全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(2)：265—271 2007年 3月
活血丹组织培养与快速繁殖技术研究
陈光登，黎云祥 ，韩素菊，李 婷，兰 英
(1．西华师范大学 四川省环境科学与生物多样性保护重点实验室 ，四川 南充 637002；
2．西华师范大学 生命科学学院，四川 南充 637002)
摘 要：以活血丹为材料，应用组织培养和快速繁殖技术，对适于活血丹增殖分化的培养基、培养方式进行了
系统的研究。用活血丹叶片作为外植体，在MS添加生长素2，4一D和细胞分裂素 BA的培养基上成功诱导出
愈伤组织，并对其继代培养条件进行研究，分析了继代培养中褐化的原因。在 MS添加 NAA和BA的培养基
中，活血丹的茎尖和带腋芽茎段能直接诱导出大量丛生芽，随后将不定芽转入 MS添加 IBA和 KT的培养基
中，可生成不定根，完成快速繁殖技术体系。结果表明：活血丹愈伤组织诱导的最佳培养基为 Ms+2，4一D(1．5
mg／L)+BA(1．0 mg／L)，诱导率高达 91．38 。丛生芽诱导的适宜培养基为 Ms+NAA(o．1 mg／L)+BA
(1．0 mg／L)，在此培养基上，出芽率达 100％，芽增殖系数接近于 1o，有利于生物量的积累。而根的诱导则在
MS+IBA(1．0 mg／L)+KT(1．0 mg／L)培养基上进行最好，此基础上能诱导出健康、粗壮的根。试管苗炼苗
后移栽，成活率达 100％。
关键词：活血丹；组织培养；愈伤组织；快速繁殖
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2007)02—0265—07
Studies on tissue culture and rapid propagation
techniques of Glechoma longituba
CHEN Guang-Deng，LI Yun-Xiang ，HAN Su-Ju，LI Ting，LAN Ying
(1．Sichuan Provincial Key l aboratory of Environmental Science and Biological Diversity Conservation，China West Normal
University．Nanchong 637002，China；2．College of Life Sciences，China West Normal University，Nanchong 637002，China)
Abstract：Tissue culture and rapid propagation of Glechoma longituba were systematically studied in order to explore
suitable medium and culture conditions．The leaf as explants could induce the calus on the MS with 2，4-D and BA．
And it was studied with the different conditions of subculture and analyzed the cause of browning phenomenon．The
stem tips and the stems with auxiliary-bud could induce cluster bud，then cluster buds were replanted on the MS me—
dium with IBA and KT，indefinite-root would be induced and the system of fast propagation would be set up．The re—
suits showed that：The best medium for the induction of tissue culture was MS+2，4-D(1．5 mg／L)+BA (1．0 rag／
L)，the inducing rate could reach 91．38 ，and the optimum medium for cluster bud was MS+NAA (O．1 mg／L)+
