全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(3)：400— 403 2009年 5月
影响杜仲悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙因素的研究
叶青华，王亚琴 ，朱 媛
(华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 510640)
摘 要 ：研究了外源激素 2，4-D、NAA、6-BA、KT的不同组合以及营养添加物水解酪蛋 白、酵母提取物对杜仲
悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙的影响。结果表明，在 2．0 mg／L 2，4一D的培养基中分别添加 1．0 mg／L NAA、0．5
mg／L 6-BA、0．5 mg／L KT可提高桃叶珊瑚甙含量；在培养基中添加水解酪蛋白和酵母提取物均能促进桃叶
珊瑚甙的合成，以添加 100 mg／L水解酪蛋白和 15 mg／L酵母提取物时其含量最大。初步得出桃叶珊瑚甙合
成的最适培养条件为添加 2．0 mg／L 2，4一D+1．0 mg／L NAA+0．5 mg／L 6-BA+0．5 mg／L KT+lOOmg／L水
解酪蛋白+15mg／L酵母提取物的 MS培养基。
关键词：杜仲；桃叶珊瑚甙．夕 源激素组合；营养添加物
中图分类号：Q943．1，Q946．8 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2009)03—0400—04
Studies on factors affecting aucubin production
from the suspension cell of Eucommia ulmoides
YE Qing-Hua，WANG Ya—Qin ，ZHU Yuan
(Colege of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)
Abstract：Factors affecting aucubin production from the suspended cel of Eucommia ulmoides，such as the different
exohormone combination of 2，4-D，NAA，&BA，KT and nutrients including casein hydrolysate and yeast extract，were
investigated．The results showed that the production of aucubin could be improved in media with 2．0 mg／L 2，4-D，
1．0 mg／L NAA，0．5 mg／L 6-BA and 0．5 mg／L KT．Nutrients including casein hydrolysate and yeast extract could
improve the production of aucubin，the optimal concentration was 100 mg／L casein hydrolysis and 15 mg／L yeast ex—
tract．Therefore，the optimal conditions for the production of aucubin were MS media with 2．0 mg／L 2，4-D，1．0 mg／
L NAA，0．5 mg／L 6-BA，0．5 mg／L KT，100 mg／L casein hydrolysate and 15 mg／L yeast extract．
Key words：Eucommia ulrnoides；aucubin；the exohormone combination；nutrients
杜仲(Eucommia ulmoides)是杜仲科杜仲属植
物，是中国特有的贵重中药材，其药用成分包括桃叶
珊瑚甙、绿原酸、总黄酮、京尼平甙、京尼平甙酸等。
其中，次生代谢物桃叶珊瑚甙(Aucubin，简称 Au)
是一种重要的生物活性物质，具有清湿热、利小便、
镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等作用，广泛应用于医
药、日用化工和饲料等行业。它能促进干细胞再生，
明显抑制乙型肝炎病毒 DNA的复制，其甙元及有
效多聚体是一种抗菌素(李长恭等，2002；管淑玉等，
2003)。植物细胞具有全能性及多条代谓}途径，在培
养基中添加外源激素及营养物改变培养条件会使代
谢朝所需终产物方向发展，从而达到提高次级产物
含量的目的(甘烦远等，1991)。本文在研究碳源、培
养基类型及其 pH等影响因子的基础上(王亚琴等，
2007)，对外源激素 2，4一D、NAA、6一BA、KT的不同
组合以及营养添加物水解 酪蛋 白、酵母提取物对杜
