全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(4)：395— 399 2006年 7月
大别 山区六种黄精属植物的五种同工酶分析
陈存武1，周守标2
(1．皖西学院 化学与生命科学系，安徽 六安 237012；2．安徽师范大学 生命科学院，安徽 芜湖 241000)
摘 要：采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对皖西大别山区六种黄精属植物的抗坏血酸氧化酶(AOD)、多酚氧化酶
(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)和过氧化物酶(POD)五种同工酶进行了比较分析。结果表明：
(1)五种同工酶共显示出 66条酶带 ，其中有 3条是黄精属的特征酶带 ；并且来源 于不同种的同一种酶的谱带
数、相对迁移率、酶活性均不相同，呈现多样性；(2)五种同工酶谱的模糊聚类分析结果与形态学分类的结果一
致 ，利用酶谱差异可以将六种黄精初步区分；(3)在六种黄精属植物中，湖北黄精、轮叶黄精、多花黄精和金寨
黄精是较进化类型，玉竹和长梗黄精是较原始类型。
关键词：黄精属；同工酶；模糊聚类分析；特征酶带
中图分类号：Q945，Q55 文献标识码 ：A 文章编号：i000—3142(2006)04—0395—05
Isoenzyme pattern analysis for five kinds of
enzyme in six species of Polygonatum
from Dabieshan M ountain
CHEN Cun—WUI，ZH0U Shou—bao2*
(I．Department of Chemistry and Life Science，West Anhui University，Liu’an 237012，China：
2．College of Life Sciences，Anhui Normal University，Wuhu 241000，China)
Abstract：The isoenzyme pattern of ascorbate oxidase(AOD)，polyphenoloxidase(PPO)，superoxidase(SOD)，
esterase(EST)，and peroxidase(POD)from six species of Polygonatum，originated in Dabieshan Mountain in
west of Anhui Province，were compared and analyzed by PAGE．The results indicate：(1)Sixty—six isoenzyme
bands in total for five kinds of isoenzymes appeared in the analysis and three bands among them are special tO
Polygonatum．As tO fl definite isoenzyme，the isoenzyme number，isoenzyme Rf and isoenzyme acttvity are dif—
ferent for each species，showing great diversity．(2)The result by Fuzzy cluster analysis is coincidence with
morphological taxonomy，and the differences of isozyme bands can be used to identify the six specl’es from each
other primarily． (3)Among six species of Polygonatum，P．zanlanscianense，P
． verticillnt m，P．cvrtonemn
and P．jinzhaiense are more evolutive than P．odoratum and P．zanlanscianP sP．
Key words：Polygonatum；isoenzyme；fuzzy cluster analysis；distinct band
同工酶是指催化反应相同而结构及理化性质不