BA (1．0 mg／L)，the rate of sprout could be up to 100 ．Propagating coefficient might be close to 10，it was propi—
tious to the accumulation of biomass．And the optimum medium for the induction of roots was MS+I13A (1．0 rag／
L)+KT(1．0 mg／L)；it could induce healthy roots．The survival rate of plantlets transplanted in soil could be up to
100 after nursling plantlets．
Key words：Glechoma longituba；tissue culture；callus；rapid propagation
收稿 Et期：2005—06—23 修回日期：2006～01-05
基金项目：四J1I省杰出青年学科带头人培养计划项目(O4ZQO26—047)；四川省科技厅基础项 目(03JY029-021—22)；西华师范大学学生创
新科研基金(2004)；四川I省重点学科建设项 目(SZD0420)[Supponed by the Personnel Training Plan ofOutstandingYouth Academic Leader
of Sichuan Province(O4ZQ026—047)；Department of Sdence and Technology of Sichuan Province(O3JY029-021—22)；Scientific Research Innov~
tion Foundation for Students of China West Normal University(2004)：Key Subjects Contruction Program of Sichuan Pmvince(SZDO420)l
作者简介：陈光登(1982-)，男 ，四川I金堂人，硕士研究生，(E-mail)gd—chen05@yahoo．tom．cn。
通讯作者，博士，教授(Author for correspondence，E-mail；yx_li@263．net)
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活血丹 (Glechoma longituba(Nakai)Kupr．)别
名连钱草、金钱草、佛耳草等，唇形科(Labiatae)活
血丹属(Glechoma Linn．)，为多年生匍匐草本植物。
《中华人民共和国药典》将活血丹干燥地上部分收载
为连钱草，具有清热解毒，利尿排石，散瘀消肿的功
效，用于治疗热淋，石淋，湿热黄疸，疮痈肿痛，跌扑
损伤等。研究表明，活血丹干燥地上部分连钱草含
黄酮类(祝德秋等，2003)和熊果酸(罗启剑等，2003)
等多种有效化学成分。目前，由于其生长环境的破
坏和过度开采，野生活血丹已不能满足市场需求，而
传统的种子和扦插繁殖法，繁殖率低、时间长，还可
能会导致种质退化。植物组织培养与快速繁殖技术
可以快速、高效地进行植物的繁殖，并且不受地理、
环境和气候条件的影响。20世纪以来，组织培养与
快速繁殖技术已经广泛应用于各种唇形科药用植
物，但有关活血丹的组织培养与快速繁殖技术尚未
见公开报道，本研究利用组织培养的方法，研究活血
丹的快速繁殖技术以提高活血丹的繁殖率，为其大
规模生产提供重要技术支持，同时也为保护其种质
资源提供重要手段。
1 材料与方法
1．1材 料
实验材料来源于四川嘉陵江流域南充段野生活
血丹，整株采集移栽于西华师范大学试验地，以便于
外植体的获取。
1．2方法
于 2～6月陆续从母株上取活血丹叶片、茎尖和
腋芽，自来水冲洗表面杂物，洗洁净溶液浸泡 10
min，自来水冲洗 20 min，双蒸水清洗外植体后，放
入培养皿内，酒精擦拭后放人超净工作台。70 9，6乙
醇，浸泡消毒 30 S，双蒸水清洗 4次。次氯酸钠浸泡
1～15 min(视材料的幼嫩程度而定)，放人培养皿中
