全 文 ：马铃薯离体再生及人工种子研究＊
唐　巍　欧阳藩
(中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 , 北京 100080)
郭仲琛
(中国科学院植物研究所 , 北京 100093)
摘　要　马铃薯 3 个品种虎头 , 克 4 和Favorita的茎叶外植体在 MS + 1 mg/ L NAA +1 mg/ L BA 培养
基上形成愈伤组织。在 MS +0.2 mg/ L NAA + 1 mg/ L BA培养基上 , 愈伤组织分化产生不定芽。在
MS + 0.05 mg/ L NAA培养基上 , 不定芽生根形成再生完整植株。 0.2 ～ 0.3 cm 大小的不定芽反复继
代可持续增殖。有 3 个以上叶片的不定芽在 MS + 5 mg/ L BA + 0.05 mg/ L IBA 培养基上和黑暗条件
下 , 在侧芽或顶芽部位形成微型薯。用 4%海藻酸钠和 2%氯化钙溶液包裹 0.2 ～ 0.3 cm 大小的不定芽
或直径为 0.2～ 0.3 cm 的微型薯制成微芽人工种子和微薯人工种子。在 4 ℃下贮存 2 个月后 , 微芽人工
种子和微薯人工种子在有菌腐殖土壤中播种 21 d 的萌发率分别是 15.7%和 96.2%。
关键词　马铃薯;离体再生;人工种子
　1997-05-06收稿
　第一作者简介:唐　巍 , 男 , 1964年出生 , 博士后 , 植物细胞工程专业。
＊国家 “ 863” 课题资助
Studies on in vi tro regeneration and
artificial seeds of potato
Tang Wei　Ouyang Fan
(S ta te Key Laboratory of Biochemical Engineering , Inst itute of Chem ical Meta llu rgy , Academia Sinica , Beijing 100080)
Guo Zhongchen
(Inst itute of Botany , Academia Sinica , Beijing 100093)
Abstract　Calli of three geno types of potato of Hutou , Kesi , and Favorita w ere induced by culturing their stem
and leaf explants on MS medium containing 1 mg/ L NAA and 1 mg/ L BA.Adventitious buds were induced
from calli on MS medium with 0.2 mg/ L NAA and 1 mg/ L BA.Adventitious shoots roo ted to form whole re-
generation plants on MS medium suppled with 0.05 mg/ L NAA.Prolifera tion o f shoots could be obtained on dif-
ferentia tion medium by subcultured of buds of 0.2 ～ 0.3 cm in height.Microtubers were induced from shoots on
MS medium containging 5 mg/ L BA and 0.05 mg/ L IBA in darkness.Artificial seeds were produced by encap-
sulated bo th adventitious buds and microtubers of 0.2 ～ 0.3 cm in size in 4% sodium alginate and 2% CaCl2
广 西 植 物 Guihaia　18 (1):65—69 1998 年 2月　
.After preservation at 4 ℃ for tw o months , the highest germination frequency of bud ar tificial seeds and micro-
tuber artificial seeds were 15.7% and 96.2% in the 21th day of germina tion in soil , respectively.
Key words　Solanum tuberosum L.;in vitro regeneration;artificial seeds
　　马铃薯 (Solanum tuberosum L.)是世界上最重要的粮食和蔬菜作物之一 。马铃薯茎尖培养
脱毒技术〔1～ 2〕 、原生质体培养植株再生〔3～ 5〕 、 微型薯的诱导〔6〕及抗病毒基因工程研究〔7〕等取得
