全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(6)：566— 569 2005年 11月
葫芦苏铁遗传多样性的等位酶分析
简曙光1，吴 梅1，刘 念
(1．中国科学院华南植物园，广东广州 510650；2．仲恺农业技术学院，广东广州 510225)
摘 要：采用等位酶技术，分析了葫芦苏铁 5个居群的遗传多样性。分析 6个酶系统，共获得了13个基因位点，
结果表明：葫芦苏铁具有较高水平的遗传变异性，多态位点百分率(P)为56．9 ，等位基因平均数 A—1．62，等
位基因多样性指数 Ho=0．105，He=0．164，居群杂合体过量的位点为 5o 。居群遗传结构分析表明，大部分
遗传变异(93．6 )存在于居群内(FsT—o．064)，居群间分化程度甚微。根据葫芦苏铁的居群遗传结构式样并
结合相关研究，提出了就地保护所有居群，迁地保护从东一、王下和水田三个大居群取样的保护策略。
关键词：葫芦苏铁；等位酶；遗传多样性
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2005)06—0566—04
Genetic diversity of Cycas c ，zg Z ，zg ，z Z s
detected by allozyme analysis
JIAN Shu—guang ，WU MeiI，LIU Nian2
(1．South China Botanical Garden，Academia Sinica，Guangzhou，510650，China；2．Horticulture
Department，Zhong Kai Agriculture Technique College，Guangzhou 510225，China)
Abstract：Genetic diversity of 5 natrual populations of Cycas changjiangensis were investigatied by using alloz—
yme analysis．Allozyme data for 1 3 loci of 6 enzymes demonstrate high levels genetic variation within popula—
tions，the mean percentage of polymorphic loci(P)was 56．9 ．The mean number of alleles per locus(A)was
1．62．Mean observed heter0zygosity(Ho)was 0．105，and mean expected heterozygosity(He)was 0．164．Half
of the Wright’s F—statistics showed negative values．The analysis on population genetic structure indicated
that most variation(93．6 )resided within populations，with FST—O．064，thus mean the genetic differentiation
between populations was low．On the basis of this study and other studies have been achived，we put forward
the in—situ conservation scheme of al populations，and ex-situ conservation of sampling from the Dongyi，Wan—
gxia and Shuitian populations of Cycas c^d行gJ 。 g已 s s．
Key words：Cycas changJiangensis；Alozyme；Genetic diversity
苏铁属植物起源古老，在研究种子植物起源与
演化及古地理、古气候的变迁等方面有重要意义，所
有种类均为国家一级保护植物。葫芦苏铁(Cycas
changJiangensis N．L．)仅分布于海南省西部昌江
县坝王岭方圆约 70 km 的范围，目前发现有7个居
群，居群的大小顺序如下：东一，原有 10 000余株，
现仅剩 1 000余株；东六、原有 10 000余株，现仅剩
不到 2 000；王下山脚，仍有 3 000多株；王下山顶，
原有 5 000多株，现仅剩数十株；水田，约 1 000株；
五仙桥，不足 1O0株；雅加，不足 1O0株。葫芦苏铁
收稿日期：2004-10-I2 修订 日期：2005—02—04
基金项目：国家自然科学基金(30070062)；广东省 自然科学基金(000975)；广东省环保局科技开发项 目(970165)；华南植物园所长
基金(2002-3293)资助~Supported by the National Natural Science Foundation of China(3OO7OO62)；Natural Science Foundation of
Guangdong Province(000975){Foundation for Science and Technology Developing of Environment Protection Department of
Guangdong Province(970165)；South China Botanical(2002-3293)]。