双蒸水清洗数次。剪取叶片(0．5 cm×0．5 cm)、茎
尖和腋芽(0．2～1 cm)接种到培养基上。
1．3培养条件
所选用的基本培养基为 MS，按不同处理方案
添加不同类型和浓度的生长素 2，4一二氯苯氧乙酸
(2，4一D)、a一萘乙酸(NAA)、3一吲哚丁酸(IBA)和细
胞分裂素 6一苄基腺嘌呤 (BA)、6一呋喃氨基嘌呤
(KT)。用 0．1 mol／L NaOH 和 0．1 mol／L HC1调
节 pH为5．8，高压(121℃)灭菌 15 min。接种后置
于 HPG-280H人工气候箱内培养，温度为(24±2)
℃，光照强度为 2 000 mg·m- ·S～，光照时间为 12
h／d。
1．4愈伤组织培养
将叶片(0．5 cm×0．5 cm小块)接种在附加一
定激素配比的培养基上进行愈伤组织诱导。如发现
外植体染菌，立即将此瓶取出人工气候箱。培养 30
d后，将未染菌外植体计算出愈率，计算公式如下：
出愈率( )一出愈外植体块数／(接种数一染菌块
数)×100 9，6。
1．5丛生芽增殖培养
切取活血丹茎尖、腋芽(0．5～1 cm)接种于 MS
附加不同配比的植物激素的培养基上诱导生长，从
叶腋不断形成丛生芽，30 d后统计长出丛生芽的外
植体数，按下式计算：出芽率一长出丛生芽的外植体
数／接种的外植体数×100 ；增殖系数一增殖后有
效芽数／接种芽数。
1．6不定根诱导培养
当活血丹的不定芽生长至 3～4 cm，剪下，在
MS附加不同浓度植物激素 IBA和 KT培养基上进
行生根诱导，观察其生长状况，30 d后统计，并计算
不定根的积累量。
2 结果与分析
2．1愈伤组织的诱导
愈伤组织诱导培养基上的幼嫩叶片接种 20 d
左右，在叶片边缘伤口处出现细小白色颗粒状愈伤
组织，随着时间增加，愈伤组织不断增多，加厚，并不
断向叶片内部扩增，形成愈伤组织团，30 d后，整个
叶片全部愈伤组织化，颜色由最初边缘处的白色细
小颗粒变为淡黄色愈伤组织团(图版I：1)。
通过不同配比的激素诱导(表 1)表明，活血丹
幼叶在 MS为基本培养基，添加以生长素 2，4一D和
细胞分裂素 BA的情况下，在激素浓度相对比较宽
的范围内都能诱导出愈伤组织，但是不同配比的激
素浓度对其诱导率和愈伤组织生长状况都有显著的
差异：通过 2，5，8，11号比较得出，2，4一D浓度在0～
1．5 mg／L范围内，随着其浓度的增加，愈伤组织诱
导率增大，当其浓度超过 1．5 mg／L时，则诱导率呈
下降趋势，说明高浓度的2，4一D(≥1．5 mg／L)抑制
活血丹愈伤组织的诱导生成；通过 7，8，9号比较得
出，BA浓度在 1．0 mg／L时，愈伤组织诱导率最高，
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长势良好，而当其浓度偏低(<1．0 rag／L)或者偏高
(>1．0 rag／L)时．愈伤组织诱导率下降。综合来
看，MS+2．4-D(1_5 rag／L)+BA(1．0 rag／L)是活
血丹叶愈伤组织形成的最佳培养基，在此激素配比
的培养基上，叶愈伤组织出愈率高达 91．a8％，并且
愈伤组织生长良好(图版 I：1)。
图版 I Bc．褐色愈伤组织；Fc．疏松易碎状愈伤组织。1．诱导出的愈伤组织；2．增殖后的愈伤组织(z，4-D z．0 mg／L)；3．增殖培养基
上的嫩茎分化出丛生芽；4．芽在生根培养基上生根；5．活血丹的不定根；6．移栽后的再生植株(7 d后)；7．移栽后的再生植株 (60 d后)。
Plate I BC．Brown calus：FC．Fragile callus．1．Callus derived from Glechorna longituba；2．Calus of the multiplication(z，4-D 2．0
mg／L)．3．Bush—buds from infancy stem segments on the multiplication of medium；4．Rooting plantlets on the medium；5．Indefinite-roots
of G．1ongituba；6．Regenerated plants after transplantation(7 days later)；7．Regenerated plants after transp1antation(6O days later)．
