全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(6)：832—836 2008年 11月
荔枝生物技术研究进展
王家保 ，贾彩红，徐碧玉，金志强，李美英
(中国热带农业科学院 热带生物技术研究所 ，海口 571101)
摘 要：综述了离体培养 、有利基因的克隆及遗传转化等生物技术的三个方面在荔枝研究中的应用进展。已
有研究者分别建立了花粉培养、叶片培养、幼胚培养等获得植株的再生体系，克隆了部分荔枝基因，建立了基
因枪与根癌农杆菌转化体系。这些研究为荔枝生物技术育种提供了基础。
关键词：荔枝；生物技术；离体培养；基因克隆；遗传转化
中图分类号 ：Q8l3 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)06-0832—05
Advances in biotechnological research on
Litchi(Litchi chinensis)
Ⅵ NG Jia-Bao ，JIA Cai-Hong，XU Bi_Yu，
JIN Zhi-Qiang，LI Mei—Ying
(Institute of Tropical Biosciences and Biotechnology，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou 571101，China)
Abstract：The advances in research on in vitro culture，gene cloning and genetic transformation of litchi were reviewed
in this paper．Plant regeneration from pollen，leaves and young embryo had already been succeeded．Some useful
genes had been cloned and the genetic transformation mediated by particle bombardment and Agrobacterium tumefa—
ciens infection had been constructed．The problems and prospects of litchi biotechnology were also discussed．
Key words：litchi；biotechnology；in vitro culture；gene cloning；genetic transformation
荔枝是华南重要的果树之一，在农业经济中占
有重要地位。但栽培荔枝仅有 1个种，遗传基础比
较单一，且花小、坐果率低，加上实生苗的童期较长，
杂交育种较为困难，使得许多优良种质不能在荔枝
育种中快速应用。克隆有利基因，通过生物工程技
术如原生质体融合、转基因技术等培育具有特殊性
状的荔枝新种质将会极大加快荔枝育种进程。本文
仅对荔枝生物技术研究进展做一综述。
离体培养的研究进展
1．1花药培养再生
傅连芳等(1983)将岵山醮核与莆田陈紫的荔枝
单核靠边期花药接种在 MS+KT2．0 mg／L+2，4一
D2．0 mg／L+NAA0．5 mg／L+蔗糖 30 g／L的培养
基上培养，3周后即出现体细胞愈伤组织，2个月后
又出现颗粒状愈伤组织。将两种愈伤组织转入 MS
和改 良B5附加 KT0．5 mg／L+NAAO．1 mg／L+蜂
皇浆 400 mg／L+水解酪蛋白(LH)500 mg／L的分
化培养基上进行培养，体细胞愈伤组织不能进行器
官分化，而颗粒状愈伤组织经 3O d左右分化出胚状
体。胚状体转入 MS和改良B5培养基附加蜂皇浆
400 mg／L十谷氨酞胺 500 mg／L+LH500 mg／L的
生长培养基进一步培养出芽；最后用 1／2改良B5
或 2．5倍 White大量元素附加 KT0．1 mg／L+
IAA0．01 mg／L+LHS00 mg／L+谷氨酰胺 l 600