同的一组酶，普遍存在于各种生物中。用电泳方法
将不同的同工酶分开，通过特异性染色将其位置和
活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来，再通
过比较不同个体间同工酶谱带的差异性，可以研究
各个体间的系统关系。国内外学者(沈镝等，2004；
李晓林等，2004；苏冬梅，2001)分别将同工酶分析技
术应用于花椒、酸枣、沙拐枣等的分类，取得较好效
收稿 日期：2005-10-10 修回日期 ：2006—02—17
基金项目：安徽省自然科学基金资助项目(00O42415)[supported by Natural Science Foundation of Anhui Pr0vince(00o42415)]
作者简介：陈存武(1967一)，男 ，安徽庐江人，硕士，讲师，主要从事细胞生物学的教学与研究。
’通讯作者(Author for correspondence，E—mail：zhoushoubiao@vip．163．com)
维普资讯 http://www.cqvip.com
396 广 西 植 物 26卷
果。黄精属(Polygonatum Mil1．)植物是多年生草
本，分布于全国各地。由于形态上的过渡性和地理
分布上的重叠性使本属植物的种间划分存在一定分
歧(安徽植物志协作组，1992；聂刘旺等，1999；张定
成等，2000)。本文采用模糊聚类分析的相似关系R
一 链连接法首次对产自皖西大别山区六种八居群黄
精属植物的抗坏血酸氧化酶(AOD)、多酚氧化酶
(PPO)、超氧化物歧化酶(SOD)、酯酶(EST)和过氧
化物酶(POD)等同工酶谱进行比较分析，为黄精属
植物的系统研究积累资料。
1 材料与方法
1．1材料与试剂
取野外采集的地下茎，分别种植于实验室的花
盆，贴上标签。凭证标本分别存于安徽师范大学生
物系植物标本室与皖西学院化生系植物标本室。材
料种名、采集人及采集地见表 1。实验于 2005年 2
月在本院生化与分子生物学实验室进行，使用北京
六一仪器厂的 DYY一6B型电泳仪与 DYCZ一28D型
电泳槽，各种试剂均为国产分析纯。
1．2同工酶样品的制备
实验材料取 自植株地下茎刚萌发的芽体，每种
(居群)取样三份，蒸馏水洗净晾干，各称取 1．0 g，冰
箱预冷 1 h后剪碎，加入 5 mL复杂提取液(王中仁，
1998)和适量的石英砂，冰浴研磨，15 000 r／min离
心 15 rain，取上清液于 4℃冰箱中贮存备用。
1．3电泳及染色
采用垂直板 PAGE法稳流电泳，循环冷却装置
保证电泳在 O～4℃进行；以 Tris—Gly(pH8．3)为
电泳缓冲液；每槽上样 3O L，浓缩胶电流 15 mA／
板，分离胶电流 30 mA／板，待指示剂移至前沿 1 cm
时停止电泳，进行染色，拍照记录染色结果。每种同
功酶的电泳染色都重复四次以上，直到酶带结果一
致为止。各同功酶的染色方法分别是：PPO用邻苯
二酚一联苯胺染色法；POD采用醋酸联苯胺法染
色；AOD用抗坏血酸与 2，6一二氯酚靛酚(DCPIP)法
染色；EST用醋酸萘酯与坚牢蓝染色法；SOD用氮
表 1 六种八居群黄精属植物材料来源
Table 1 The origin of materials of eight populations from six species of Polygonatum
蓝四唑(NBT)与吩嗪二甲酯硫酸盐(PMS)法染色
(王中仁，1998)。
1．4资料整理与分析
分析酶谱并画出酶带模式图，计算各样之间的
酶谱相似系数 S，采用模糊聚类的相似关系 R一链连
接法进行分析(苏冬梅 ，2001)。酶带模式图中：l
超强带； 强带；圆 中带；口 弱带。
2 结果与分析
2．1多酚氧化酶(PPO)酶谱
图 1显示该酶共有 12条酶带，分布在两个带
区。Rf在 0．071 0～0．134 0之间 的为慢 速区，Rf
在0．226 1～O．381 2之间的为快速区。从个体的酶
图 1 六种八居群黄精属植物 PPO同工酶谱模式图
Fig．1 The PPO zymogram model of eight populations
from six species of Polygonatum
谱看，P1的7条带中超强带、强带、中带各有 2条，
均匀分布在快速区与慢速区，说明其酶活性较强；
P2仅有 3条弱带 1条中带，酶活性弱，与种内不同
居群的 P1个体差异明显；P3、P4和 P6的酶谱相
口国===同