2．2愈伤组织的继代培养
活血丹叶诱导出愈伤组织后，取愈伤组织，于含
MS+2，4一D(1．5 mg／L)+BA(1．0 mg／L)固体培养
基的 50 mL接种瓶中继代培养，并记录接种量[接
种量(rag／瓶)=接种后瓶重(rag／瓶)一接种前瓶重
(mg／瓶)]。以每瓶愈伤组织鲜重的增长系数表示
培养过程中的生长变化，进行愈伤组织生长动态实
验。每间隔 2 d取 6瓶进行继代接种，并称其收获
量[收获量(rag／瓶)一收获前瓶重(rag／瓶)一收获
后瓶重(mg／瓶)]。计算增殖系数：增殖系数一收获
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量(rag／瓶)／接种量(mg／瓶)。以增殖系数为纵坐
标，绘制活血丹愈伤组织生长的时间进程图。
图 1显示，接种于 MS+2，4一D(1．5 mg／L)+
BA(1．0 mg／L)配方培养基上进行继代培养的愈伤
组织，在继代接种后进入延迟期，第 1、2天内生长极
其缓慢甚至有生长停滞的现象，第 3天到第 7天，愈
伤组织有缓慢的生长，第 8天进入对数生长期，愈伤
组织细胞积累量明显增加，到第 20天左右，愈伤组
织积累量几乎不再增加，进入静止期，其愈伤组织细
胞生长积累基本符合“S”型增长曲线规律。这与水
母雪莲(Saussurea medusa Maxim．)愈伤组织细胞
生长(赵德修等，1998)相似，但在进入各生长时期的
时间上，由于物种间的差异和培养基配方的不同，两
者存在差异。接种于 MS+2，4一D(2 mg／L)+BA
(1．0 mg／L)培养基上的愈伤组织，继代接种后前两
天仍无明显变化，第 3天开始，继代前接触培养基的
部分愈伤组织表面逐渐变褐(图版 I：2，BC)，出现
褐化现象，另一部分原先未接触培养基的愈伤组织
缓慢生长出新的易碎状愈伤组织(图版 I：2，FC)。
说明2，4一D浓度对愈伤组织继代培养有明显影响，
高浓度 2，4一D会使其愈伤组织产生褐化现象。
2．3丛生芽的诱导
丛生芽诱导培养基上接种的活血丹带腋芽茎段
和茎尖 7 d后开始增殖生长，10 d后开始从叶腋长
出1-2个不定芽，随时间增加，丛生芽也不断增多，
15 d后丛生芽进入增殖高峰期，而 30 d后培养基内
营养物质被消耗减少，芽的增殖趋于平缓(图 2)。
试验表明，生长素 NAA配比细胞分裂素 BA
能有效抑制活血丹匍匐茎的形成，而直接诱导活血
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2 4 6 8 10 12 14 1 6 18 20 22
培养时间0uIture t ime(d)
图 1 活血丹愈伤组织生长的时间进程
Fig．1 Time-course of calus growth in G．1ongituba
凸BA(0．5mg／L)lBA(1．Omg／L)
_BA(1．5mg／k)O BA(2．Omg／L)
10 1 5 20 25 30 35
培养时间 Ou{ture time(d)
图 2 不同 BA浓度下活血丹芽生长的时间进程
Fig．2 Time-course of buds growing in
different concentrations of BA
丹丛生芽的形成。表 2显示：随着生长素 NAA浓
度的变化，活血丹丛生芽的生长形成有较大影响，低
浓度 NAA(≤0．1 rag／L)有利于丛生芽的诱导及其
生物量的积累；当NAA浓度大于 0．1 mg／L时，随
着浓度的增加，出芽率和增殖系数都有所降低，0．5
mg／L的NAA条件下断裂处有少量愈伤组织生成；
同时，在添加生长素 NAA(0．1 mg／L)配比不同浓
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2期 陈光登等：活血丹组织培养与快速繁殖技术研究 269
度细胞分裂素 BA的培养基上进行丛生芽诱导培养
时，细胞分裂素 BA对不定芽的生成具有很大的影
响(图 2)，低浓度的 BA在诱导丛生芽的过程中有
少量愈伤组织的生成，增殖效率低，而高浓度 BA诱
导出的丛生芽表现 出细长柔弱、叶片薄的形态 ，不利