作者简介：简曙光(1972-)，男 ，江西九江人，博士，助理研究员，从事植物生态学及分子生态学研究。
通讯联系人(Author for correspondence)
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6期 简曙光等：葫芦苏铁遗传多样性的等位酶分析 567
茎干基部呈葫芦形，茎干直径、高度，大孢子叶和种
子直径均较海南苏铁 (C．hainanensis)小 (刘念，
1998)。它是近年发现的濒危物种，我们从不同学科
角度对其开展深入研究，试图探讨其濒危原因，进而
提出有效保护策略。
酶电泳技术 自二十世纪 70年代用于植物居群
研究，为居群遗传结构和生物进化研究带来了突破
性进展，也为植物系统进化研究提供了新的手段和
途径(葛颂，1994；Gottlieb，1981)。借助于一定的遗
传分析方法，酶电泳技术可以准确地确定一批符合
遗传标记特点的等位酶位点，能有效地度量居群或
类群中的遗传变异和分化，进而探讨类群间的遗传
关系，为类群的划分和系统发育推断提供基本资料
(葛颂，1994；葛颂等，1998)。有关苏铁属植物的等
位酶分析，国内外曾有研究和报道(陈潭清等，1996；
Yang等，1996；Lin等，2000)。如 Yang(1996)根据
等位酶实验结果，指出亚州东南部是苏铁科的起源
中心，中国的苏铁不是单系起源，台东苏铁(C．tai-
tungensis)、苏铁(C．revoluta)和攀枝花苏铁 (C．
户伽 ^ ^“nP s )是一个 自然类群，依据遗传变异的
特点，他指出攀枝花苏铁要做迁地保护，须从 3个居
群里选取种源才能保存 95 的基因，而多歧苏铁则
仅从一个居群取样即可。又如刘念的同工酶实验结
果((陈潭清等，1996)表明苏铁属可分为 4个类群。
他们的实验结果都表明苏铁属植物在分子水平上的
进化是十分缓慢的，这与其两亿多年来形态变化不
大相对应。本文用等位酶标记手段来研究葫芦苏铁
居群的遗传变异和遗传分化 ，探讨葫芦苏铁居群的
遗传结构及分化程度，为葫芦苏铁濒危机制的揭示
和保护策略提供有益的资料。
1 材料和方法
1．1采样及处理
采样居群的地理位置、生境及采样个体数见表
1。采样时间为 4月上旬 ，因无当年生嫩叶，取样部
位均为上年生羽叶近顶部的小叶片。取 100～150
mg小叶材料，加入 5号提取缓冲液(Soltis配方三
200 L；提取液 ：材料=2：1)研磨(Wendel等，
1989)，研磨液在 5 000 rmin 下离心 5 rain后，在冷
表 1 葫芦苏铁各居群的分布地点、生境及采样个体数
Table 1 Distribution，habitat and number of collections of all fivenatural populations of Cycas f^ n n ge s
冻状态下保存。
1．2电泳
采用黄宏文(2000)改进的 Mulcahy等的超薄
平板聚丙烯酰胺等电聚焦系统(IEF—PAGE)。
(1)上样：在低温状态下(胶下放冰)，用 l mm。
的Watman 3号滤纸制作的纸蕊子吸取上清液(酶
液)，加在距阳极 3～4 mm处，样品间距约 1 mrn，每
块胶可上 25个样。
(2)电泳：电泳槽用一塑料槽代替，从下至上放
置冰袋、纤维海绵布，玻璃板和橡胶垫，最后将上过
样的凝胶玻璃板放在橡胶垫上。电泳前先将两条 8
mm×70 mm的滤纸条紧贴凝胶的较长的两条边，
吸取正极(pH3．5)、负极(pill0)缓冲液润湿滤纸
条，确保电极丝浸在电极缓冲液中。样品均从正极
向负极电泳，电压控制为50、100、200、300、400 V各
15 rain。
1．3染色
酶的组织化学染色用液染法染色(黄宏文，2000)，
对6种酶系统进行检测，获得 13个等位酶位点。
1．4统计分析
等位酶位点的确定是根据葫芦苏铁染色体的倍
性(2n一22)，同时依据酶的亚基数 目及多聚体酶同
一 位点的等位基因编码的亚基不能杂合的原理对各
个酶系统的酶谱进行解释(Wendel等，1989)。从阳
极到阴极，依次用位点 1、位点 2、⋯⋯等表示，每个
位点内的不同等位基因从阳极到阴极用字母 a、b、C
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⋯ 等表示。
数据分析使用 Biosys一1软件 (Swofford等，
1981)，分析指标有每一居群的等位基 因平均数
(A)、多态位点百分率(P)、平均观察杂合度(Ho)、
平均预期杂合度(He)。此外，采用 F统计值和遗传
一 致度(I)(genetic identity)来衡量居群间遗传分化
程度和遗传相似性，遗传分化用 Wrght(1978)的 F
统计量(1一FIS)×(1-Fs )=(1一FIT)来度量，其中的
FIS和 FIT分别表示整个物种的基因频率和居群平
均的基因频率偏离 Hardy-Weinberg遗传平衡的程
表 2 葫芦苏铁 5个居群的遗传多样性 (平均值±SD)
Table 2 Genetic diversity in 5 populations of Cycas changjiangensis(mean~SD)
度，F 则表示居群间的遗传占总遗传变异的比率。
2 结果与分析
2．1基因水平的遗传变异性
葫芦苏铁 5个居群的 6个酶系统，l3个基因位
点中有 10个是多态的，其中，DIA一1，DIA一2和DIA一
3为单态位点。多态位点百分率为 46．2 ～61．5 9／6
(平均为 56．9 )，水田居群明显低于其它居群，每
个位点等位基因平均数(A)为 1．62。观察杂合度
(Ho)为0．105，雅加居群最小(O．054)，其次为东一
