全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(2)：152— 155 2007年 3月
中国特有植物卧龙沙棘自然群体的 RAPD分析
陈 纹，孙 坤 ，张 辉，苏 雪，陈学林，马瑞君
(西北师范大学 植物研究所，兰州 730070)
摘 要：应用 12个 随机引物对卧龙沙棘全部 2居群共 28个个体进行了 RAPD分析。结果表明，卧龙沙棘具
有较丰富的遗传多样性，多态位点百分率为78．o5 ，Nei’S基因多样性h一0．255 3，Shannon’S多态性信息指
数 J一0．384 1。分布范围狭窄的卧龙沙棘在亚种水平的遗传多样性明显高于分布较广的中国沙棘。在居群
水平上 ，卧龙沙棘同样具有很高的遗传多样性 ，平均多态位点百分率为 63．42 ，Nei’S基因多样性 h一0．219
3，Shannon’S多态性信息指数 一0．328 7 卧龙沙棘的基因分化系数 Gst一0．142 5，表明遗传变异主要存在
于居群内。AMOVA的结果也表明，在全部的遗传变异中，19．18 的遗传变异存在于居群之间，与 Gst值基
本一致。这一结果符合卧龙沙棘风媒、异交的繁育系统特点。
关键词：卧龙沙棘 ；RAPD；遗传多样性
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2007)02—0152—04
Chinese endemic Hippophae rhamnoides
ssp．wolongensis (Elaeagnaceae)
CHEN W en，SUN Kun ，ZHANG Hui，SU Xue，
CHEN Xue-Lin，MA Rui-J un
(Institute of Botany，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China)
Abstract：12 primers were used to examine gene diversity of H．rhamnoides L．ssp．zoolongensis by random amplified
polymorphic DNA(RAPD)．78．05％ in total of the seorable markers were polymorphic at subspecies leve1．Nei’S
gene diversity(^ )and Shannon index(D were 0．255 3 and 0．384 1，respectively．As an endemic species whose dis—
tribution is very limited，ssp．zoolongensis has high genetic diversity compared to ssp．sinensis．At population level，
high genetic variation was also detected：total means of three parameters(PPB，h and D were 63．42％，0．219 3 and
0．328 7，respectively．The Gst showed 14．25 genetic variation among populations，which indicated most of the vari—
ation existed mainly within populations．The results of AMOVA showed 19．18 differentiation among populations．
These results were in consistent with the characters that H．rhamnoides L．ssp．zoolongensis is an outcrossing，wind-
polinated plant．
Key words：H．rhamnoides L．ssp．zoolongensis；RAPD；gene diversity
收稿日期 ：2005-06-13 修回日期：2006—01—29
基金项目：国家自然科学基金(30570110)；西北师范大学科技创新工程(No．02)；西北师范大学青年教师科研基金(NWNU-QN-04—30)
西北师范大学重点学科建设项目[Supported by the National Natural,Science Foundation of China(30570110)；Science and Technology
Innovation Project of Northwest Normal University(No．02)；Scientific Research Foundation for the Youth Scholars of Northwest Normal