收稿Et期：2007-09-07 修回日期：2008—03—14
基金项目：国家自然科学基金(30460085)；海南省教育基金(Hi200534)；中央级公益性科研院所基本业务费专项(ITBBZD2007—3—1)[Supported by the
National NaturalSCience Foundation ofChina(3O460o85)；FoundationforEducation ofHainanProvince(Hj200534)；Special Fundforthe Basic ScientificRe—
search of National Non-profit Institutes from Chinese Government]
作者简介：王家保(1974-)，男，山东鄄城人，博士，助理研究员，从事果树生物技术研究工作。
通讯作者(Author for c0rrespondence，E-mail；jbwang2@163．corn)
6期 王家保等：荔枝生物技术研究进展 833
mg／L进一步分化成具根、茎、叶器官的完整植株，
共获得 24株，大部分是单倍体植株。多次继代的愈
伤组织细胞中二倍体较少。
谢玉明等(2006)利用单核期的妃子笑花粉诱导
出了胚性愈伤组织、胚状体及完整植株。同时发现
活性碳及谷氨酰胺促进体胚形成，但水解乳蛋白、蜂
皇浆及水解酪蛋白不利于体细胞胚形成与生长。获
得的胚性愈伤组织中单倍体、二倍体及三倍体细胞
均有。俞长河等(1997)也用荔枝的花药诱导出愈伤
组织，并发现幼龄树的花粉更易诱导胚性愈伤组织，
在培养基中添加一定的硫代硫酸银可提高胚性愈伤
组织的诱导率，这种作用可能与硫代硫酸银抑制乙
烯生成有关。
1．2叶片培养再生
Puch00a(2O04)以无菌播种生长的大造幼苗幼
叶为外植体，详细研究各种因素对叶片再生的影响，
最终获得了再生植株。先用含 Tween20的 1．5
次氯酸钠浸泡 15 rain消毒，然后在无菌水中冲洗 3
次除菌，再置人 MS+维生素 C+柠檬酸 225 mg／L
培养 1～2 h+蔗糖 30 g／L+琼脂糖 2．5 g／L，或在
固体培养基上培养几个小时后，当外植体分泌大量
酚类物质时取出，于维生素 C 225 mg／L+柠檬酸
225 mg／L中冲洗后再次接种，可有效防止褐变。诱
导培养基的最佳配方为 MS+2，4一D1．5 mg／L+6一
BA1．0 mg／L+蔗糖 3O g／L+琼脂糖 2．5 g／L，2O～
25 d 68 外植体大量产生愈伤组织，其中多为胚性
愈伤组织及体细胞胚，特征是细胞壁厚、无淀粉粒、
具大液泡。分化培养基 的最佳 配方是 MS+6一
BA2．0 mg／L+3．0 mg／L+蔗糖 30 g／L+琼脂糖
2．5 g／L，接种 30 d后 8O 愈伤组织再生出芽，2周
后长出嫩茎。生根培养基最佳 配方是 MS+6一
BA2．0 mg／L，3周内生根率达 76 。生根的幼苗
在等量混合的泥碳、地衣、蛭石介质中炼苗时成活率
达 4O 9／6。1．0～3．0 mg／L的 NAA也可大量诱导生
根，但根较纤细，炼苗时不能成活。
苏明申等(2005)研究指出，成年元红荔枝幼叶
的中段及靠近叶柄的后段可诱导产生愈伤组织，而
实生苗刚转绿幼叶的各部分、未转绿幼叶中段、幼茎
均可诱导产生愈伤组织，以刚转绿幼叶中段为外植
体且叶背朝向接种诱导效果最好。但产生的愈伤组
织较差，未能进一步分化出胚状体。
1．3幼胚培养再生
1．3．1外植体的选择 幼胚培养比其它组织更易诱
导胚性愈伤组织，获得体细胞胚(俞长河等，1997；邝
师哲等，1997)。诱导的效率与胚的发育时间有关，
糯米糍荔枝在 30 d左右最佳(周俪依等，1996)。不
同品种的幼胚诱导率也不同，下番枝最高，乌叶最低
(俞长河等，1997)。
1．3．2胚性愈伤组织诱导与保存 幼胚培养一般以
MS为基本培养基，50 g／L蔗糖为最佳用量，过高过
低都不利于愈伤组织的诱导。常用 2，4-D为诱导生
长调节剂，最佳用量在 2～8 mg／L的范围内(邝师
哲等，1997；俞长河等，1997；周俪依等，1996；刘华清