[== === 盯
口日===U
口国===
口口[==== ¨
口同==
日—===二]口
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 陈存武等：大别山区六种黄精属植物的五种同工酶分析 397
似，酶带少并且没有强带，说明它们的酶活性低；P7
和 P8的酶谱相似。
2．2过氧化物酶(POD)酶谱
从图2看出，该酶谱也有 12条酶带，分布在三个
区域。慢速带区的 Rf≤O．284 9，有密集排列的 5条
带，个体间的差异不大，几乎都是酶活性很强的强带
和超强带，POD的酶活性主要集中在该区的酶带，其
中Rf=O．174 2和 0．215 1的2条酶带是共同酶带，
可以认为是本属植物 POD的特征酶带。中速带区仅
P7与P8各有 2条弱带。快速带区有 5条带，Rf在
0．614 1t0．747 3之间，都是中弱带。P6与 P7在该
区没有酶带。种间的酶谱差异主要体现在快速区。
1194,
国-目~-巨 -7目
图 2 六种八居群黄精属植物POD同工酶谱模式图
Eg．2 The POD zymogram model of eight populations
from six species of Polygonatum
1302＼i目营萌目营
图 3 六种八居群黄精属植物 AOD同工酶谱模式图
Fig．3 The A0D zymogram model of eight populations
from six species of Polygonatum
2．3抗坏血酸氧化酶(AOD)酶谱分析
AOD是细胞内一种活跃的氧化酶类。从图 3
可看出共有 14条酶带，分布在两个区。慢区的 Rf
在 0．130 2～O．266 7问，有密集的6条带，是个体酶
带的主要分布区。其中 Rf=0．156 3的酶带出现频
率高达 1．00，是本属植物 AOD同工酶的特征酶带。
快速区的 Rf在 0．458 3～0．645 8问，没有特征酶
带。从种间酶谱看，在快速 区，P3、P5、P6没有酶
带，P1有 2条中速带，P4等其他个体都有 2条强带
或超强带，说明个体之间的酶谱差异较大。P3与
P4(多花黄精 A与 B)在该区的酶带差异表明种内
不同的居群间，酶的表达存在较大差异。
2．4酯酶(EST)同工酶模式图
图4酶谱在五种同工酶中表现最丰富，共有 16
条酶带，分成两 区段。快速区的 Rf在 0．490 3～
0．771 3间，有 8条酶带，主要是中弱带，个体问谱带
差异较大，没有特征酶带 出现。慢速 区的 Rf在
0．071 8～O．311 8间，也有 8条带。从个体酶谱看，
超强带与强带集中分布在 P3、P4、P6三个样品；其
余五个样品都是中带或弱带。表明 EST同工酶的
表达及其酶活性在同时期的种问存在较大的差异。
图 4 六种八居群黄精属植物 EST同工酶谱模式图
Fig．4 The EST zymogram model of eight populations
from six species of Polygonatum
图 5 六种黄精属植物 SOD同工酶谱模式图
Fig．5 The SOD zymogram model of six
species of Polygonatum
2．5 SOD同工酶电泳模式图
图5共有 12条酶带，分为快、中、慢三个带区，
慢区的 Rf小于 0．192 9，仅存在于 P3、P5、P6三种
个体，并且都是弱带；中区的Rf在0．285 7～0．335
7之间，主要是活性极强的超强酶带。快速区的 Rf
在 0．435 7--0．476 8间，除 P1外的其他个体都有 2
～ 3条酶带。从个体的酶谱看，P1酶谱最简单，只
有一条位于中速带区的超强酶带，P6有 9条酶带，
P3与 P5都有 7条酶带，显示出酶谱的种间差异性。
3 讨论
3．1五种同工酶的酶谱特征
八个样品的五种酶电泳共显示出 66条酶带
臼 闩目 盹
固匿同=!目==盯
目臣===H
国同===
国目I==
曰圉】== 陌
口n==目
1●●●●● ●●_I1l ●●J111 一 = 兰 [====E[ 陌
]●●●●●1 ● J [===H 盯
维普资讯 http://www.cqvip.com
398 广 西 植 物 26卷
(EST：16条，AOD：14条，SOD、PPO、POD各 12
条)，其 中有三条带 是各样 品共 有 的特 征酶带
(POD：2条，AOD：1条；SOD、EST、PPO等均没有