University(NWNU-QN-O4—30)；Key Subject8 Construction Program of Northwest Normal University]
作者简介 ：陈纹(1978一)，女 ，甘肃天水人 ，硕士 ，从事植物分子遗传学研究。
’通讯作者(Author for correspondence)
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2期 陈纹等：中国特有植物卧龙沙棘自然群体的RAPD分析 153
遗传多样性和居群遗传结构是居群生物学的重
要内容。对遗传 多样性的研究可以揭示物种或居群
的进化历史和机制，也能为进一步分析其进化潜力
和未来命运提供重要资料(Soltis等，1991)。居群
遗传结构上的差异是遗传多样性的重要体现，一个
物种的进化潜力和抵御不良环境的能力也有赖于居
群的遗传结构(Grant，1991；Milar等，1991)。
沙棘属(blippophae)是重要的水土保持和经济
植物 ，广布于我国干旱 、半干旱地区，包括 7种 10亚
种。其中，沙棘 (Hippophae rhamnoides L．)共 9
亚种，分布于中国、蒙古、中亚至欧洲地区，是沙棘属
植物中分布范围最广的一个种。近年来的调查表
明，沙棘的不同亚种间，同一亚种不同居群间以及同
一 居群内都存在有丰富的形态变异(Yao等，1992；
廉永善，2000)。自Yao等(1993)利用同工酶对几
种沙棘属植物进行遗传多样性研究之后，近年来，
Bartish等(2000，2002)及本文作者应用 RAPD方
法分别对欧洲分布的海滨沙棘(H．rhamnoides L．
ssp．rhamnoides)和我国特有的中国沙棘(H．rham-
noides L．ssp．sinensis)二个亚种的遗传多样性进行
了研究。最近，作者等对中国沙棘属植物进行野外
居群调查的过程中，在川西高原和四川盆地过渡地
带发现一新亚种，即卧龙沙棘(H．rhamnoides L．
P r me r S 9 7
ssp．wolongensis Lian，K．Sun et X．L．Chen)(Lian
等，2003)。本文是应用 RAPD方法对卧龙沙棘的
遗传多样性研究的报道，其结果将为今后进一步探
讨卧龙沙棘的遗传变异与进化机制提供理论基础。
表 1 用于扩增 的 12个随机引物及序列
Table 1 12 random oligonucleotide primer and sequences
1 材料和方法
1．1实验材料
卧龙沙棘目前仅发现有四川省汶川县和茂县两
地的两个居群，其中四川省汶川县卧龙的居群(W1)
分布在海拔 1 660~2 200 m处，茂县较场长海的居
群(W2)分布在海拔 2 320～2 370 m的狭小范围
内，且两居群个体数目有限。在野外取样时以大部
分个体为材料，分单株取新鲜幼叶，硅胶干燥备用。
P r i me r S4 1 4
图 l 卧龙沙棘个体的 RAPD图谱
Fig．1 RAPD resul ts of H．rhamnoides ssp．wolongensis
1．2总 DNA提取
采用 CTAB微量法提取总 DNA，具体操作同
Xie等(2001)的方法，根据本实验材料稍作改动。
1．3扩增反应及产物检测
从上海生工公司S系列的 136个随机引物中筛
选出 12个扩增产物清晰、稳定、重复性高、多态性丰
富的引物，对两居群共 28个个体基因组 DNA进行
RAPD实验。引物及其序列见表 1。PCR扩增程序
和反应体系同 Qian等(2001)，DNA扩增反应在
Rapidcycler 1818(idaho Tech．)上完成。
扩增产物用 1．5 琼脂糖(Promega)凝胶电泳
分离，EB染色，用 Bio—Rad图像分析仪(Gel Doc
2000 Gel Documentation System)观察并记录。以
分子量范围 100~3 000 bp的DNA标准分子量为对
照，确定扩增片段的分子量大小。扩增产物见图 1。
1．4数据统计与分析
根据反应产物在电泳图谱中的位置，以扩增条
带的有无记为“1”或“0”，形成 RAPD表型的0／I数
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l54 广 西 植 物 27卷
据矩阵。用 POPGENE32(Yeh等，1997)软件计算
各居群的多态位点百分率(PPB)、Nei’S基因多样
性(^)、Shannon’S多态性信息指数(I)、亚种基因多
样性(Ht)、居群基 因多样性 (Hs)、基因分化系数
(Gst)和Nei’S遗传距离。应用分子方差分析软件
AMOVA分析遗传变异在居群间和居群内的分配。
用 NTSYS软件根据平均分类距离对单株进行 UP—
GMA聚类分析。
2 结果
用 l2个随机引物对卧龙沙棘两居群 28个个体
进行 RAPD分析，共检测到 82个位点，平均每个引
物 6．8个位点，其中64个为多态位点，多态位点百分
率(PPB)为78．O5 。Nei’S基因多样性h=0．255 3，
