大学二期创新工程项目(NWNU)[Supported by the Research Foundation of Education
Committee of Gansu Pro~nce(991—21)；Innovation Pr~ect of Northwest Normal U niversity(NwNu)]
作者简介：丁兰(1964一)，女，四川德阳人，教授，博士，研究方向为植物细胞工程，E-mail：dinglan@nwnu．edu．cn。
3期 丁兰等：离体条件下卡德丽亚兰的形态建成 383
花。有关卡德丽亚兰组织培养，试管苗工业化生产
技术和种子萌发过程中原球茎的发育，本实验室已
进行了系统研究和相关报道 (丁兰等，200l，2002，
2003a，b，2007)。本研究以卡德丽亚兰杂种幼叶为
外植体，在离体条件下成功获得原球茎，在此基础上
对离体条件下卡德丽亚兰原球茎的发生及发育进行
了细胞学研究，旨在探索原球茎发生发育的规律，为
卡德丽亚兰工厂化生产应用及揭示其形态建成的机
理提供科学依据。
1 材料和方法
1．1材 料
卡德 丽 亚 兰 杂 种 (Cattleya BLC Rampant
Ridge“Sunday W ise Girle”×Bryee Cangon“Splendi
ferious”)，由兰州兰花研究开发公司提供。
1．2方法
1．2．1原球茎诱导和培养 取苗龄为90 d的卡德丽
亚兰杂种第一片幼叶，用清水冲洗，用 7O 酒精擦洗
10 S，放人 0．1 升汞中灭菌 15 min，用无菌水冲洗干
净，将幼叶切成 5．0 InITl×5．0 iTlrn的方块，分别放人
KC附加 6．0 mg／L BA的培养基中培养，待诱导出原
球茎后，将原球茎转人新鲜培养基中继续进行培养。
随后将原球茎转入分化培养基中(KC附加 BA 2．0
mg／[ )。培养温度(25±2)℃，培养基 pH 5．5，光照强
度 21．6／~mol·m- ·s- ，光照时间 12 h／d。
1．2．2光镜切片的制作及观察 每隔 3 d取培养基上
的原球茎用卡偌氏液固定 16 h，爱氏苏木精染液整染
4 d，用蒸馏水冲洗至无浮色，氨水返兰，常规石蜡脱水
包埋，切片厚度 0．5／xm，Olympus显微镜下观察拍照。
1．2．3超薄切片的制作及观察 每隔 3 d取培养基
中的原球茎切块，在 4℃条件下用戊二醛固定 12 h，
磷酸缓冲溶液漂洗 3次后用 1 饿酸 于室温下固定
2 h，再用磷酸缓 冲液漂 洗，经各 级酒精脱水后 用
Epon 812树脂包埋，在 37℃、45℃、6O℃条件下聚
合72 h，ULTRACUTE型超薄切片机切片，厚度为
40-50 nm，用醋 酸 铀 和柠 檬 酸 铅双 重 染 色，在
jEM一100 SX型透射电子显微镜下观察并拍照。
2 结果
2．1原球茎产生及发育的细胞学观察
当幼叶培养 7周后，幼叶外植体上有极小的球
状突起产生，继续培养后，在外植体上形成大小不一
的原球茎。原球茎转入分化培养基后，首先原球茎
的形状从近球形逐渐变长，一端突出变尖。变尖的
部分发育成芽体，另一端有根原基突起，进一步发育
形成完整再生植株。多个原球茎可分化形成丛芽。
幼叶外植体诱导产生原球茎后，将原球茎切离
外植体，转入新鲜培养基进行增殖培养。原球茎在
新鲜培养基中培养 3 d后即发现有的表皮细胞或表
皮下几层细胞着色深 ，细胞质浓厚，核大，共同组成
胚性细胞团(图版 I：1)，下层胚性细胞开始多向分
裂的同时其表皮细胞进行垂周分裂，随着胚性细胞
团增大向外突起发育形成子原球茎(图版 I：2)；另
外在表皮下数层细胞处还发现体积小，核大，质浓的
胚性细胞 ，胚性化细胞的多个核仁清晰可见(图版
I：3)，胚性细胞经多次分裂后形成胚性细胞团(图版
I：4)，胚性细胞团逐渐增大，向外突起又发育成极小
的子原球茎 (图版 I：5)。随着细胞分裂，原球茎长
大，原球茎内部细胞逐渐演变成薄壁细胞，核质比变
小，形成中央大液泡。
原球茎转人分化培养基后，其内部细胞经历了
以下发育过程 ：由几十个细胞组成的胚性细胞 团产
生极性，一端细胞分裂加快，细胞多而小，而另一端
的细胞分裂速度减慢或停止分裂，细胞体积长大，逐
渐液泡化，这样便形成了类似于顶端分生组织的生
长锥(图版 I：6)。锥顶细胞体积小，排列紧密，而远
离的细胞依次变大，随后生长锥 的锥顶两边的细胞
分裂加快，出现“鸟巢”状结构，产生叶原基(图版 I：
6；图版 I：7)，接着发育形成芽_J本(图版 I：8)。在芽
体下方的纵轴向有的细胞分化形成输导组织(图版
I：9)，并在输导组织下方薄壁细胞中出现几处旺盛
分裂的细胞团，推测可能是根的发生处。随后原球
茎进一步发育便形成了再生植株。
2．2原球茎发育过程中细胞亚显微结构的观察
电镜观察表明，子原球茎在长大过程中仍有部
分细胞保持分生能力或潜在分生能力，其细胞核质
比大，具多个小液泡(图版 I：10)，细胞质中内质网、
线粒体、核糖体大量存在，具有分生组织细胞典型的
亚显微特征(图版 I：l1)。而原球茎的绝大部分细胞
逐渐发育成细胞体积大，具有中央大液泡的薄壁细
胞(图版I：12)，在原球茎细胞薄壁化的过程中，逐
渐出现具有光合能力的叶绿体，且叶绿体数量逐渐
增多(图版 I：13)，并且光合作用的产物以淀粉的形
式贮存起来，电镜下产粉质体逐渐增多，并且质体中