居群(0．081)，其它 3个居群均在 0．1以上。预期杂
合度(He)为0．164，各居群间差异不大(表 2)。
2．2葫芦苏铁的居群结构(分化程度)
表 3给出了葫芦苏铁 5个居群 10个多态位点
的F统计分解值。在葫芦苏铁 5个居群中，杂合体
过量位点有ACP一5、DIA一4、EST-5、EST-6和 EST一7
等五个位点，其它位点杂合体比率均小于期望值。
遗传变异的绝大部分(93．6 )存在于居群内，而仅
6．4 存在于居群间。与其它裸子植物和其它苏铁
植物相 比，葫芦苏铁居群间的遗传分化度(FST一
0．064)较低。由N一(卜F )／4 Fs 算出基因流N一
3．656，与其它裸子植物和其它苏铁植物相比，葫芦
苏铁居群间基因流较大。
为了进一步分析居群间的遗传分化程度，计算
出了Nei的遗传一致度(I)和遗传距离(D)(数值未
列出)，各居群间遗传相似性很高(0．97～1．00)，均
高于所有物种的平均值(0．956)(Gottlieb，1981)，而
遗传距离则在 O～0．03之间。
利用遗传距离数据进行聚类分析(UPGMA)法
可构建一个聚类图(图 1)，可见葫芦苏铁 5个居群间
的遗传分化不明显，可能与居群间的距离不远有关。
表 3 葫芦苏铁 5个居群 lO个多态位点的 F统计值
Table 3 Summary of F—statistics at 10 loci of 5
populations in C．changjiangensis
3 讨论
根据 Hamrick等对 220个属、662个物种的分
析及 Lin等的综合分析报道(表 4)，葫芦苏铁的居
群内多态位点百分率为 P=56．9 ，与裸子植物平
均值接近，高于濒危物种平均值，在苏铁类植物中亦
居于较高水平；平均期望杂合度指数(He=0．164)
高于所有物种平均值(0．150)及裸子植物(0．151)，
及高于濒危物种(0．056)，与 C．siamensis(O．134)接
近，但高于其它苏铁植物；平均观察杂合度(Ho=
0．105)也与 C．siamensis(0．114)接近，但明显高于
其它苏铁植物。葫芦苏铁的大部分变异存在于居群
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6期 简曙光等：葫芦苏铁遗传多样性的等位酶分析 569
之内，5个居群的 F。 仅为 0．064，远低于所有物种
的平均值(0．228)及濒危物种平均值(0．151)，稍低
于裸子植物平均值(0．073)，但明显高于 C．taitun—
gensis。杂合体过量位点达 50 9／6，较一般濒危物种
都要高。
DY
WX
ST
YJ
WQ
0．03 0．02 0．01 0．00
l l l I L L l
图 1 葫芦苏铁 5个居群遗传距离(D)聚类图
Fig．1 Cluster dendrogram of 5 populations of C．
changjiangensis based on genetic distance(D)
表 4 葫芦苏铁和其它植物类群遗传变异水平和居群
分化的比较(引自Hamriek等，1979；Lin等，2000)
Table 4 Genetic variation and population differentiation
for C．changJiangensis as compared to other plant groups
植物类群
Plant groups
遗传变异性
Genetic variation
A P( ) Ho }
所有物种 Al species 1．97
濒危物种 Endemic 1．48
裸子植物 Gymnosperms 1．83
Cycas changJiangensis 1．62
C．taitungensis 1．07
C．pectinata 1．82
C．pectinata var．elonga 1．4 1
C．siamensis 1．48
C．siamensis sp．clivicola 1．47
Zanzia pumila 1．21
Macrozamia conzmunis 1．61
注：A、P、Ho、He等同表2。Note：A，P，Ho，He，the same as Tab1e 2．
综上所述，葫芦苏铁居群表现出较高的遗传变
异性及居群间低遗传分化程度，这一方面可能是由
其自身遗传机制决定，另一方面可能由于所取的几
个居群间距离较小(最远的也不过 30 km)，分布范
围狭窄的缘故。
Hamrick等(1979，1987，1989，1992)的研究结
果表明，影响居群遗传变异大小的主要因素依次为
繁育系统、分布范围和习性。遗传变异最高的植物
类群是那些寿命长、地理分布广、异交为主、风媒传
粉、结实率高且存在于演替阶段末期群落中的物种。
苏铁属植物为多年生木本，其寿命很长(可达千年以
上)，以异交为主，结实量大，且历史上地理分布较
广，这些特征均有利于居群遗传变异的保持和积累，
也是本研究发现存在较高遗传变异性的主要原因，
与葫芦苏铁形态变异较大相吻合，对苏铁属其它物
种的研究也得出了类似的结果(Yang等，1996)。
影响居群间基因流大小及居群遗传结构的因素
很多，如繁育系统、分布范围、种子传播机制、演替阶
段等(Hamrick等，1989)。葫芦苏铁分布范围狭窄，
仅分布于海南省昌江县坝王岭方圆几十公里的地
方，由于雄花先熟(早熟约20 d)，虫媒传粉和动物传
播种子等因素，导致居群间基因流增大，从而避免居
群间出现过高的分化。
保护物种从某种意义上讲，就是保护其遗传多
样性。本研究中，葫芦苏铁居群内遗传变异大，而居
群间遗传分化较低，基因流大，因此，无论是迁地保
