全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(3)：245—248 2005年 5月
花粉管通道法转基因改良小麦品质的初步研究
陈国庆1，王武源 ，李忠超1，王小兰
(1．中国科学院华南植物园，广东广州 510650；2．江西省农业212程职业学院，江西樟树 343700)
摘 要：为在短期内提高小麦品质，本研究构建了一个含有反义蜡质基因、HMW—GS 1DylO基因和抗除草剂
基因的重组质粒 pWXAB，以优良小麦品种(冀麦一24、白玉 149、9411等)为材料，采用花粉管通道法进行转基
因研究。对转基因后代进行除草剂筛选和 SDS-PAGE电泳。结果表明，除草剂基因及反义蜡质基因已经整
合到小麦基因组中，从抗性水平而言，其转化频率为 0．5 。
关键词：品质改良；花粉管导入法；质粒
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)03—0245—04
Study 0n the improving 0f wheat quality
by pollen tube pathway transgene
CHEN Guo-qing ，Ⅵ NG Wu—yuan2，LI Zhong-chao ，Ⅵ NG Xiao-lan
(1．South China Botanical Garden．Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650．China；
2．』iangxi Agricultural Engineering Vocational College．Zhangshu 343700，China)
Abstract：By pollen tube pathway，plasmid pWXAB containing anti—sense waxy genes，HMW—GS 1Dyl0 gene
and selective marker gene of bar were transferred into three wheat lines(JM一24、BY一149 and 9411)．Half of
the wheat seeds were used to examine waxy protein by SDS-PAGE，and the resuIt indicated that anti—sense
waxy genes had integrated into wheat genome．Other seeds were cultured and screened by herbicide，and then
1 2 transformed plants were obtained．For resistance to herbicide，the transformation rate was 0．5 ．
Key words：quality improving；pollen tube pathway；plasmid
小麦作为世界上最重要的粮食作物之一，其品
质改良是育种工作领域的一个热点。研究表明，蛋
白质构成影响面包的烘烤品质和营养品质(安室喜
正，1991)，而淀粉特性影响小麦籽粒的加工品质和
食用品质(Miura等，1994)。目前在小麦品质改良
领域中主要有两个热点，一是通过特异地改变某些
亚基的构成与比例，增加小麦中蛋白质及必需氨基
酸含量来改良其营养品质，进而提高烘烤品质。二
是调节淀粉生物合成途径，以培育直链淀粉含量少
甚至没有的蜡质小麦品种，提高其加工品质。
蜡质蛋白(wx蛋白)为结合于淀粉颗粒上的合
成酶(GBSS)，是除麦谷蛋白、麦醇溶蛋白等蛋白成
份之外的又一种储存蛋白，其含量是谷类作物食用
和加工品质的重要决定因素。它的分子量约为
60KD，由3个亚基构成，表达受基因控制，在籽粒充
实期表达丰富，与直链淀粉的合成密切相关，其隐性
突变体籽粒中直链淀粉含量降低，支链淀粉含量增
加(Nakamura等，1993)，从 而改变小麦的淀粉构
成，影响面粉品质、面团加工及食用品质。Wx基因
突变会导致小麦品质的改变，但由于多倍体麦类作
物有多个染色体组，在自然界中尚未发现像玉米、水
稻等作物的天然糯性突变体。
研究表明，麦谷蛋白(HMW—GS)IDyl0亚基与
小麦的加工品质呈正相关(谓t启光等，2000)。安室
收稿日期：2004—04。02 修订日期： 川 O7—2O
基金项目：广东省自然科学基金项 f_j( I 3,J )465)；国际 IFS资助。
作者简介：陈国庆(1979一)，女．河北邢台市人，在读博士，从事珍稀濒危植物的保护遗传学研究。 通讯作者
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喜正(1991)则认为 HMW—GS lDx5和 lDyl0能提
高小麦烘烤品质。Barro等(1997)通过转基因也证
实 1Dx5和 1Dyl0能提高小麦的加工品质。与美
国、加拿大小麦相比，中国小麦蛋白质含量也较高，