384 广 西 植 物 29卷
图版 I 1．来源于表皮或亚表皮细胞的胚性细胞团；2．胚性细胞团长大形成小原球茎；3，4．起源于原球茎内部的胚性细胞和胚性细胞团；5．
胚性细胞增殖形成胚性细胞团；6．示原球茎顶端分生组织区；7．示叶原基形成；8．芽的形成；9．示输导组织发生；1O．原球茎中的胚性细胞；
l1．示胚性细胞中大量线粒体、内质网和核糖体；12．液泡化的薄壁细胞；13．原球茎细胞中大量叶绿体出现；14．叶绿体中淀粉粒形成；15．淀
粉粒水解后的叶绿体。
Plate l 1．Embryonic cels originated from epidermal cel or subepidermal cel×50；2．Development of embryonic cels into the protocorms×50；3．
4．Embryonic cels originated from the inside of protocorms X 400；5．Showing proliferation of the embryonic cels×50：6．Showing a meristematic
dome at the anterior pole×5O；7．Showing formation of the lear primordiunl×200；8．Showing formation of the bud×50；9．Showing the genesis of
conducting tissue×200；10．Embryonic cell in the protocorm s X 3 000；11．Numberous mitochondrions，endoplasmic reticulums and ribosomes in the
embryonic cell X 8 000；12．Vacuolized parenehyma cell×3 000；13．Showing chloroplasts×10000；14．Starch grains in chloroplasts×10 000：15．
Showing chloroplasts in which starch grains is hydrolyzed×10 000．
3期 丁兰等：离体条件下卡德丽亚兰的形态建成 385
的淀粉粒逐渐增大(图版 I：14)。在原球茎分化、发育
形成芽的过程 中，质体中的淀粉粒变小或消失，在质
体内膜留下大的空洞(图版 I：15)。
3 讨论
卡德丽亚兰与其他兰科植物一样，其种子胚发育
不完全，仅仅是由几十个细胞组成的胚性细胞团(原
胚)组成，原胚基本无分化。在种子萌发过程中，原胚
通过细胞不断分裂形成原球茎，随着原球茎发育长
大，逐渐分化形成分生组织区和薄壁细胞 区，分生区
形成芽体，其相对的一端形成根，最终产生小植株 ，从
而完成原胚的发育和分化(丁兰等，2007)。本研究表
明，离体培养条件下，通过卡德丽亚兰幼叶外植体诱
导原球茎进行形态建成的过程与其种子胚形成及发
育极为相似，均要经过原球茎阶段，并通过与种子原
胚几乎相同的原球茎发育和分化的历程后形成再生
植株。离体条件下原球茎发生和发育的过程几乎重
演了种子胚的演化过程：原球茎离体培养过程 中，在
一 定浓度激素(BA)作用下 ，首先在一些部位形成着
色深，细胞质浓厚，核质比大，代谢旺盛的胚性细胞或
胚性细胞团(相当于种子原胚细胞团)，胚性细胞开始
多向分裂的同时表皮细胞进行垂周分裂 ，随着胚性细
胞团增大向外突起发育形成原球茎；原球茎的一端的
细胞分裂加快，形成了类似于顶端分生组织的生长
锥，随后生长锥的锥顶两边的细胞分裂加快，出现“鸟
巢”状结构，产生叶原基，最后发育形成芽体；原球茎
另一端的细胞分裂速度减慢或停止分裂，细胞体积长
大，形成中央大液泡，成为薄壁细胞，当原球茎发育到
一 定阶段，在芽体下方纵轴 向产生输导组织，并在其
下侧出现根原基。卡德丽亚兰原球茎的形态发生的
起源是多元化的，可起源于原球茎表皮细胞 ，亚表皮
细胞和原球茎内部。
兰科植物在长期进化过程中选择了种子原胚经
过原球茎这一途径来继续其未分化胚的进一步发育，
说明原球茎这种结构对于兰科植物原胚发育和分化
具有其优越性和特殊的意义。尽管原球茎在形态发
生中的具体作用尚不清楚，但我们观察到原球茎细胞
中质体数量的变化以及质体中淀粉粒的储藏和降解
的特点：随着原球茎的长大，以及细胞薄壁化过程，原
球茎细胞中叶绿体数量增多，储存的淀粉粒数量增
多，颗粒度增大；在以后的原球茎分化过程中，淀粉粒
逐渐消失，分化后期淀粉粒被完全降解，在叶绿体中
形成较大的“空洞”状结构。这至少说明原球茎薄壁
细胞在发育过程中具有营养储存与供应的功能。至
于原球茎的其它作用尚需进一步的研究。
卡德丽亚兰组织培养过程中其形态发生与激素
种类和浓度密切相关，激素控制着原球茎的发生及其
发育的方向。本文供试材料卡德丽亚兰杂种幼叶产
生原球茎需高浓度的细胞分裂素(BA>6．0 mg／L)，
在该浓度条件下产生的原球茎可维持原球茎的生长
而不分化，当原球茎转人含有较低浓度细胞分裂素的
培养基中时，原球茎分化形成具芽和根的再生植株。
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