于生物量的积累。3O d时统计 不同激素浓度配 比
下活血丹出芽情况显示，当 NAA浓度 0．1 mg／L，
BA浓度为 1．0 mg／L时，出芽率达 100 ，且生长
健康(图版 I：3)，增殖系数接近于 10。因此，最适
丛生芽诱导培养基为 MS+NAA(0．1 rag／L)+BA
(1．0 rag／L)，其对丛生芽的生长、增殖效果好，丛生
芽生长健壮。
2．4不定根的诱导
当活血丹的不定芽生长至 3～4 cm，将其剪下
并转接在 MS附加不同浓度植物激素 IBA和 KT
培养基上进行生根诱导。试验表明，适宜条件下，活
血丹较易生根，6 d后，开始出现白色细小根，12 d
后已经长出白色幼嫩的不定根(约 0．5 cm)，并且在
切口处出现少量绿色致密愈伤组织。15 d后，愈伤
组织不再生长，而不定根生长迅速(图版 I：4)，表面
表 2 不同配比的激素对丛生芽诱导的影响
Table 2 Effect of different kinds and concentrations of plant growth regulators on induction of cluster bud
表 3 不 同激素配比对不定根诱导影响 (30 d后)
Table 3 Effect of different kinds and concentrations of hormones on induction of indefinite-root(30 days later)
被根毛(图版 I：5)，3O d后已经布满三角瓶底。
植物激素IBA和KT对不定根的生长速度、生
长量及粗壮程度都有一定的影响(表 3)。在一定范
围内(0．5～1．0 mg／L)，随着 IBA浓度的增加，不定
根的生长速度加快，但当 IBA浓度大于 1．5 mg／L
时，不定根生长量减少，并且形成的不定根显得略
细，表面根毛少；在 KT低于 1．0 mg／L时生长略
慢，但不定根生长正常，当 KT达到 1．5 mg／L时，
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其诱导产生的不定根粗壮程度下降。不定根的诱导
以 MS+IBA(1．0 rag／L)+KT(1．0 mg／L)的培养
基为最佳 。
2．5试管苗的炼苗与移栽
在活血丹移栽时，因为试管苗长期在营养丰富
的无菌条件下生长，根系活动能力和植株适应能力
均较低，所以应注意炼苗和管理，提高成活率，使之
应用于生产。其方法：揭开活血丹培养瓶封口膜，在
培养基表面添加薄薄一层自来水，炼苗 2 d。取出试
管苗，轻轻地彻底洗掉粘附在活血丹根上的琼脂培养
基，以防止移栽后发霉。移栽到经 0．1 甲醛消毒的
细河沙土中，表面覆盖，保温保湿培养 10 d(图版I：
6)，再移入土中培养，待小苗幼茎长至 8～10 cIn时
(图版I：7)即可移栽到大田，成活率达 100 。
3 结论与讨论
活血丹叶在一定条件下能通过脱分化形成未分
化细胞群的愈伤组织。这种愈伤组织从叶伤口处长
出，但与叶有显著的不同，它已经失去了特殊的功
能，最后形成了外部形态一致的细胞群。有文献报
道，叶片愈伤组织形成机制与其酸性环境有关(祖元
刚等，2005)，培养基配方中的酸性物质使植物叶片
处于酸性环境中并导致植物正常细胞首先发生细胞
壁酸性降解，随后出现原生质体脱离细胞壁，进一步
发生细胞器重组或细胞重建，人工培养基的酸性环
境使细胞壁强制性地降解后，植物原生质体失去细
胞壁的包被后直接处于较酸性的环境中，可能会促
使原生质体出现酸性快速分裂。而谷瑞升等(1999)
认为，植物愈伤组织的诱导、增殖及形态建成主要受
外植体本身、培养基和培养环境三大因素的调控，植
物生长调节剂对愈伤组织的诱导及分化具有十分复
杂而重要的影响，在植物形态建成过程中，起主要作
用的是培养基中生长调节剂组合的配比，本试验研
究结果表明，培养基中生长调节剂组合的成分是诱
导活血丹叶片愈伤组织极为重要的因素。在通常条
件下生长素和细胞分裂素对诱导和保持愈伤组织的
高速生长是必要的，特别是当生长素和细胞分裂素
配合使用时，能有效地诱导愈伤组织的形成。生长
素 2，4一D在一定浓度范围内能有效促进活血丹叶愈
伤组织的形成，这与 2，4一D对唇形科另一植物丹参
(Salvia miltiorrhiza Bung)的脱分化效应影响是相