了可喜的进展。部分研究成果已在实际生产中推广应用 , 获得了巨大的经济和社会效益 。然而 ,
为了满足马铃薯的品质 、 抗病育种及优良品种的种质保存 、离体快速繁殖和工厂化生产的要求 ,
建立马铃薯的离体培养植株再生体系 , 进行马铃薯的微芽和微型薯的人工种子研究 , 仍然具有很
重要的实际意义 。
1　材料和方法
1.1　试验材料来源
马铃薯 3个品种虎头 、克 4和 Favorita 的实验原始材料脱病毒无菌试管苗由宋艳茹教授提
供 , 试管苗在 MS +0.2 mg/ L NAA +1 mg/L BA培养基上增殖后供进一步实验用 。
1.2　愈伤组织的诱导 、 分化和植株再生
在MS +1 mg/ L NAA +1 mg/L BA培养基上进行虎头 、 克 4和 Favorita 茎叶外植体的愈
伤组织诱导 , 获得足够的愈伤组织后 , 在 MS +0.2 mg/L NAA +1 mg/L BA培养基上诱导不
定芽 。不定芽长至 0.5 ～ 1.5 cm 时 , 进行生根培养。在愈伤组织诱导培养 、 分化培养及生根培养
各 4周后统计愈伤组织诱导频率 、 不定芽分化频率和生根频率 。愈伤组织诱导为暗培养 、分化培
养和生根培养的光照培养 , 光照 14 h/d , 光强 1 500 lx 。培养温度为 25 ±1 ℃, 所有培养基中的
蔗糖为3%, 琼脂 0.7%, pH 5.8 , 在 121 ℃下灭菌。植株移栽在25 ℃的花盆内的腐殖土壤中进
行。每一处理的组织块或小苗数为 30 ～ 70个 。
1.3　微型薯的诱导 、人工种子的制作 、萌发及小植株的生长
分化产生的不定芽每 2周继代 1次 , 可保持持续增殖 。在分化培养基上生长 4 ～ 6周后 , 不
定芽生长成有 3个以上叶片的小苗 , 将小苗转移到 MS +5 mg/ L BA +0.05 mg/ L IBA +8%
蔗糖的液体培养基中 , 在黑暗 25 ±1 ℃条件培养 6周 , 统计微型薯诱导频率 。每一处理的芽数
为 30 ～ 70个。
收获分化培养 2周 、大小 0.2 ～ 0.3 cm 的不定芽及渡过休眠期的直径 0.2 ～ 0.3 cm 的微型
薯 , 用 4%海藻酸钠和 2%CaCl2溶液包裹 , 并在人工种皮中添加 0.5%的防腐剂WH 831-D。包
裹时间 15 min 。4%的海藻酸钠用附加 0.5 mg/ L BA 、 0.5 mg/ L GA3和 0.5 mg/L IBA 的 MS液
体培养基配制 , 碳源为 2%的麦芽糖 。
人工种子在 4 ℃冰箱中保存 2个月后进行萌发试验 , 萌发试验在有菌和无菌条件下分别进
行。有菌萌发在腐殖土壤中完成 , 无菌萌发在无激素的 MS 固体培养基中 (含 0.7%琼脂)完
成。并以未经低温保存的人工种子和微型薯作对照 。每一处理中所用的微型薯及人工种子数为
50个 。再生的小苗长至 3 ～ 5 cm 时移出培养室 , 于温室中以观察其生长状况。实验重复 3次 ,
实验数据为 3次重复的平均数 。
66 广　西　植　物 18 卷　
2　结　果
2.1　愈伤组织的诱导 、 不定芽的分化和植株再生
虎头 、克 4和 Favorita的茎和叶外植体在愈伤组织诱导培养基上均可产生愈伤组织 , 6周后 ,
克 4和 Favorita的诱导率达 80%以上 , 虎头的诱导率达 90%以上 。虎头的茎愈伤组织诱导的频
率达 100%(图版Ⅰ -1)。不同品种愈伤组织的生长速度 、质地 、生长周期不同。3个品种中 ,
Favorita的愈伤组织生长速度较快 , 平均达 5 ～ 10 mg/d 。生长较快的愈伤组织 , 质地较松软 , 生
长周期较短 , 容易衰老死亡。生长较慢的愈伤组织质地较密实 , 衰老比较缓慢 , 分化培养所需的
时间长。
取 0.5 ～ 1 g 大小的愈伤组织在附加 0.2 mg/L NAA 和 1 mg/L BA的 MS 分化培养基上诱导
不定芽 , 6周后 , 3个品种中 , Favorita叶愈伤组织的不定芽分化频率最高 , 达 85%以上 , 且每
克愈伤组织上的平均不定芽数也最高 , 平均达 5.3 个。虎头和克 4 的不定芽分化频率为 70%～
80%, 每克愈伤组织上的平均芽数为 2 ～ 4个。3个品种的茎叶愈伤组织起始分化所需的时间大
小变化是克 4>虎头>Favo rita 。愈伤组织上所产生的单个粗壮的不定芽见图版Ⅰ -2。将不定芽
(1 ～ 2个叶节)转移到新鲜分化培养基上 , 4 ～ 6周后在叶节处形成多个不定芽 (图版Ⅰ -3)。
分化产生的不定芽 , 长到 0.5 ～ 1.5 cm 或有 3个以上叶片时转移到附加 0.05 mg/L NAA的
MS生根培养基上 , 7 d后不定芽基部形成了小根。4周后 , 3个品种不定芽的生根频率均达 85%
以上 , Favo rita的生根频率达 100%。小植株的移栽成活率与炼苗时间有关 , 不经炼苗的小植株
在培养室内的移栽成活率为 70%左右 。炼苗 3 d后移栽成活率在 95%以上 , Favorita达 100%。3