等，1997)，因品种而异。低浓度的生长素类对胚性
愈伤的诱导起促进作用(邝师哲等，1997；俞长河等，
1997)。液体震荡培养有利于胚性愈伤组织产生(周
俪依等，1996)。诱导的胚性愈伤组织淡黄色小颗粒
状，较为松散(俞长河等，1997；刘华清等，1997)。在
附加生长调节剂的固体培养基上长期继代，或液体
震荡培养长期继代，胚性愈伤组织生长逐渐减慢，逐
渐丧失形态发生能力(黄素华等，2003；刘华清等，
1997)。交替培养可维持愈伤组织的生长势与胚性，
即：在无生长调节剂的培养基上继代 3～4次，然后
转入含 2 mg／L的 2，4一D和 29．4 umol／L的硫代硫
酸银或 l mg／L的BA的培养基上培养 l～2代；或
液体震荡培养 5～6代后再固体培养基培养 1代(刘
华清等，1997；俞长河等，1998；Yu等，2000)。在继
代培养基中降低 2，4一D的浓度也可保持愈伤组织的
生长势(周俪依等，1996)。荔枝胚性愈伤组织中具有
旺盛分裂能力的胚性细胞位于外缘(曾黎辉等，2002；
邓朝军等，2006)，有利于根癌农杆菌的侵染转化。
胚性愈伤组织中存在较高的染色体数目变异。
单、二、三、四倍体及非整倍体细胞均有。染色体变
异在非胚性愈伤组织中高，继代次数增加、较高浓度
的2，4一D、2，4一D与 NAA混合使用都可提高变异
率。外植体类型与品种来源影响染色体变异率，花
药培养的愈伤组织高于幼胚培养获得的愈伤组织，
而元红低于下番枝(黄素华等，2003)。
1．3．3体细胞胚的诱导、成熟及成苗 从胚性愈伤
组织生成体细胞胚大致需经2个阶段。第一阶段是
胚性细胞团的诱导阶段。在 2，4一D的存在下，淡黄
色或黄色、疏松的胚性愈伤组织经过暗或光培养一
段时间，可形成许多颗粒状的胚性细胞团，与周围细
胞有明显的界限。这些胚性细胞团进一步分化，形
成许多球形胚和梨形胚聚集在一起。第二阶段是胚
状体的发育成熟：将第一阶段培养获得的胚性细胞
834 广 西 植 物 28卷
团继代于只附加 NAA和 IBA的培养基上，胚状体
一 步发育形成表面光滑的各个时期的胚状体(邝哲
师等，1996；邓朝军等，2006)。由于分化不同步，球
形胚、梨形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶期胚状体等
各种类型会同时出现。
2，4一D抑制体细胞胚的进一步发育，使其仅滞
留在球形胚或梨形胚阶段(邝哲师等，1997；周俪侬
等，1996；赖钟雄等，2003)。而低浓度的 NAA、IBA
及 ZR可促进体胚的发生(周俪侬等，1996；赖钟雄
等，2003)。培养基中蔗糖浓度过低会使胚状体玻璃
化，而琼脂浓度过高，则降低体细胞胚的生成量(赖
钟雄等，2003)。震荡培养有利于体细胞胚的发生
(周俪侬等，1996)。车建美等(2005)研究了体细胞
胚发生过程中的几种内源激素含量的变化，发现
IAA、ABA、玉米素(ZT)、二氢玉米素(DHZT)的含
量变化分别在 40．1～694．0、14．6～452．9、20．7～
262．1、11．5～118．8 ng／gFW 之间，不 同的 内源激
素含量变化规律有差异，但总体上，体细胞胚发生过
程中ABA／IAA和 ABA／CTK的值较高有利于球
形胚的发生。
荔枝异常体细胞胚 的比例较高 (赖钟雄等，
2003)，同一发育阶段的不同体细胞胚 POD与 EST
同工酶谱变化较大(黄素华等，2002)，可能由胚性愈
伤组织中存在较大的染色体变异引起(黄素华等，
2003)。但二倍体细胞在培养过程中似乎具有选择
优势，随培养时间的延长，二倍体细胞逐渐增多(黄
素华等，2003)。
体细胞胚的成熟在无生长调节剂的 MS培养基
上即可进行，但效果较差。MS基本培养基-9 100
mL／L椰子汁成熟效果好，在成苗培养基上萌发率
达 5 (赖钟雄等，2003)。生根培养常用半量 MS
培养基与低浓度生长素类生长调节剂相结合(邝师
哲等，1997)或直接用无生长调节剂的 MS培养基
(赖钟雄等，2003)，可萌发成为具有根、茎、叶的完整
小植株 。
1．4原生质体培养
俞长河等(1996)首次报道了荔枝原生质体再生