护或是就地保护，选取几个大的居群比从不同居群
取少量个体进行保护更为有效。理论上只要保护好
东一、王下和水田这几个居群，就可以有效地保护葫
芦苏铁的遗传多样性，实际情况是由于人为因素的
影响，有些居群破坏严重，如五仙桥居群仅存 20余
株，也应加强保护。因此，我们建议就地保护应保护
所有居群，迁地保护可从东一、王下和水田这三个生
态环境不同且生存植株较多的居群中取种源。
本实验得到中国科学院武汉植物研究所郎萍博
士和黄宏文研究员的大力帮助，谨致热忱谢意!
参考文献 ：
刘 念．1998．海南苏铁一新种i-J1．植物分类学报，36(6)：
552— 554．
吴 梅，黄向旭．1999．葫芦苏铁的核型分析i-J1．热带亚热带
植物学报，7(3)：207—209．
黄宏文．2000．超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电
泳方法介绍一种高效、快速的生物同工聘分析方法i-J1．武
汉植物学研究，18(3)：224—228．
Cheng TQ(陈潭清)，Wang DY(王定跃)，Liu N(刘 念)．
1996．An Isoenzymes Study Cyc．s in China[A]．In：Wang
FX(王 发 祥 )，Liang HB(梁 惠 波)，Cheng TQ(陈 潭 清)
(eds)．Cycads in ChinalM1．Guangzhou：Guangdong science
and technology press，191— 198．
Ge S(葛 颂)．1994．Isozyme and Plant Evolutionary Biology
l,A,1．In：Cheng JK(陈家宽)，Yang J(杨 继)．Plant Evolu一
(下转第 561页 Continue on page 561)
案㈣
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6期 欧志英等：高温下杂交稻培矮 64S／E32与其亲本的光合和抗逆参数的比较 561
Jinn TL．Chen YM。Lin CY．1995．Characterization and physi—
ological function of class I low—molecular-mass，heat shock
protein complex in soybean[J]．Plant Physiol，108：693—
7O1．
Krause GH，Weis E．1 984．Chlorophyll fluorescence as a tool
in plant physiology，Ⅱinterpretation ot fluorescence signals
EJ]．PhotosynRes，5：139—157．
Lin ZF(林 植芳 )，Li SS(李双 顺 )，Lin GZ(林 桂 珠)，et a1．
1984．Superoxide dismutase activity and lipid peroxidation in
relation to sencence of rice leaves(超氧化物歧化酶及脂酯过
氧化与水稻叶片衰老的关系[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，
26(6)：605—615．
Murchie EH，Chen YZ，Hubbart S，et a1．1999． Interactions
between senescence and leaf orientation determine in situ
patterns of ph0t0synthesis and ph0toinhibiti0n in field—grown
rice[J]．PlantPhysiol，119：553—563．
Oren-Shanir。Pick U．Avron M．1990．Plasma membrane po—
tential of the alga Dunaliella and its relation to osmoregula—
tion[J]．Plant Physiol，93：403—408．
Patterson BD，Payne LA，Chen YZ，et a1．1984．An inhibitor
of catalase induced by cold inchilling—sensitive plants[J]．
Plant Physiol，76：1 014— 1 018．
Peng CL(彭长连)。Chen SW(陈少薇)，Lin ZF(林植芳)，et a1．
2000．Detection of antioxidative capacity in plants by scav—
enging organic free radical DPPH‘(用有机 自由基 DPPH‘
法评价植物抗氧化能力)[J]．Prog Biochem Biophys(生物
化学与生物物理进展)，27(6)：367—370．
Schreiber U，Schliwa U，Bilger W ．1986．Continuous recording
of photochemical and non-hotochemical quenching of chloro。
phyl fluorescence quenching with a new type of modulation
fluorometer[J]．Photosyn Res，10：5 1—62．
Sarry JE，Montillet JL，Sauvaire Y，et a1．1 994．The protective