个品种的再生完整植株如图版 Ⅰ-4。
2.2　微芽的增殖 、 微型薯的诱导和人工种子制作
愈伤组织分化培养产生的不定芽长到 0.2 ～ 0.3 cm时 , 转移到新鲜分化培养基上 , 可保持不
定芽的持续增殖 , 形成大量可直接用于制造人工种子的微芽 。在分化培养基上的培养时间超过 2
周后 , 不定芽生长加快 , 4 ～ 6周后多数 (85%以上)不定芽有 3个以上叶片 , 可以用于微型薯
的诱导。有 3个以上叶片的不定芽在附加 5 mg/ L BA 、 0.05 mg/L IBA和 8%蔗糖的 MS 培养基
上 , 在黑暗条件下培养 4周后 , 在芽的顶端或侧芽部位形成微型薯 (图版 Ⅰ -5)。6周后 , 微型
薯诱导频率达 60%以上 , Favori ta最高 , 达 85%。部分小苗上形成了 2个以上微型薯。用有一个
节并除去了顶端的 Favorita不定芽在附加 5 , 7 , 9 , 11 , 13 , 15 mg/L BA (图版Ⅰ -6的序号 1
-6)的微型薯诱导培养基上 , 6周后小芽均在叶节处形成了微型薯 (图版 Ⅰ -6), 频率为 50%
～ 70%。在15 mg/L BA下 , 已形成的微型薯上又形成了微型薯 (即二级微型薯)。可见BA 浓度
为 5 ～ 15 mg/L 时均可产生微型薯 , 高浓度 (15 mg/L)BA可能有利于二级微型薯的形成。
取大小 0.2 ～ 0.3 cm 的不定芽或渡过休眠期的直径 0.2 ～ 0.3 cm的虎头 、 克 4和 Favori ta微
型薯用海藻酸钠 (4%)和氯化钙 (2%)包裹制成人工种子 , 不同包埋时间实验结果表明 , 微芽
人工种子为 10 ～ 12 min及微薯人工种子为 15 min时人工种子的贮存性能好 , 萌发率也较高 。包
埋时间太长 , 人工种子萌发率降低;包埋时间太短 , 人工种子不耐贮存。在最佳包埋条件下制作
的 Favorita微薯人工种子如图版 Ⅰ-7 , 微芽人工种子如图版 Ⅰ-8。
67　　1期 唐　巍等:　马铃薯离体再生及人工种子研究
2.3　人工种子的萌发和小植株的生长
在 4 ℃下保存 2个月的虎头 (H)、克 4 (K)和 Favorita(F)的微芽人工种子 、微薯人工种子和
微型薯在无菌条件下的萌发率低于对照 3%～ 5%。在有菌的腐殖土壤中 , 4 ℃处理的 H 、 K和 F
的微芽人工种子萌发率明显低于对照 (表 1)。3个品种微芽人工种子萌发率的大小变化是 F >H
>K 。但是 , 4 ℃处理的 H 、 K 和 F 的微薯人工种子和微型薯 , 在有菌腐殖土壤中的萌发率均高
于对照 。3个品种微薯人工种子及微型薯萌发率的大小变化是 F >K >H (表 1)。从播种时间上
看 , 21 d的人工种子萌发率已达到或接近最高值 。微芽人工种子和微薯人工种子在有菌条件下
的最高萌发率分别是 15.7% (Favorita)和 96.2% (Favorita)。另外 , 来自微薯人工种子的植株
在株重 、 叶数及长势上均优于微型薯。
表 1　低温保存对马铃薯人工种子萌发率(%)的影响
Table 1 Effect of low temperature treatment on the germination frequency o f ar tificial seeds in potato
播种时间(d)
Time of
sowing(days)
4 ℃处理 T reatment at 4 ℃
微芽人工种子
Bud artif icial
seeds
微薯人工种子
Microtuber art ificial
seeds
微型薯
Microtubers
　H　　K　　F　 　H　　K　　F　 　H　　K　　F　
对照 Cont rol
微芽人工种子
Bud artif icial
seeds
微薯人工种子
Microtuber
artif icial seeds
微型薯
Microtubers
　H　　K　　F　 　H　　K　　F　 　H　　K　　F　
7 2.7 2.1 3.3 7.2 8.9 10.4 6.1 7.2 8.0 4.1 3.2 5.8 5.1 6.3 8.4 4.3 5.2 7.3
14 4.1 3.7 5.6 29.7 31.5 31.6 23.2 29.1 29.2 10.2 9.7 12.6 24.7 28.2 28.5 21.2 24.3 31.2
21 13.6 8.4 15.7 90.7 92.3 96.2 81.7 82.3 89.4 18.7 12.4 19.1 87.1 85.3 89.2 75.1 79.8 85.7
28 14.5 8.8 15.7 92.1 92.3 96.2 81.7 83.1 89.5 18.7 13.5 19.3 88.1 85.6 89.7 76.5 82.4 86.0
　　H:虎头;　K:克 4;　F:Favorita
3　讨　论
