全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22 ( 3 D , 256 - 258 2002 年 5

月
农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报
贺 红19 韩美丽29 李耿光3
( 1. 广州中医药大学中药学院9 广东广州 510405; 2. 广西林业科学院9 广西南宁 530001;
3. 中国科学院华南植物研究所9 广东广州 510650 D
摘 要 , 用红江橙实生苗的上胚轴为材料9初步研究以根癌农杆菌介导的 GUS基因转化, 结果表明 , 以卡那
霉素作为选择试剂进行选择培养时9Km 浓度为 50 mg/L;外植体以平放为好;抑菌剂选择头孢霉素较好,
GUS基因瞬时表达检测970. 4%的外植体呈阳性反应; GUS基因稳定表达检测9在获得的 12 株抗性植株中9
GUS反应呈阳性所占比例为 16. 7% ,
关键词 , 红江橙 ; 农杆菌; 遗传转化
中图分类号 , G943. 1 文献标识码 , A 文章编号 , 1000-3142( 2002D 03-0256-03

Prel iminary study on the Agrobacterium-mediated
genetic transformation of citrus sinensis
Osbeck cv. Hongjiang
~E ~ong19 ~AN Mei-li29 LI Geng-guang3
( 1. college of chzneSe Mate1za Meczca9 Guang hou unzUe1Szty of T1acztzonal chzneSe Meczczne9 GuangZhou 5104059
China; 2.Fo1eSt1y Acacemza of GuangIz9 Nanning 5300019 China; 3.South chzna InStztute of Botany9
Acacemy Sznzca9 GuangZhou 5106509 China D
Abstract, The tranSformation of GUS gene by Ag1obacte1zum-mediated WaS Studied. The explantS uSed for
tranSformation Were the epicotylS f rom czt1uS SznenSzS OSbeck cv. Hongjzang. The reSultS indicated that the con-
centration of kanamycin uSed aS the reagent of Selection WaS 50 mg/L; When the explantS Were cultured on the
Selection medium9 they placed horiZontally better than they oriented With their apical endS protruding f rom the
medium. Cefotaxime uSed aS antibioticS WaS better than carbenicillin. ~iStochemical GUS aSSay ShoWed that
70. 4% of the explantS had the tranSient expreSSion of GUS gene and 16. 7% of the 12 reSiStant plantS Were
GUS-poSitive.
Key Words, czt1uS SznenSzS OSbeck cv. Hongjzang; Ag1obacte1zum; genetic tranSformation
红江橙是华南地区推广的优良柑桔品种9其果
实外形美观9风味独特9深受国内外消费者的欢迎9
然而由于它是橙与桔的嫁接嵌合体9性状不稳定9
同时在抗病性方面也有待改良9传统的育种办法很
难从根本上解决问题, 近年来9基因转移改良柑桔
农艺性状的技术9为柑桔育种开辟了一条新途径,
前人在同科植物枳橙 甜橙 贡柑及枳壳方面已做
了部分工作 1~ 5 9但对于红江橙的遗传转化9尚未见
收稿日期 , 2000-12-04
作者简介 , 贺 红( 1967-D 9女9江西永新人9博士9副研究员9主要从事植物细胞工程研究,
基金项目 , 国家自然科学基金项目(编号 , 39870539D
报道 本试验以红江橙上胚轴为材料 ~ 初步研究了
GUS基因对红江橙的转化过程 ~ 为建立高效的转化
系统 ~ 导入有价值的目的基因 ~ 获得具有预期性状
的优良品种创造条件
1 材料与方法
l. l 植物材料
红江橙种子经表面消毒培养无菌苗 ~ 当苗长至
一定大小时 ~ 采取上胚轴切成约 1 cm 长的小段作转
化的外植体
l. 2 离体再生培养
分 3 步进行:D上胚轴切段诱导芽分化; @芽伸
长; 芽生根 在MT+BA 1 mg/L 培养基上诱导出
芽后 ~ 转入芽伸长培养基MT+GA3 1 mg/L~ 待芽长
到 2 3 cm 时 ~ 置于生根培养基 MT+NAA 0. 5 1
mg/L 诱导生根
l. 3 细菌菌株及培养
农 杆 菌 菌 株 为 EHA101~ 含 有 质 粒 载 体
pGA482GG~ 质粒上插入了 GUS及 NPTI 基因 菌
株在含 50 mg/L 卡那霉素的 YEP 培养基上繁殖保
存 ~ 感染前 ~ 在 YEP 液体培养基中 ~ 28 C振荡 20
25 h~ 达到菌对数生长期 ~ 培养物即可用于感染
l. 4 外植体的转化
将红江橙上胚轴切段浸入到准备好的菌液中
20 min~ 随后转到无菌滤纸上以吸掉多余的菌液 ~ 将
外植体接种于 MT 培养基上共培养 3 d 后 ~ 再转到
含卡那霉素 ( Kanamycin~ Km) 50 mg/L 和头孢霉素
(Cefotaxime~ Cx) 300 mg/L 的选择培养基上 ~ 诱导
抗性芽的产生
l. 5 组织化学法检测 GUS活性
GUS组织化学染色法参见<植物遗传转化技术
手册> E 6I
2 结果与分析
2. l 选择培养基中卡那霉素浓度的确定
本试验观察了不同浓度的卡那霉素对红江橙
上胚轴出芽的影响 ~ 外植体在培养基中的放置方式
分两种:平放 ~ 竖放(以形态学下端朝下垂直插入) ~
1个月后统计结果(表 1) 在无 Km 的对照中 ~ 出芽
率较高; Km 处理中 ~ 平放时 ~ Km 25 mg/L~ 仅个别
外植体有芽形成 ~ 当 Km 增加至 50 mg/L 以上时 ~
所有外植体均无芽形成 ~ 逐渐变白 外植体竖放时 ~
Km 50 mg/L 时 ~ 仍有 57. 1%的出芽率 ~ 随着 Km 浓
度的升高 ~ 白芽数增加 ~ Km 升至 125 mg/L 时 ~ 仍有
