全 文 ：广 西 植 物 (；uihaia 25(3)：215—21 8 2005年 5月
迁地保护的金花茶遗传多样性评价
韦 霄1～2 3，韦记青2，蒋水元2，蒋运生2，唐 辉2，叶万辉1
(1．If1心科学院华南植物同．广东广州510650；2． 篝 墓广西植物研究所
广西 林 541006；3．qJ国科学院研究生院．北京 100039)
摘 要：采用 ISSR分子标记技术对迁地保护的金花茶 3个人工栽培居群进行遗传多样性分析。揭示了迁地
保护金花茶的遗传多样性水平和结构。11条引物共扩增出 87条带。其中 36条具有多态性．多态位点 比例
(P)为41．38 。单个居群的多态带百分率 I 从 21，84 到 25．29 ，平均值为 24．14 。在物种水平上．期望
杂合度和 Shannon信息指数分别为0．1 52 5和0．227 3；在居群水平上：期望杂合度和Shannon信息指数分别
为0，106 9和0．1 52 8。通过与野生居群遗传参数比较。表明该种质圃基本有效地保护金花茶的遗传多样性总
水平。遗传分化系数为0．299 0。表明迁地保护金花茶遗传变异发生在居群内的个体问占70．10 、29．90
的遗传变异发生在居群问。
关键词：金花茶；种质圃；遗传多样性；ISSR
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)03—0215—04
Genetic diversity evaluation of ex-situ
populations of Camellia nitidssima，
detected by ISSR markers
WEI Xiao ， ，u，WEI Ji—qing ，JIANG Shui—yuan2，
JIANG Yun—sheng ，TANG Hui2，YE Wan—hui1
(1．South China Botanical Garden．the Chinese Academy of Sciences．Guangzhou 510650．China；2．Guangxi
Institute of Botany．Guangxi Zhuangzu．~{ulonoDlous Region and the Chinese Academy of Sciences．Guilin
541006．China；3．Graduate School of the Chinese Academy 0．厂Sciences，Beijing 100039，China)
Abstract：Genetic diversity of 3 ex—situ population of Camellia nitidssima was detected by ISSR markers．87
bands were generated by 1 1 ISSR primer．of which 4 1．38 bands were polymorphie．The percentage of poly—
morphie bands(P)was from 21．84 to 25．29％，24．14 on average at the population leve1．Expected het—
erozygosity(Hi)and Shannon’S information(Ho)were 0．152 5 and 0．227 3 respectively at specific level，0．106
9 and 0．1 52 8 at population leve1．Compared with the parameters form natural population．the germplasm
nursery maintained most genetic diversity of Camellia nitidssima．More than 70 of genetic diversity resided
among individuals within population．
Key words：Camellia nitidssima；germplasm nursery；genetic diversity；ISSR
金花茶属山茶科山茶属金花茶组(Theaceae，
Camelia，sect．Chrysanth“Chang)植物 (张宏达，
1979)，为常绿灌木或小乔木。是世界上著名的观赏
植物。山茶科植物的花色有深红、粉红、白色、复色
收稿日期：2005—0卜25 修订日期 ：2005—04—10
作者简介：韦 霄(1967一)．男．广西天峨县人、副研究员．博士生．主要研究方向：经济植物的引种驯化和濒危植物的保护生态
学．E—mail：weixiao@scbg．ac．cn。 通讯作者 E—mail：why@scbg．ac．cn
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216 广 西 植 物 25卷
等多种颜色，但缺少黄色。虽然早在中国明朝李时