特征酶带)，种间有差异的酶带为 57条，多态率达
86 。
从八个样品的总酶带数看，五种同工酶中，EST
的酶带最丰富，八个样品共显示 66条酶带；其次为
POD、sOD、AOD，而 PPO的酶带最简单，八个样品
共显示36条酶带。
表 2六种八居群黄精属植物五种 同工酶相似系数矩阵表
Table 2 The matrix table of similarity coefficient
of five isoenzymes of eight populations from
six species of Polygonatum
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7
1．00 0．72 0．33 0．32 0．56 0．39 0．45
1．OO O．45 O．46 0．51 0．33 0．44
1．OO O．67 O．53 0．63 0．44
1．00 0．47 0．45 0．48
1．OO 0．61 0．62
P8
O．42
O．36
O．47
O．44
O．58
O．57
O．82
1．OO
P1
P2
P3
P4
P5
P6
P7
P8
从酶的活性看，五种同工酶中，POD的酶活性
最强，八个样品共显示 47条带，其中28条为强带与
超强带，强活性酶带数占总带数的 59．6 。其次为
AOD、SOD、PPO，酶 活性最弱 的是 EST，八个样 品
共显示 66条带，强带与超强带有 15条，仅占酶带总
数的 22 9，5。
从以上五种同工酶的分析还可以看出，就同一
种同工酶而言，不论是在种问的各个体间，还是在种
内的不同居群的个体间，各酶带的移动速度以及该
酶带的分布、总的酶带数、超强带与强带的比例及其
分布等都存在差异；至于在同一个体的不同发育阶
段，同一种酶的酶谱间是否也存在差异，有待做进一
步的实验研究。
3．2同工酶与黄精属的系统分类
3．2．1聚类分析 在物种的系统发育过程中，亲缘
关系越近的种，其蛋白质组成越接近，同工酶的酶谱
越相似，因而可以通过酶谱的相似性分析来研究物
种的分类与进化关系(王 中仁，1998；Liu XW 等，
2004；陶玲等，2004)分别做了很好的应用。分析本
文五种同工酶所显示的 66条酶带，计算这些酶带相
互间的相似系数(表 2)，再利用相似关系 R一链连接
法进行模糊聚类，其结果如图 6所示：在 入1—0．82
时，P7与 P8(湖北黄精与轮叶黄精)率先聚合为 I
类；在 入2=0．72时，P1与 P2(玉竹 A、B)聚成 Ⅱ类；
在 X3—0．68时，P3与 P4(多花黄精 A、B)聚成 Ⅲ
类；在 入4—0．61时，P5与 P6(金寨黄精与长梗黄
精)聚合为Ⅳ类。这些结果与形态学分类的结果高
度一致(张定成等，2000)，说明同工酶分析结果支持
形态学分类的结论，同工酶分析可以作为系统分类
的依据之一。对于少数同工酶分析结果与形态学分
类结论不一致的种类，需要结合核型、叶表皮等其他
指标综合考虑。
O．4 O 6 0．8 1．0
图 6 六种八居群黄精属植物五种同工酶的模糊聚类图
Fig．6 The Fuzzy cluster dendrogram of five isoenzymes
of eight populations from six species of Polygonatum
3．2．2种问区分 从以上酶谱可知，六种八居群的
每个样品的每一种同功酶谱都有差异，可以据此探
索黄精属的种间区分。以SOD为例，本实验材料的
六个种中，①只具有 Rf一0．336 7酶带的为 P1；②
都含有 Rf=0．314 3酶带的是 P5和 P8，其中含有
Rf=0．336 7的是 P5，不含有 Rf=O．336 7的是 P8；
③都不含有 Rf=0．314 3酶带的分别是 P3、P6和
P7，其中兼含有 Rf=0．335 7与0．285 7的是 P6，只
有 Rf=0．335 7的是 P3，仅有 Rf：0．285 7的是
P7。根据酶谱的差异，可以将本实验材料的六种植
物区分开来，由于本实验的材料仅取自地下茎的芽
体，对于取自植株其他部分的材料，是否具有相同的
实验结果有待进一步探讨。
3．3同工酶与黄精属的系统演化
“同工酶越多的品系越进化”(Garva等，1977)，
也就是说同工酶条带少的种是较原始种，同工酶条
带多的种分化程度较高，是较进化种。比较都是天
堂寨生长的六种黄精属植物的五种同工酶的酶带总