同的(梁红等，l997)，但随着其浓度增高(≥2．0
mg／L)，诱导率下降。因此，生长素2，4一D对活血丹
叶愈伤组织诱导率影响呈正态分布曲线。细胞分裂
素 BA在低浓度下(≤1。0 mg／L)与生长素配比能
增加活血丹叶愈伤组织的诱导率。通过 MS基本培
养基配比不同浓度生长素和细胞分裂素的研究表
明，MS+2，4一D(1．5 mg／L)+BA(1．0 mg／L)是活
血丹愈伤组织诱导的最佳培养基，在此条件下，愈伤
组织诱导率可高达 91．38 9／6，形成愈伤组织无性系。
活血丹叶愈伤组织在继代培养过程中，在 2．0
mg／L浓度 2，4一D的培养基中出现部分褐化现象
(图版 工：2，BC)，这与陆地棉(Gossypium hirsutum
L．)胚性愈伤组织继代培养中观察到的形态变异现
象相同(王醋之等，1994)，但王 之等观察到褐色愈
伤组织上长出新的灰色疏松状愈伤组织经 2～3次
继代后，产生了胚状体，而本试验在继代 3次后未观
察到胚状体的出现。至于其褐化部分，徐振彪等
(1997)认为褐化的发生可分为两种形式：一是由于
细胞受胁迫条件或其它不利条件影响所造成的细胞
死亡(称为程序化死亡)或自然发生的细胞死亡(称
为坏死)而形成的褐化现象，不涉及酚类物质的产
生；二是因为酚类物质所引起。环境胁迫条件包括
温度、2，4一D浓度、培养基种类、继代次数、外植体接
种于培养基中的放置方式、灭菌技术、光照、以及培
养基中的附加成分等，本试验显示，2，4-D浓度是影
响活血丹叶愈伤组织继代培养过程中褐化现象的一
个重要因素。另有报道，外植体的来源是植物组织
培养过程中产生褐化现象的影响因素(周俊辉等，
2000；王玖瑞等，2004)，活血丹的外植体来源是否对
其愈伤组织褐化有影响，我们尚在进一步研究之中。
活血丹丛生芽诱导试验显示出生长素 NAA和
细胞分裂素 BA配比对活血丹匍匐茎克隆分株体的
有效抑制，以至于活血丹带腋芽茎段和茎尖能顺利
从叶腋诱导出大量不定芽。试验显示，NAA和 BA
对丛生芽诱导率、增值效应和生长状况都起着重要
的影响，当 NAA浓度 0．1 mg／L，BA浓度为 1．0
mg／L时，丛生芽诱导率达 100 ，增殖效应最好，增
殖系数接近于 lO，有利于活血丹生物量的积累。因
此，0．1 mg／L的生长素 NAA与 1．0 mg／L的细胞
分裂素BA是其最佳丛生芽诱导增殖激素配比，这
与丹参快速繁殖中丛生芽的诱导具有极大的相似性
(冯玲玲等，2004)；但同是唇形科植物，活血丹丛生
芽诱导最佳 BA 浓度却明显低于南丹参(Salvia
bowleyana)的 2．0 mg／L(段英姿等，2003)，与黄芩
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2期 陈光登等：活血丹组织培养与快速繁殖技术研究 271
(Scutelaria baicalensis)所需激素浓度配比(高山
林等，2004)更是有着显著的不同，这可能与同科不
同种植物之问内源激素的差异性相关。
有文献报道，施肥处理对活血丹植株根生长 的
影响较大，而对地上部分影响较小，在越贫瘠的土壤
中，根量越大，这是同植株在贫瘠生境中对资源获取
的效率相关联的(陶建平等 ，2000)。本试验显示 ，在
试管苗生根诱导培养 中，植物激素对 活血丹不定根
的诱导生长影响同样是非常大的。前者从生态角度
研究活血丹个体觅食行为的一种表现，而本试验是
从生理角度研究了外源激素对活血丹生理机制的影
响。低浓度的生长素 IBA(<1．5 rag／L)能与细胞
分裂素搭配诱导不定芽生出健康粗壮的根，这在伞
形科植物积雪草[Centella asiatica(Linn．)Urban-]
植株再生试验中已经得到证实(Patra等，1998)，本
试验中IBA诱导活血丹生根效应与之相同，在高浓
度 IBA下，活血丹则显示出细弱的不正常根系。同
时，配比KT在诱导过程中起着相似的效应，其浓度
大于 1．0 mg／L时同样产生不利的影响。这与其内
源激素与外源生长素的协调机制相关，内源激素与
外源生长素的不协调致使活血丹根原基处于发育停
滞状态，而不能正常发育成根。
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