珍所著《本草纲 目》就记载过黄色山茶，然而 自1933
年首 次在 广西 防城 采 到 金 花 茶标 本 (左 景烈
23483)，1948年戚经文先生(叶创兴，1997)发表定
名为Camellia nitidssima Chi，以后较长时期内未引
起广泛的重视。黄色的山茶花金花茶于 1960年在广
西邕宁再次发现，并于 1965年正式发表。这一发现
引起了国内外植物学界和园艺学界的关注，尤其引起
国际山茶学会的高度重视。金花茶被誉为“茶族皇
后”，轰动了世界各国的园林界，称金花茶为“植物大
熊猫”。目前世界各地相继引种，并利用金花茶的黄
色基因，培育出新的品种，成为茶族中的一支独秀。
金花茶组植物是世界珍稀的观赏植物和种质资
源，资源量十分有限。1998年山茶科山茶亚科的
《中国植物志》出版，书中记录了分布于中国的金花
茶组植物共 16种，其中金花茶系 15种(张宏达等，
1998)。其中金花茶列为国家一级保护植物(傅立
国，1992)。金花茶产于我国广西南部和越南北部。
主要分布于广西的邕宁、防城、东兴、扶绥和隆安等
县(市)(梁盛业，l993)。分布区范围极为狭窄。金
花茶主要生于沟谷两旁及附近山坡常绿阔叶林中。
由于金花茶自身生物学特性和自然、人为因素的影
响，在其分布区一般呈星散分布，单位面积个体数目
少，稀有大的居群分布 目前其分布区正逐渐缩小。
金花茶种质资源保护已是势在必行。
广西植物研究所的科研人员从 l980年开始从
事金花茶组植物的研究工作，已完成了金花茶组植
物资源调查、种质资源收集、引种驯化等方面的研
究，取得多项科研成果。目前已经把天然分布于热
带季雨林中的金花茶组植物引种到中亚热带的桂林
雁山，成功地建立了2 hm 的金花茶组种质圃，为中
亚热带地区保存和利用金花茶种质资源做了开创性
工作，为开展育种、分类系统研究奠定了基础。
本项研究以建成的金花茶组植物种质圃的 3个
金花茶居群为研究对象，采用简单重复问序列(inter-
simple sequence repeat，ISSR)分子标记技术，揭示迁
地保护的金花茶的遗传多样性和遗传结构状况。
1 材料与方法
I．I金花茶种质圃概况
种质圃设在广西桂林雁山广西植物研究所，25。
11 N，1i0。12 E，属于中亚热带气候区。据气象观
测资料，试验地年平均气温为 19．2℃，绝对最高气
温为40．0℃，绝对最低气温为一6℃，冬季有霜冻，
月平均气温高于 2O℃有 6～7个月；年均降雨量为
1 865．7 mm，年相对湿度 78 。种质圃金花茶为实
生树。种子采 自广西防城、东兴、邕宁、防城等县
(市)。目前大部分已开花结果。
1．2样品采集
实验材料取自于金花茶种质圃三个区域(划分
为三个居群)的金花茶单株的叶子。每个居群各取
2O个个体的新鲜叶片，迅速装入封口袋。分别用硅
胶迅速干燥固定，带回实验室分析。
1．3总 DNA提取和 PCR扩增
用改进的 CTAB法(Doyle，1991)提取金花茶
总 DNA。通过 1 琼脂糖电泳检查 DNA的完整
性，一2O℃保存备用。经过比较和优化，确定为2O
L的PCR反应体系为：反应体积为2O L，内含2O
ng的模板 DNA，10mM Tris—HCI(pH9．0)，50Mm
KCl，0．1 Triton X一100，2．7M MgCI，，0．1mM
dNTPs，2 formamide，200nM primer and 1．5 u—
nits of Taq polymerase，扩增反应在 PTC—lO0型
PCR仪上进行。每个引物均设一个空白对照反应，
以排除系统误差。从哥伦 比亚大学提供的 lO0个
ISSR引物中筛选出 l1个(UBC#．808、834、835、
836、840、841、848、855、857、866、880)能获得清晰
条、产生多态的引物。扩增程序为：首先 94℃变性
5 min，然后进行 35个循环：94℃ 30 S，51～53℃
(视不同的引物而定)45 S，72℃ 90 S。最后 72延伸
10 min。扩增产物在含有 EB(ethidium bromide，
0．1 tg／ml )1．5 的琼脂糖胶上，以0．5× FBE为
电泳缓冲液检测分离，以 lOObp DNA I adder(i00
～ l 500bp)(上海生物工程工司)作为相对分子质量
标准。最后用紫外成像系统(LabWorks Software
Version 3．0 UVP，Upland，CA 91786，USA)照相，
保存图像。
1．4数据处理和分析
ISSR为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁
移率一致的条带被认为具有同源性，属于同一位点
的产物并按扩增阳性(1)和扩增阴性(0)记录电泳带
谱，形成 ISSR表型数据矩阵用于进一步分析。采
用 POPGENE V．1．31软件(Yeh等，1999)计算出
金花茶各个居群的平均等位基因数(Ao)、平均期望
杂合度(H )、多态位点百分率(PPB)。在物种水平
上整个居群的遗传变异(H )、居群内遗传多样性