部分出芽 说明竖放外植体 ~ 对 Km 的抗性增加 ~ 这
可能因为竖放时 ~ 外植体只一端接触培养基; 而平
放时 ~ 外植体与培养基充分接触 ~ 低浓度的 Km 就表
现强的抑制作用 因此转化试验 ~ 外植体选择培养
以平放为好 ~ 以 Km 50 mg/L 作为常用的选择水平
表 l 不同浓度卡那霉素对出芽的影响
Table 1 Ef fect of kanamycin concentration
on Shoot formation
外植体放置方式
Explant orientation
卡那霉素浓度
Km concentration
(mg/L)
出芽率(% )
Freguency of
Shoot formation
水平放置 0 64. 0
Horizontal 25 2. 0
50 0
75 0
形态学下端下插 0 96. 3
Apical end of the 50 57. 1
Segment protruding 100 47. 4
125 19. 0
2. 2 羧苄青霉素和头孢霉素对芽分化的影响
在用农杆菌转化植物细胞时 ~ 常用羧苄青霉素
和头孢霉素抑制农杆菌的生长 试验结果表明 ~ 两
种抗菌素在浓度为 500 mg/L 时 ~ 对外植体出芽均
无明显影响 抑菌试验中 ~ 300 mg/L 的头孢霉素能
完全抑制农杆菌的生长 ~ 而相同浓度的羧苄青霉素
杀菌效果不太好 ~ 农杆菌仍少量生长 因此 ~ 红江橙
转化试验中 ~ 抗菌素采用头孢霉素较好 ~ 浓度为 300
mg/L
2. 3 农杆菌感染和抗性植株再生
外植体与农杆菌共培养后 ~ 在选择培养基上进
行培养 (图版 I : 1) ~ 出芽过程大大延缓 ~ 1 个多月
后才可看到抗性芽的产生(图版 I : 2) 从表 2 可以
看出 ~ 未经感染的外植体 (对照) ~ 在选择培养基上
未分化出芽 ~ 经感染的外植体 ~ 分化频率仅 2. 5%
随后 ~ 每过两周更换一次培养基 ~ 随着选择次数增
加 ~ 部分再生芽变白 ~ 死亡 待芽长至 2 cm 左右 ~ 从
外植体上切下插入生根培养基 用上述方法 ~ 最终
获得 12 株红江橙抗性植株
2. 4 GUS基因表达检测
外植体与农杆菌共培养 3 d 后 ~ 进行 GUS基因
瞬时表达活性的检测 ~ 取部分外植体进行 GUS检
7523 期 贺 红等: 农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报
测 * 发现 70- 4%的外植体 * 在切口处细胞中可测到
GUS活性 * 显蓝色(图版 I : 3) O
转化处理获得的抗性植株生长 5 个月后 * 进行
GUS基因稳定表达活性的检测 * 结果表明:经组织
化学染色 * 12 株抗性植株中 * 2 株呈阳性 * 10 株呈阴
性 * 占 16- 7% (图版 I : 4) O
表 2 农杆菌感染的外植体再生芽情况
Table 2 Induction of shoot f rom epicotyl explants
infected by o acte m t mefac ens
外植体数
No of explants
产生绿芽外植体数
No of explants With
green shoots
转化再生频率
Freguency of shoot
regeneration(% )
对照 Control 152 0 0
处理 Treated 804 20 2- 5
3 讨 论
目前植物基因工程发展中 * 基因型的依赖性被
公认为是主要限制因子之一 O 本试验在红江橙的转
化研究中 * 外植体抗性芽再生频率仅 2- 5% ; GUS
基因稳定表达检测中 * 在获得的 12 株抗性植株中 *
GUS反应呈阳性所占比例只为 16- 7% O 采用同样
的方法 * 我们用农杆菌感染枳壳 * 获得了较高的感
染效率 * 外植体抗性芽发生率为 14- 2% * 其中 GUS
反应呈阳性所占比例为 70- 0% 5 O 说明农杆菌介导
的转化技术在较大程度上受到农杆菌宿主专一性
的限制 O
在用农杆菌转化植物细胞时 * 常用羧苄青霉素
和头孢霉素抑制农杆菌过量生长 O 程振东等 7 在用
根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化中 * 发现两者除了
抑制农杆菌的生长外 * 还影响植物的生长发育 * 头
孢霉素易于引起伤口细胞褐化死亡 * 抑制芽的分
化;而羧苄青霉素则促进芽分化 * 抑制生根 * 因此他
们认为 * 在转化过程的不同阶段最好用不同的抗菌
素作抑菌剂:诱导茎芽分化时羧苄青霉素较好 * 诱
导生根时头孢霉素较好 O 而我们在红江橙转化中并
没有出现类似的结果 * 头孢霉素不仅杀菌效果好 *
而且对芽的形成无不良作用 * 说明抗菌素应用于不
同植物类型 * 对生长发育可能有不同的影响 O
参考文献:
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852 广 西 植 物 22 卷
贺 红, 等 , 农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报 图版 I
~E ~ong, et al. , Preliminary study on the aglobactelz~n-mediated genetic Plate I
transformation of cztl~s sznenszs Osbeck cv. Pongjzang
1-经农杆菌感染的红江橙上胚轴 ; Z -在选择培养基上获得的抗性芽 ; 3-GUS基因在被感染的上胚轴
中的瞬时表达 ; 4-GUS基因在抗性芽及抗性植株叶片和茎段中的稳定表达,
1-Epicotyls of cztl~s sznenszs Osbeck cv Pongjzang to aglobactelz~n infection; Z -Putatively transformed shoots
on selection medium; 3-Transient expression of GUS gene in the infected epicotyls; 4-Stable expression
of GUS gene in the shoot, leaf and stem segments f rom resistant plant.
农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报
作者： 贺红， 韩美丽， 李耿光
作者单位： 贺红(广州中医药大学中药学院,广东广州,510405)， 韩美丽(广西林业科学院,广西南宁
,530001)， 李耿光(中国科学院华南植物研究所,广东广州,510650)
刊名： 广西植物
英文刊名： GUIHAIA
年，卷(期)： 2002,22(3)
被引用次数： 4次