function of the xanthophyl cycle in photosynthesis[J]．
FEBS Let，353：147—150．
Schreiber U．Armond PA． 1 978． Heat-induced changes of
chlorophyll fluorescence in isolated chloroplast and related
heat—damage at the pigment level[J]．Biochim Biophys Ac—
ta，502：138— 151．
Wang SJ(王淑俭)，Gao ZY(高远 志)，Peng WB(彭 文博)，et
al，1994．Cmprehensive evaluation on heat resistance of dif—
ferent wheat varieties(d~麦不同品种抗热性综合评价)EJ]．
Acta Agric Univ Henan(河南农业大学学报)，28(4)：339—
343．
Weis E，Berry JA．1988．Plant and high temperature stress
[A]．In：Long SP，Woodward FI(Eds．)．plant and tempera—
ture[M]．Symp Soc Exp Biol，Cambridge Company of Biolo—
gist，42：129— 346．
．址 ． ．． ．． ．． ．． ．．址 ．址 ． ． ．． ．． ． ． ． ． ．- ．． ． ． - ．- ．-址 ． ． ． - ．- ．- ．． ．- ．． - ．
(上接第 569页 Continue from page 569)
tionary Biology[M]．Wuhan：Wuhan University Press，1 53
— — 208．
Gottlieb LD．1981．Electr0phoretic evidence and plant popula—
tions[J]．Prog Phytochem，7：1—46．
Ge S(葛 颂)，Hong DY(洪德元)．1998．Biosystematic stud—
ies on Adenophora potaninii Korsh．Complex(Campanulace—
ae)IV．Allozyme variation and differentiati0n[J]．Acta Phy—
totax Sin(植物分类学报)，38(6)：431—438(in Chinese)．
Hamrick JL，Godt MJW ．1 992．Sherman—broyles SL．Factors
influencing levels of genetic diversity in woody plant species
[J]．NewForests，6：95—124．
Hamrick JL，Linhart YB，Mitton JB．1979．Relationships be—
tween life history charcteristics and electr0ph0reticaly de—
tectable genetic variation in plant[J]．Ann Rew Ecol Syst，
10：173— 200．
Hamrick JL，Godt MJW． 1989． Alozyme diversity in plant
species[A]．In：Brown AHD，Clegg M T。KahlerAL(eds)．
Plant PopulationGenetics，Breeding，andGeneticResources
．址 ．址 ． ．‘t．址 ．址 ．址 ．址
[M]．Sunderland，Mass：Sinauer．6：95—124．
Hamrick J L．1 987．Gene flow and distribution of genetic vari—
ation in plant populati0ns[A]． In：Urbanka K．Differentia—
tion Patterns in Higher Plants[M]．New York：Academic
Press，53— 67．
Lin TP，Sun YC，Lo HC，et a1．2000．Low genetic diversity of
Cycas taitungensis(Cycadaeeae)，an endemic species in Tai’
wan，revealed by allozyme analysis[J]．Taiwan J For Sci，
15(1)：13—9．
Swofford DL Selander RB．1981．Biosys一1[C]．University of
Ilinois Urhana-Champaign．
Wendel JF，Weeden NF．1 989．Visualization and interpretation
of plant isozyme[A-1．In Soltis：D E Soltis P S．Isozyme in
Plant Biology[M]．Portland：Dioscorides Press，9—63．
Yang SL，Meerow AW ．1996．The Cycas pectinata(Cycadace—
ae)complex：genetic structure and gene flow[J]．Int J Plant
Sci，157(4)：468—483．
维普资讯 http://www.cqvip.com