但蛋白质的质量较差，故烘烤后品质较差。这一状
况主要受制约于品种的遗传基础(如缺乏控制高分
子谷蛋白亚基 5+lO的优质基因等等)。
随着分子生物学技术的发展，水稻的蜡质基因
已经分离并克隆(Shimada等，l993)。Visser等
(1991)通过反义 RNA技术和转基因技术，已成功
地将反义 GBSS基因导人马铃薯，并得到块茎直链
淀粉含量降低的品种。这些研究为应用基因工程技
术改良小麦淀粉含量奠定了基础。为了综合提高小
麦的加工品质，本研究在构建融合质粒的基础上，利
用花粉管通道导入法，将 HMW—GS lDyl0亚基基
因和反义蜡质基因同时转入小麦基因组，通过除草
剂筛选得到了转基因植株。通过 SDS—PAGE电泳
分析了转基因小麦的蜡质蛋白表达情况，为基因工
程培育优质小麦品种奠定基础。
1 材料与方法
1。1菌株和质粒
菌株Escherichia coil Jml09和载体pUC1l9为
本室保存，质粒 pWXA23(Shimad等，l993)和 p5+
lO分别由El本 Shimad教授和北京市农林科学院张
晓东教授惠赠。pWXA23包含 Gus报告基因，它编
码 半乳糖苷酶，在 X-Gluc底物作用下显兰色。另
外，此质粒还含有 1．Okb的反义蜡质基因。p5+lO
质粒包含1DylO亚基基因及编码抗除草剂的bar基
因。bar基因是单子叶植物转化常用的选择标记，编
码的PPT是一种谷胺酰氨合成酶的竞争性抑制剂。
l。2植物材料
冀麦一24(JM一24)、白玉 149(BY—l49)、94ll等
品种由河北省杂交小麦研究所提供。
1．3工具酶及分子生物学试剂
各种限制性内切酶、T DNA连接酶、Marker
等均购自华美公司，其它各试剂均为进口或国产分
析纯试剂。
1．4反义蜡质基因的构建
质粒 DNA的提取和纯化、目的片段的酶切和连
接、重组质粒的鉴定等均参照Sambrook(2001)的方法。
1．5 DNA片段的回收(采用冻融法)
将包含目的片段的质粒酶切、琼脂糖凝胶电泳，
并在紫外灯下切胶，放入 1．5 mL的离心管中，加入
0．1 mL无菌 ddH O，用玻棒捣碎凝胶，加入无菌
ddH O至0．5 mL左右，加等体积的酚，震荡至无明
显的块状物。将离心管置液氮中5 min，取出，室温
放置片刻后置 37℃水浴至融解。反复操作 3次。
旋涡震荡均匀，l2 000 rpm离心 10 min。取上清，
加入等体积的酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)抽提。
取上清，加入 2倍体积的无水乙醇，1／10体积的 3
mol／L NaAc(PH7．0)，混匀，-20℃静置，l2 000
rpm离心20 min，去上清，沉淀风干。加入lO L无
菌 ddH2O，溶解 DNA。
1。6花粉管通道法转基因
选取刚刚抽穗、花药仍为绿色的冀麦一24，白玉
149，去雄，套袋隔离，在人工授粉 4 h后，用注射器
拨去柱头或者用剪刀剪去柱头的 l／3，将用 l×SSC
稀释的浓度为 l g／ L的质粒 DNA滴在断面上。
套袋，隔离至种子成熟。
1。7小麦植株的除草剂抗性筛选
播种由花粉管导入法得到的种子，植株长至 3
～ 4叶期，用 5mg／L Basta涂叶片两侧(张晓东等，
l997)，半小时后再涂一次，3～7 d后观察。
1．8籽粒的蛋白电泳检测
蜡质蛋白的提取主要参照 Zhao等(1．994)的方
法。取花粉管导入法获得的小麦粒的远胚端的半粒
种子夹碎，蒸馏水浸泡过夜，离心，取沉淀。用洗液
(55 mmol／L Tris—HCl PH6．8；2．3 9／6 SDS 5 2一巯
基乙醇)洗3～4次，每次用l mL洗液。蒸馏水洗3
次，常规离心，弃上清。再用丙酮或 7O 9／6酒精洗一
次，将所得淀粉颗粒室温风干，4℃保存备用。将所
得淀粉粒加提取液(68 mmol／L Tris—HCI pH6．8
2．3％ SDS 5％ 2一巯基乙醇 lO 甘油 0、005 9／6溴酚
兰)20O～300 L，沸水中煮 4～5 min，冷却，l2 000
rpm离心 10 min，取上清 25～30 L。在垂直板凝
胶电泳系统上电泳(20 mA l6 h或 300 v 6 h)。浓
缩胶 Acr：Bis=30：0．135，凝胶系统及银染方法
参照王子宁等(2000)加以改进的方法。
2 结果与分析
2．1质粒 pWXAB的构建
用 HindII及 EcoR I酶切 pWXA23，冻融法回
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3期 陈国庆等：花粉管通道法转基因改良小麦品质的初步研究 247
收 4．2kb的 DNA片段，克隆到 pUC119的 Hind【丌
及 EcoR T酶切位点之间，得一中间质粒 pWX1。用
EcoR I完全酶切 p5+1O，回收 p5+10上含抗除草
剂的片段，大小为 4．5kb，并克隆到质粒 pWX1的
EfoR T酶切位点，经酶切验证，得到含有反义蜡质