植株获得成功。研究者利用下番枝幼胚诱导继代的
胚性愈伤组织建立了胚性悬浮细胞系，以继代 3～4
d的胚性悬浮细胞为分离原生质体的起始材料，以
CPW盐+甘露醇 l1 +纤维素酶 0．8 9，6-9离析酶
0．4 为酶液组合解离，经离心法收集原生质体。原
生质体得率为 10 x i0。～15×10 ，成活率为 92 9／6～
97％。采用 1．8 的褐藻酸钙包埋和饲养细胞共培
养的方法有效地促进了原生质体持续分裂，并形成
小愈伤组织。少数原生质体可直接发生体胚。小愈
伤组织释放后转移至固体培养基，继代增殖后，在分
化培养基上体胚分化率为 i00 。少数体胚在诱导
培养基、成熟培养基和萌发培养基上培养 2～5个
月，先出根后抽茎展叶，最终再生出完整植株。后
来，作者又对研究体系进行了优化，获得了更好的结
果(俞长河等，1998；Yu等，2000)。通过电融合技
术，赖钟雄等(2001)获得了龙眼和荔枝原生体融合
杂种细胞的细胞团。
I．5其它离体培养
余亚白(1991)研究了茎段培养的效果。外植体
以新抽生嫩叶的刚转绿新梢顶端 2cm左 右茎段最
佳，接种于 MS-9BA0．5 mg／L-9IBA0．2 mg／L培
养基上，茎段萌芽率 9O 以上，37 9／6的芽能长成 2
cm以上，带 2～3片叶的幼茎。0．6 mg／L的 GA
对萌芽有促进作用。幼茎接种于生根培养基 MS+
IBAI mg／L-9NAA0．5 mg／L上 ，1～2个月后即可
生根。
2 荔枝重要功能基因的克隆与表
达分析
有关于荔枝基因克隆与表达分析的研究较少，
多集中在通过基因保守序列设计简并引物，结合
RACE技术进行基因同源克隆上。Ding等(2001)
用同源克隆和 RACE技术克隆到了荔枝果实的
ACC氧化酶(ACO)基因全长，并在大肠杆菌中进行
表达，获得了60KD的融合蛋白。栩维言等(2005a；
2006)也克隆 了荔枝 MADS-box基因全长 ，发现其
在雄花及雌花中特异表达，但转基因拟南芥 T1代
植株中未发现该基因与花发育相关。此外，已先后
用同源克隆技术克隆到的荔枝基因片段或全长还有
乙烯受体基因全长(朝继成等，2003)、2个膨大素基
因(Expansin)片段 (陆旺金等，2003)、5个 NBS—
LRR类抗病基因同源序列片段(黄代青等，2002)、
SOD基因片段(邓九生等，2000)、2个 HMG基因片
段(夏瑞等，2006)、Profilin基 因全长(张红云等，
2006)等。这些研究均只对基因序列作了简单的生
物信息学分析，未做进一步研究。
荔枝无核或焦核是一个重要的经济性状，已有
研究者初步进行了胚败育导致焦／无核的分子机制
6期 王家保等：荔枝生物技术研究进展 835
研究。张以顺等(2004b)用抑制差减杂交技术，以
桂味正常发育胚为驱动子(driver)，败育胚为检测子
(tester)，建立了代表桂味败育胚特异表达的 eDNA
文库，经 Virtual Northern检测，获得 3个阳性克
隆。其中一个为泛素结合酶基因，另 2个是 S一腺苷
蛋氨酸合成酶(SAM)基因。通过 RACE技术获得
了 SAM 基因的 eDNA全长并对其作 了序列分析
(张以顺等，2004a)。褶维言等(2005b)也用 SSH技
术构建了富集无核荔枝败育果基因的 eDNA文库，
通过反向Northern杂交得到了 61个阳性克隆，测
序了其中1O个，多数是在荔枝中首次报道的功能未
知基因。但以上研究尚未得出有关荔枝胚败育机制
的明确结论。
荔枝遗传转化研究进展
3．1根癌农杆菌侵染转化
根癌农杆菌侵染转化是双子叶植物成功的转基
因方法。欧阳曙等(1985)曾用注射器将根癌农杆菌
的 4个菌系注入乌叶荔枝三年生实生苗与八年生结
果树枝条上，待致瘤后，将结瘤组织置于 MS培养基
上培养，获得了愈伤组织，经检测，T-DNA整合到了
荔枝的瘤组织中。说明 T-DNA可以作为荔枝基因
工程的良好载体，而荔枝也是 T-DNA的良好受体。
曾黎辉等(2003)以元红荔枝胚性愈伤组织为试
材，研究了共培养时间、菌株类类型、继代培养时间、
菌液浓度等对根癌农杆菌转化效果的影响，结果表