Shannon’S多态性信息指数I：0．384 1。在居群水
平上，居群 w1和居群 W2的多态位点百分率分别
为 58．54 和 68．29 ，平均 PPB一63．42 ，两居
群的 Nei’S基因多样性分别为 0．222 8，0．2157，
Shannon’S多态性信息指数为0．328 2和0．329 2。
PPB值和Shannon’S多态性信息指数(D表明居群
W2的遗传多样性高于 wl，但 Nei’S基因多样性
(^)的结果略有不同。各遗传多样性参数见表 2。
POPGENE的计算结果(表 3)显示，卧龙沙棘
表 2 卧龙沙棘的遗传多样性参数
Table 2 Genetic parameters of H．rhamnoides L．ssp．wolongensis
的居群遗传多样性 Hs=0．219 3，基因分化系数 Gst
一0．142 5，表 明遗传 变异主要存 在于居群 内。
AMOVA的结果与 POPGENE的结果基本一致，在
全部遗传变异中，8O．82 的遗传变异存在于居群内
个体问，居群问的遗传分化为 l9．18 9／6，稍高于 Gst
值。对基因流的计算结果表明，卧龙沙棘居群间每
代迁移数目Nm为 3．007 6，表明在居群间存在较
频繁的基 因流。
表 3 卧龙沙棘居群的遗传分化
Table 3 Genetic variation of H．rhamnoides
L．ssp．zoolongensis
Note：Nm=0．5(1一Gst)／GSt
根据 0，1矩阵对卧龙沙棘两居群 28个个体的
聚类分析结果(图 2)表明，除 W2的 1个个体较特
殊，单独聚为 1支外，其余 27个个体明显分为2支，
其中一支以w1的个体为主，包括 7个 w1的个体
与W2的 3个个体；另一支中，除 W2-1与 w1的 6
个个体聚在一起，W2的其余个体聚为一支。从聚
W1—2
W1—7
W1—8
W1—9
W1—1
W2—1
W2—1
W2—1
W1—1
W1—2
W1—4
W1—1
W1—1
W1—1
W1—1
W1—1
W2—1
W2—1
W2—1
W2—1
W2—2
W2—3
W2—6
W2—1
W2—4
W2—7
W2—1
W2—8
0，27 0，38 0．50 0，61
COeffi ci ent
图 2 卧龙沙棘2居群28个个体的聚类图
Fig．2 Clustering of individuals from 2 populations
of H．rhamnoides L．ssp．wolongensis
类结果看出，部分 Wl和 W2的个体相互聚在一起，
说明两居群间存在一定的遗传分化，但还不够显著。
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2期 陈纹等：中国特有植物卧龙沙棘自然群体的 RAPD分析 155
3 讨论
物种的分布范围是影响遗传多样性水平的主要
因子之一，自然分布范围广的物种通常比分布范围
小的物种具有更高的遗传变异水平(Man-Kyu等，
2000；Hamrick等，1989)。遗传多样性是植物长期
进化的结果，同时代表了植物的进化潜力，因而为了
物种生存，植物在较为恶劣的生境条件下进化并积
累了较多的遗传变异。卧龙沙棘生长在川西高原和
四川盆地的过渡地带 ，仅在 四川I省汶川I和茂县两地
发现，分布区狭小。其中，四川省汶川县卧龙的居群
(w1)呈星散状分布于海拔 1 660～2 200 In的山坡
基部和河滩林缘；另一居群(W2)发现于茂县，分布
于海拔 2 320~2 370 m 的山坡上，形成稀疏的沙棘
灌丛。RAPD分析的结果表明，卧龙沙棘的多态位
点百分率 PPB一78．05 ，说明卧龙沙棘具有很高
的遗传变异。Nei’S基因多样性(h一0．255 3)和
Shannon’S多态性信息指数(工一0．384 1)也反映了
卧龙沙棘具有较丰富的遗传多样性。作者对分布区
跨越很大的地理、空间距离的中国沙棘的遗传多样
性进行的研究发现中国沙棘的多态位点百分率
PPB一89．72 ，h一0．204，J一0．325(Sun等 ，待发
表)。虽然中国沙棘的 PPB值明显高于卧龙沙棘
的PPB值，但h和I都表明卧龙沙棘的遗传多样性
高于中国沙棘。可见，卧龙沙棘虽然属于分布范围
小的特有种，却具有丰富的遗传多样性。同时，卧龙
沙棘在居群水平上也具有很高的遗传多样性。虽然
只有两个居群，但卧龙沙棘在居群水平上的遗传多
样性参数均高于 Bartish等所研究 的海滨沙棘
(PPB一55．9 ，h一0．192)(Bartish等，1999)和作
者等研究的中国沙棘(PPB一55．81 ，h一0．167 9，
J一0．259 3)两个分布较广的亚种。卧龙沙棘分布
于中国沙棘分布区的边缘，该亚种很可能是由中国沙
棘边缘居群分化形成的亚种(Lian等，2003)。因此，
高水平的居群遗传多样性是卧龙沙棘在较为恶劣的
生境条件下进化并积累了较多的遗传变异的结果。
卧龙沙棘基因分化系数 Gst=0．1425，即两居