基因和抗除草剂基因的新质粒，命名为 pWXAB，其
大小为 11．7kb(图 1)。
2．2除草剂筛选转基因植株
转基因麦粒的筛选，采用除草剂和籽粒蜡质蛋白
电泳同时进行。将花粉管通道导人法获得的1 176
粒种子的一半即 676粒种子种人花盆，待长到 3～4
叶期时，用 5 mg／L的除草剂(Basta)涂叶子两侧，绝
大多数叶子在涂抹除草剂 3d后开始萎蔫变黄，只有
12棵植株的叶片仍为绿色(图版 T：A)，将得到的
12棵抗性植株移人温室盆栽。为排除由于人为误
差造成的假阳性，两周后，再进行一次筛选，且以未
进行转基因的植株作对照，结果未进行转基因的植
株全变黄，而这 12棵植株无异常变化。同时，提取
可能的转基因植株叶片总 DNA，对 bar基因进行
PCR检测，结果表明，在转入了外源基因的植株及
质粒中均扩增得到大小相同的bar基因条带，而对
照中无扩增带(图版 I：B)，由此表明外源基因已经
整合到小麦基因组中，且 bar基因得到了表达，使得
植株获得除草剂抗性。
pr 4
．
2kb 协m tc： om0 4．5kb termi nato．r
图 1 pWXAB质粒结构图
Fig．1 The structure of the plasmid pWXAB
2．3花粉管通道法所获籽粒的蜡质蛋白检测
另外的近 500粒种子，采用半粒法即切取远胚
端半粒籽粒提取蜡质蛋白进行电泳，带胚端半粒保
留。SDS—PAGE电泳结果表明，其中的两粒种子缺
少了三条蜡质蛋白带中的w—B1条带，其余均为三
条蜡质蛋白带，也没有发现W—A1、W—D1的缺体(图
版 T：C)。由于实验所选的材料均为蜡质蛋白正常
小麦，在通过花粉管转基 因后，出现蜡质蛋白缺失
体，说明反义蜡质基因已经特异性的抑制基因的表
达。其中泳道(5)的w—B1的含量与其它相比似乎
要弱，可能也是反义蜡质基因表达的结果，但还有待
于进一步的实验验证。
3 讨论
越来越多的研究表明，小麦籽粒的蛋白质构成
影响烘烤品质，而占籽粒中 65％～7O％的淀粉的构
成影响小麦 的食用品质和加工品质 (刘广 田等，
1997)。糯性小麦由于其糯性基因为隐性，籽粒中不
含 wx蛋白，导致直链淀粉含量降低，其面粉将具有
支链淀粉含量高、高峰粘度高和膨胀势高等特点，这
正是优质面粉所要求的。由于糯性基因对淀粉构成
及性质的遗传影响及对品质的影响，使得在育种过
程中不得不考虑胚乳中第一大组分淀粉的作用。糯
性小麦的培育成功，将改善目前小麦品质单一的状
况，发展成为面条专用小麦品种。因此，在进一步的
研究工作中，可以考虑把优良高分子量麦谷蛋白亚
基如 1，5+1 0，1 7+1 8等与糯性基因整合到一个
品种中，从而实现小麦籽粒中蛋白与淀粉的最优组
合，使之成为真正的优质小麦品种。
培育糯性小麦品种目前有多种方法，包括常规
育种、诱变育种和基因工程育种。但常规育种的最
大弊端是育种周期长，选择效率低，选择效果差；诱
变育种也存在后代分离世代长，难以纯合稳定，不利
于选拔等缺点；通过基因枪法或花粉管通道法导人
反义蜡质基因，抑制正常蜡质基因的表达来获得糯
性小麦品种，具有周期短、目标明确等特点。本研究
采用花粉管通道法将反义蜡质基因导人小麦，并且
利用除草剂筛选与SDS—PAGE电泳检测相结合，对
转基因后代进行逐级筛选，获得了 12株除草剂抗性
苗和两个糯性基因缺体。通过本项研究的结果可知
利用除草剂进行筛选是比较可行的一种筛选方法，
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只要剂量合适，完全可以排除由于内源抗性造成的
假阳性。根据抗性水平的统计，本研究花粉管通道
法转基因的转化率为0．5 ，此数据再次证明了花粉
管通道导人法的可行性，花粉管通道导人法与别的转
基因方法如基因枪介导法在将外源基因转化不同受
体方面各有利弊，但就简单方便而言，前者优于后者。
由花粉管导入法获得的种子经 SDS—PAGE电
泳，发现了两粒 Wx—B1缺体，从蛋白质水平上检测
到外源基因已整合到小麦基因组中，并由反义 RNA
专一性地抑制了相应的 mRNA的翻译。至于结果
中只有 WX—B1缺体而无其它缺体出现，说明在控
制蜡质蛋白的三个基因中，可能 wx—bl基因与导入
外源基因的同源性高于 Wx—a1和 Wx-dl与外源基
因的同源性，所以被优先抑制；也可能是 wx—bl基
因较其他二者更容易突变，这一点在蜡质蛋白突变
体的筛选中也得到了验证；另外可能的原因是检测
工作量不够，以致 wx—A1、wx—D1缺体出现机率太
小。因此，要获得糯性小麦仍需进行深入的研究。
因此，通过反义 RNA技术来抑制谷类作物蜡
质基因的表达以提高作物的加工品质是可行的。此
法可减少育种中筛选目的植株的工作量，使田间操
作变为室内工作，选择的准确性和可靠性得到一定
的保障，育种效率大大提高。至于获得糯性小麦，只
是一个时间问题。这也为提高作物品质、培育新的
优良品种探索了一条切实可行的新途径。
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