数(表 3)可以看出：P3、P5、P7、P8(即多花黄精 A、
金寨黄精、湖北黄精、轮叶黄精)的同工酶酶带数分
别是29条、3O条、30条、31条，而 P6与 PI(即长梗
黄精、玉竹 A)分别为 25条和 26条，存在明显差异。
5 6 7 8 3 4 1 2
P P P P P P P P
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 陈存武等：大别山区六种黄精属植物的五种同工酶分析 399
表 3 天堂寨六种黄精属植物的五种同工酶酶带统计
Table 3 The statistics of five isoenzymes band of six
species of Polygonatum from Tiantangzhai
也就是说多花黄精、金寨黄精、湖北黄精、轮叶黄精
分化程度较高，是较进化的类型，玉竹、长梗黄精等
为较原始类型。与本属植物核型研究(邵建章等，
1994)时得出的进化趋势相一致：即湖北黄精、轮叶
黄精等轮叶系是进化类型，玉竹、长梗黄精等是较原
始类型。
从表 3还可看出，酯酶(EST)同工酶在不同种
植物体内的酶带最多，多花黄精和湖北黄精体内达
10条，六种植物酶带总数达47条，远远高于其他四种
酶的酶带数。按照 Garua等的观点，在本文所研究的
五种同工酶中，我们认为酯酶是比较进化的酶类。
图 7 六种八居群黄精属植物 SOD、PPO、EST、POD、AOD同工酶的 PAGE图谱
Fig．7 The zymograms of SOD，PPO，EST，POD，AOD of eight
populations from six species of Polygonatum by PAGE
参考文献：
王中仁．1998．植物等位酶分析[M]．北京：科学出版社：82—
135．
安徽植物志协作组．1992．安徽植物志(第五卷)[M]．合肥：
安徽科学技术出版社 ：55—594．
李晓林，梁国鲁，郭启高．等．2004．国产主要花椒的同工酶分
析[J]．西南农业大学学报(自然科学版)，26(4)：445—455．
沈 镝，朱德蔚．李锡香．等．2004．用 5种同工酶分析云南芋种
质资源遗传多样性[J]．植物遗传资源学报，5(3)：239-246．
苏冬梅 ，陈书君 ，毕方铖．2001．酸枣及 17个枣品种 叶片过氧
化物酶同工酶的研究[J]．园艺学报，28(3)：265—267．
聂刘旺．张定成，张海军，等．1999．安徽黄精属五种植物的同工
酶分析[J]．安徽师范大学学报(自然科学版)．22(1)：29—31．
Garua A，Tsunewaki K． 1977． Electr0ph0retical studies on
peroxidase isozymes[J]．JapaneseJ Genetics，52：284-286．
Liu XW ，Zeng MQ．2000． Study of application of isozymic
marker to distinguish the multiplasmic lines of maize(Zea
mays)[J]．Sci Agric Sin，33(4)：21—29．
Shao JZ(邵建 章)，Zhang DC(张定成)，Qian F(钱 枫)．
1 994．Studies on cytotaxonomy of Polygonatum from Anhui
(安徽黄精属的细胞分类学研究)[J]．Guihaia(广西植物)，
14(4)：361—368．
Tao L(陶 玲)，Ren J(任 瑁)．2004．Study on relationship
and cluster of Calligonum by isozyme electrophoresis analy—
sis(应用同工酶进行沙拐枣属植物亲缘关系和分类的研究)
[J]．Acta Bot Boreal-Occident Sin，(西北植物学报)24(9)：
1 708— 1 713．
Zhang De(张定成)，Zhou SB(周守标)，Zhang XP(张小平)，et
a1．2000．A classification study on Polygonatum from An—
hui(安徽黄精属植物分类研究)[J]．Guihaia(广西植物)．2O
(1)：32—36．
圈
■■■
～ ■■ 墨 I * 一■● ■霸
圈圈
目
维普资讯 http://www.cqvip.com