参考文献(7条)
1.李耿光;Chen R;贺红 农杆菌介导几丁质酶基因转化的柑桔植株 1999(07)
2.高峰 甜橙不定芽的高频率诱导及其离体遗传转化 1993
3.Pena L;Cervera M;Juarez J Agrobacterium-mediated transformation of Sweet Orange and Regeneration
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4.余焰华;郭惠珊;邹韵霞 外源基因导入贡柑体胚及其人工种子构建的初步研究 1992(01)
5.贺红 枳壳外植体离体再生及农杆菌介导的遗传转化[期刊论文]-云南植物研究 1998(4)
6.傅荣昭;孙勇如;贾士荣 植物遗传转化技术手册 1994
7.程振东;卫志明;许智宏 根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生 1994(09)

引证文献(4条)
1.彭爱红,曹立,许兰珍,邹修平,雷天刚,何永睿,姚利晓,陈善春 短童期柑桔资源“早花枳”遗传转化技术体系的
建立[期刊论文]-中国南方果树 2014(03)
2.理莎莎 红果肉中华猕猴桃实生苗遗传转化体系建立的研究[学位论文]硕士 2008
3.牙祖韧 厚荚相思离体培养及农杆菌介导遗传转化技术的研究[学位论文]硕士 2007
4.盖照 红江橙嵌合体及其衍生材料的遗传背景分析[学位论文]硕士 2008


引用本文格式：贺红.韩美丽.李耿光 农杆菌介导红江橙遗传转化的研究初报[期刊论文]-广西植物 2002(3)