群间的遗传变异占总遗传变异的 14．25 9／6，略低于
异交植物 19．3％的平均值(Bussel，1999)，表明遗
传变异主要存在于居群内，居群间的遗传分化较小。
AMOVA的分析结果表明，全部遗传变异中，居群
间的遗传变异为 19．18 ，与 Ost显示的结果基本
一 致。聚类分析的结果同样也反映了两居群间较小
的遗传分化。Hamrick等(1990)通过对基于同工酶
分析的 165属共 449种植物的遗传多样性和遗传结
构的总结发现，生活型、分布范围等 8个因素明显影
响居群的遗传变异水平，而繁育系统是影响居群遗
传结构的最重要因素。由于基因流是使居群遗传结
构均质化的主要原因之一，具有有限基因流的物种
往往较那些具有广泛基因流的物种有较大的遗传分
化，有限的基因流是导致居群分化的一个主要原因。
卧龙沙棘基因流的分析结果表明，两居群间的基因
流为 NTn 3．007 6，仅稍低于异交、风媒植物的基
因流平均水平 (Nrn=5．380)(Hamrick，1987)。因
此，频繁的基因交流是造成卧龙沙棘居群间遗传分
化较小的原因。这一结果符合卧龙沙棘雌雄异株、
风媒传粉、兼性营养繁殖的繁育系统特点。
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2期 王文采：金佛山附地菜，重庆紫草科一新种 145
pagina basali parva inconspicua．
多年生小草本。根状茎斜生 ，细 ，长约 5cm，下
部密生丝形长 1～2cm 的细根，在节上有残留的叶
柄基部。茎 1或 2条，渐升或直立，高 9～14 cm，与
叶柄被贴伏柔毛，在基部之上分枝，有 1～2茎生叶。
基生叶约 12枚，具长柄；叶片膜质，圆卵形，近圆形
或宽卵形 ，长 0．5～1．8 cm，宽 0．8～1．5 cm，顶端圆
形或钝 ，基部圆形或近截 形 ，两面密被 贴伏短柔毛，
侧脉每侧 2～3条，不明显；叶柄长 3～5 cm。茎生
叶似基生叶，但具短柄。螺状聚伞花序顶生，具梗，
长 5～12 cm，有多数花，下部 2～4枚苞片；苞片似
茎生叶；轴和花梗细，被贴伏柔毛。花淡蓝色；花梗
长 1～3 mm；花萼宽钟状，长约 1．6 mm，5深裂近基
部或 5全裂，裂片狭长圆形或狭倒卵状长圆形，宽
0．5 mm，内面无 毛，外面被贴伏 短柔毛 ；花 冠近辐
状，无毛，筒长 0．8～1．1 mm，冠檐直径 2．5～5
mm，5裂，裂片倒卵状圆形，宽 0．8～1．8 mm，附属
物5，近新月形，长0．4 mm；雄蕊 5，着生于花冠筒中
部，花药椭圆球形，长 0．3 mm。小坚果 4，四面体
形 ，黑褐色，光滑，稍有光泽 ，无柄 ；背面三角状卵形 ，
长 0．841．1 mm，宽 0．6～0．8 mm，稍鼓起，2腹面
等大，斜三角形，棱有极狭边缘，基生面小，不明显。
重庆 (Chongqin)，南川 (Nanchuan)：金佛 山
(Jinfo Shan)，古佛洞(Gufodong)，ah 1890 m，洞口
干燥地(in dry places near cave mouth)，果黄褐色
(fruits fulvous)，1995-09—19，刘 正 宇 (Liu Zheng—
yu)151l1(主模式 holotype，PE)；同地 (same lo—
cality)，仙女洞 (Xiannudong)，ah．1970 m，阴湿处
(in shady moist places)，花 淡 蓝 色 (f1．bluish)，
1994—09—07，刘正宇 14412(副模式paratype，PE)；同
地(same locality)，仙女洞，ah．1950 m，阴湿石缝中
(in shady fissures of moist rocks)，1993一O9—23，刘
正宇 14351(副模式 paratype，PE)。
本种的叶呈圆卵形，螺状聚伞花序下部具少数
苞片，以及小坚果呈 四面体形，而与圆叶附地菜
(Trigonotis rotundata Johnst．)(产云南西北，四川
西南部)相似，但后者的叶顶端具短尖头，基部圆形
或心形，花梗较长，长 5～10 mm，花冠较大，檐部直
径 7 mm(王庆瑞 ，1989)而与本种不同。
上引采自古佛洞的主模式与采自仙女洞的副模
式的小坚果很相似，但在叶和花冠的大小方面存在
差异 ：在主模式 ，叶片长达 2 cm，宽达 1．5 cm，花冠
直径 5 mm；在副模式，叶片长达 1．5 cm，宽达 1．1
cm，花冠直径 2．5 mm。上述有关区别在上述二地
居群中是否存在变异，值得进行研究。
重庆药物种植研究所刘正宇先生惠赠金佛 山紫
草科植物标本，孙英宝先生绘图，作者深切感谢。
参考文献 ：
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(上接第 155页 Continue from page 155)
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