明：继代 15 d的胚性愈伤组织处于旺盛分裂期，是
转化的合适受体。EHA105株系的侵染力最强，共
培养 2 d是最适合的时间，菌液浓度以0．5×10。为
佳，而转化前将胚性愈伤组织进行 1 h风干预处理
有利于提高转化率。作者用优化的侵染条件获得了
稳定表达 uidA基因的荔枝抗性愈伤组织；并利用
中间表达载体 pBI 12l构建了 LEAFY基因带有植
物组成型启动子 CaMV 35S的植物表达载体并导
人菌株农杆菌 EHA105，以继代培养 15 d的元红胚
性愈伤组织为转化受体，G418作为转化细胞的选择
剂，将 LEAFY基因导人“元红”并获得了 3株转基
因植株。Puchooa(2004)通过农杆菌侵染法，将绿
色荧光蛋白基因导人了“Tai So”荔枝胚性愈伤组
织，但未获得转基因植株。
3．2基因枪转化
桑庆亮等(2001)曾用基因枪转化法将 Gus基
因转入了荔枝元红及下番枝荔枝愈伤组织中，发现
轰击后 24 h为检测 GUS瞬时表达的最佳时间。赖
钟雄等(2002，2003)以荔枝“下番枝”胚性愈伤组织
为材料，建立了荔枝高效遗传转化系统：继代培养 5
～ 10 d的胚性愈伤组织是最适的转化受体。荔枝
胚性愈伤组织对卡那霉素不敏感，但潮霉素对荔枝
胚性愈伤组织有致死效应，50 mg／L是合适的筛选
浓度。以含选择标记基因hpt和报告基因gus的质
粒 pGAMBIA 1301作为供体质粒 DNA，采用基因
枪轰击法转化荔枝胚性愈伤组织，在附加 50 mg／L
潮霉素的筛选培养基上对轰击后的荔枝胚性愈伤组
织进行筛选，获得多个稳定表达 GUS的抗性细胞
系。PCR检测表明，hpt和gus基因己整合进荔枝
基因组。抗性细胞系保持了强烈的胚胎发生能力，
形成了大量的胚状体，获得 了一批完整植株，其中
18株来自稳定表达 GUS的抗性细胞系的再生植
株，经 GUS组织化学检测为转基因植株。转外源
hpt与gus基因的下番枝转基因抗性胚性愈伤组织
细胞系与对照相比EST同工酶谱未发生变化(赖呈
纯等，2005)。
4 研究展望
以上研究为荔枝新种质的培育提供了必要的技
术基础，将成为荔枝常规育种的有益补充。但由于
褐变及内生菌严重，荔枝再生体系的建立一直较为
困难，现有的报道仅集中在下番枝、元红、“Tai Sao”
等几个品种中，获得再生植株 的也仅见下番枝与
“Tai Sao”两个。尚需进一步研究影响荔枝外植体
再生的因素，扩大供试的品种范围，建立妃子笑、淮
枝、黑叶、桂味等主要品种的高频再生体系。
果实发育及采后衰老由基因表达控制，如荔枝
的焦核／无核、采后果皮褐变等。关于荔枝发育的分
子生物学研究尚处于探索阶段，鲜见有关荔枝采后
分子生物学的研究报道。应加强荔枝果实发育及采
后分子生物学的研究，克隆控制荔枝特殊性状发育
及采后果皮衰老的关键基 因，这将有助于从根本上
理解果实发育与衰老的分子机理，从而为应用生物
技术培育具特异性状 和耐贮荔枝种质或品种提供
基础。
荔枝转基因研究正处于起步阶段，能够获得转
基因幼苗的报道极少，并且没有后续的研究报道。
因此，仍需加强荔枝转基因技术体系的系统研究，如
836 广 西 植 物 28卷
探讨农杆菌转化时品种、菌株、载体、培养条件等对
转化效率的影响，以获得高效转化效率的技术体系，
为遗传转化提供技术基础。
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尖叶青冈在中国香港及广东的新分布记录
邓 敏1，曹利民2，曹 明3
(1．中国科学院 昆明植物研究所 生物多样性生物地理重点实验室，昆明 650204；2．江西赣南师范学院
化学与生命科学学院，江西 赣州 341000；3． 广西植物研究所，广西 桂林 541006)
摘 要：基于对中国主要标本馆的青冈亚属标本的全面整理，该研究证实尖叶青冈(Ouercusacuta Thunberg)在
中国香港及广东省有分布，并且本文对尖叶青冈及其近缘种鉴别特征进行了讨论和界定。
关键词：尖叶青冈；新分布；分类
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