马铃薯离体培养植株再生体系的建立及人工种子研究在马铃薯的遗传转化实验及优良品种在
实际生产上的快速推广中有较大的应用价值 。我们的实验表明 , 在马铃薯的离体再生体系中 , 外
植体和品种是影响植株再生频率的主要因素 , 外植体中以叶的不定芽分化能力最强 , 这在马铃薯
的原生质体培养中得到证实〔3～ 4〕 。所实验的 3个品种中 , Favo rita的植株再生频率最高 , 这可能
与该品种的遗传组成有关 。炼苗时间是影响植株移栽成活率的一个重要因素 , 对虎头 、克 4和
Favorita来说 , 炼苗 3 d后 , 可以大大改善小植株对环境的适应能力 , 大幅度提高成活率。
马铃薯人工种子具有体积小 、 运输方便 、 无病毒及能够保持已有的优良性状等特点〔8～ 9〕 ,
在实际生产中有应用价值 , 它可以降低生产成本 , 提高收益。本文所研制的微芽人工种子 , 贮存
2个月后 , 由于供氧及萌发时种皮腐烂等原因 , 萌发率明显低于对照组 , 不经贮存的微芽人工种
子 , 在有菌条件下的萌发率也低于 30%, 在实际生产中的应用价值不大 。但是本研究中所制成
的微薯人工种子 , 4 ℃处理 2个月后 , 其萌发率高于对照 , 原因可能是 4 ℃低温处理不仅可以使
人工种皮完好无损甚至加固了种皮 , 而且提高了人工种子中微型薯对逆境的适应能力;另外 , 经
低温处理的微薯人工种子在室温下萌发时 , 其中的微型薯能够更加快速和有效地吸收人工胚乳中
的养分和激素 , 增强对环境的抵抗力。由于人工种子中胚乳成分可供给微型薯萌发时幼苗生长所
需的大量养分 , 为幼苗的早期发育提供更好的营养环境 , 因此微薯人工种子萌发后产生的小植株
在生长状况和生长量等方面均优于微型薯。本研究为马铃薯人工种子的实用化奠定了基础。
68 广　西　植　物 18 卷　
参 考 文 献
1　Wang PJ.In vit ro mass tuberizat ion and vi rus-f ree potato product ion in Taiw an.Am.Potato I , 1982 , 59:33～ 37
2　王炳君 , 刘宗樊.马铃薯茎尖脱毒与微型薯生产.北京:高等教育出版社 , 1990.11
3　李耿光 , 张兰英.马铃薯叶肉原生质体再生植株的研究.植物学报 , 1988 , 30(1):21～ 24
4　李世君 , 李向辉 , 孙勇如.马铃薯无菌苗叶肉原生质体再生植株.生物工程学报 , 1989 , 5(1):57～ 63
5　戴朝曦 , 孙顺娣.马铃薯实生苗子叶及下胚轴原生质体培养研究.植物学报 , 1994 , 36(9):611～ 618
6　冉毅东 , 王　蒂 , 戴朝曦.用组培法诱导试管微型薯的研究.马铃薯杂志 , 1991 , 4 :193～ 198
7　崔晓江 , 彭学贤 , 周雪荣等.3价转病毒外壳蛋白基因马铃薯的获得.科学通报 , 1994 , 39(21):1992～ 1995
8　Fuili JA , S lade D , Redenbangh K , et al.Artifi cial seeds for plant p ropagat ion.TIB TECH , 1987 , 5:335～ 339
9　Kit to S , Janick S.Production of synthetic seeds by encapsulat ing asexual embryos of carrot.J.Am.Soc.1985 , 110:277～ 282
图 版 说 明
图版Ⅰ
1.愈伤组织 ×5;2.不定芽 ×5;3.腋芽增殖 ×5;4.再生完整植株 ×5;5.顶芽及侧芽微型薯 ×5;
6.Favorita侧芽微型薯 ×5;7.微薯人工种子 ×3;8.微芽人工种子 ×15。
Explanation of P late
Plate Ⅰ
Fig.1 Calli ×5;Fig.2 Adventitious buds ×5;Fig.3 Cluster of buds ×5;Fig.4 Whole regeneration plants ×5;
F ig.5 M icrotubers deriv ed from apical buds and axilary buds ×5;Fig.6 Microtubers derived from Favo rita axillary buds
×5;F ig.7 M icrotuber artificial seeds ×3;Fig.8 Bud artificial seeds ×15.
69　　1期 唐　巍等:　马铃薯离体再生及人工种子研究
唐　巍等:马铃薯离体再生及人工种子研究 图版Ⅰ
Tang Wei et al:Studies on in vi tro regeneration and artificial seeds of potato plateⅠ
See explanation at the end of text