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3期 韦 霄等：迂地保护的金花茶遗传多样性评价 2l7
(}is)、遗传分化系数(Gst)．以及 Nei’S遗传一致度
(1)H及Shnnnon多样性指数
2 结果
2．1 ISSR—PCR扩增结果
从 100个引物中筛选出了 l1个扩增良好的弓I
物．用于金花茶遗传多样性的检测 1】个引物扩增
了3个盆花茶居样 60个个体，共扩增出DNA片段
87条．平均每个引物扩增出7．9l条带，扩增片段长
度在 230～ GO0 bp碱基对之问 其中 36条具有
多态性，多态位点百分数(P)为4I．38
2，2金花茶遗传多样性水平分析
采用 )P{；ENEv1 3 L软件计算得出的居群内
的遗传多样性结果见表 1。多志位点百分率虽是遗
传多样性帕一个粗略恬计．髓引物选择标准会有较
大差异，但可以比较正确的显示物种内居群内和居
群问的遗传多样性水平 金花茶 3个栽培居群中，
单个居群的多态带百分率 P从 21．84 到2j．29 ，
平均值为2{．1 4 等位基因平均数从 1．1 82 2到
豪 I 金花茶屠群内遗传变异
Table I (~-enetie、 ri~hililv wil bin populal hms of Ua~nellia~Ktidssima detected by ISSR analysis
。^：地弗到的母 帕等恤 数Observ t】洲n·b f ele[c~perlun Ae：每十 点帕_彳f数等位 数The eIK~ti⋯ ⋯ ber of ale[es
p。r locus=hE平均l9】 虚 Expec~。 I beterozygoslty．H0：Shannon多样性抖千船 Shah：ran’ inform ndon ind e~lP多志垃 再分半 r⋯ 1 Be
【 f l ul ll lf l 1 I
1．2l2 2．平均{il=c为1．】97 2 平均蛐望杂台度指数
H 值从 0．098 3到 0．1i 4 1，平均值为 0．106 9。
Shannon多样性(I【0)指数整个居群的遗传多样陛
值从0．1；0 0到0．】62 4，居群水平七平均值(H )
为0．1j2 8。在物种水平上，多态枯百分率 P为
4【．38 ；有效等位基因数(Ae)为 1．258 8；期望杂
音崖指数 Il 值为0．1 52 j；shannon多样性指数
¨{sp)为0．227 3
2．3遗传结构分析
3个金花茶居群间的遗传分化状况由总的遗传
多样I生(H r)，居群内遗传多样性(H ，屠群问基因
分化比例(G )描述 采用 POPGENEv】．3I软件
带-兰
一
～
物
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2 1 8 广 西 植 物 25卷
对金花茶3个栽培居群 60个个体的居群间遗传多
样性分析的结果为 HT一0．152 5，Hs一0．106 9，GsT
一0．299 0。在总的遗传多样中，有 29．90 来 自于
居群之问，也就是说总的基因多样性 70．10 存在
于居群内。
3 讨论
ISSR分子标记是由 Zietkiewicz等(1994)创建
的一种简单序列重复区间扩增多态性分子标记。其
基本原理在 SSR的5 或 3 端加锚 1～4个嘌呤或嘧
啶碱基，然后以此为引物，对两侧具有反向排列排列
的 SSR之间的 D A序列进行 PCR扩增，而不是扩
增 SSR本身，它在引物设计上比 SSR技术简单得
多，不需知道 DNA序列即可用引物进行扩增，又可
以揭示比 RFLP、RAPD、SSR更多的多态性，。该
技术具有 DNA样品用量少，操作简单，无需预先知
道受试基因组 DNA序列，结果记录方便，能提供丰
富的关于基因组的信息等优点。近年来，已广泛应
用于植物品种鉴定(Mondal，2002)、遗传作图(Koji—
ma等，1998)、基因定位(Ratnaparkhe等，1998)、遗
传多样性(Ge等，2003；Wang等，2004)等研究。
本研究证明了 ISSR分子标记技术有效地提供
迁地保护金花茶的遗传多样性。我们曾采用同样的
技术对金花茶 12个天然居群的遗多样进行了分析
(见另文报道)，结果为：P一63．22％，HE一0．156 1。
本实验结果为：P=41．38 9／6；HT一0．152 5。略低于
天然居群相应各值。这一结果表明种质圃基本有效
地保护金花茶的遗传多样性总水平。迁地保护基本
成功。造成迁地保护居群遗传多样总体水平略低于
天然居群可能有以下原因：第一，位于隆安县的居群
由于人为干扰严重，植株未见开花结实，种子至今未
能采集到。第二，迁地保护金花茶采用的是种子繁
殖，采样过程中有可能会采 自同一株母树有性繁殖
的植株，从而降低了单位引物多态位点比率。为保
护这一珍稀濒危植物，还应进一步继续加强金花茶
种质资源的收集工作，特别是收集隆安县的天然居
群的种源，采取插条，进行扦插繁殖。
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