收稿 日期：2008一O1—24 修回日期：2008—12—30
基金项目：广州市科技计划项目(2004J1一C0231)；广东省国际合作项目(20041350201021)[Supported by Science andTechnology Project ofGuangzhou
(2004Ji—C0231)；International Cooperation Project of Guangdong Pro~nee(2004B50201021)]
作者简介：叶青华(1983一)，女 ，硕士，主要从事植物基因工程研究，(E-mail)yeqlnghua2002@yahoo．com．en。
·通讯作者(Author for correspondence)：博士，从事植物基因工程与生物制药等研究，(E-mail)yqwang@scut．edu．cn
3期 叶青华等：影响杜仲悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙因素的研究 401
仲悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙的影响进行了详细的研
究，旨在筛选杜仲次生代谢物桃叶珊瑚甙合成的最
适培养条件，这对提高杜仲细胞培养物中次生代谢
物产率 ，实现大规模生产具有重要意义。
1 材料和方法
1．1实验材料
供试材料为采自广东乐昌县杜仲基地的种子。
1．2愈伤组织的诱导
杜仲愈伤组织系由杜仲种子萌发的无菌苗真叶
诱导。在继代培养 2次后获得了生长均一、质地疏
松、分散度高的愈伤组织。
1．3培养基
MS基本培养基附加不同的外源激素组合和营养
添加物，pH5．8，在0．105MPa、121℃下灭菌2O min。
1．4培养条件和悬浮细胞系的建立
取生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织
1．5 g接种到装有 lO0 mL液体培养基的250 mL的
三角瓶中，在转速为 l10 r／rain，温度为(25±2)℃，
全天光照，光照强度 72／*mol·m-。·s 的条件下悬
浮培养。培养 2～3周后，培养液中即有悬浮单细胞
或小细胞团出现。继代培养时，加入等量的新鲜培
养液，摇匀 ，静置，待大细胞团沉降后分瓶，不需过
滤，即可得到不含大细胞团块 的培养物。按上述步
骤通过3～4次继代培养，即可得到只含单细胞或小
细胞团的培养物。
35 3
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NAA concent rat i on(rag／L)
图 1 2，4-D与 NAA组合对杜仲悬浮
细胞生产桃叶珊瑚甙的影响
Fig．1 Effect of 2，4-D and NAA on aucubin production
from the suspension cel of Eucommia ulmoides
1．5悬浮细胞培养物中桃叶珊瑚甙含量的 HPLC法
测定
将收集的杜仲干细胞(5O℃烘干2 h)置于 5O
mL容量瓶中，加30％甲醇溶液40 mL，振摇 5 min，
置冰箱中过夜。取出，放至室温，再振摇 10 min，加
3o 甲醇溶液至刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续
滤液用滤膜滤过后进样检 测。仪器为 Agilent
1100LC高效液相色谱仪，色谱柱为 XDB～C18(5
m，4．6×250 mm)，流动相为乙腈 ：水一3：97，进
样量 2O L流速 1．0 mL／min，柱温 25℃，检测波长
206 rim(杨小梅等，2003)。
2 结果与分析
2．1 2。4-D与 NAA组合对杜仲悬浮细胞生产桃叶
珊瑚甙的影响
以 2，4一D最佳浓度 2．0 mg／L为基础(王亚琴
等，2007)，分别加入不同浓度的NAA，结果如图 1
所示。当培养基中未添加 NAA时，细胞的生长量
是最大的；添加 NAA后，细胞生长量变少。说明当
培养基中存在 2，4一D时，NAA的添加不利于细胞
生长。而桃叶珊瑚甙的含量则随着NAA浓度的增
加逐渐增大，当NAA浓度增至 1．0 mg／L时，桃叶
珊瑚甙含量达到最大值；超过这个浓度时，桃叶珊瑚
甙的含量会下降。
2．2 2，4-D与 6-BA组合对杜仲悬浮细胞生产桃叶
珊瑚甙的影响
一 般来说，在组织培养过程中，细胞分裂素和生
长素同时使用有增效作用，按不同的比例配合可以
产生不同的效果。但是由于不同植物细胞的生理状
态和次生代谢产物不同，它们的协同作用没有规律
可循。本实验以 2，4一D最佳浓度 2．0 mg／I 为基
础，分别加入不同浓度的 6一BA观察悬浮细胞生长
和桃叶珊瑚甙的含量情况(图 2)。
从图2可以看出，细胞生长和桃叶珊瑚甙的合
成并不同步，当 6-BA浓度为 0．1 mg／L时，细胞生
长量最大，但此时桃叶珊瑚甙的含量还没达到最大。
随着 6一BA浓度的增加，桃 叶珊瑚甙的含量会逐渐
增大，当6-BA浓度增至 0．5 mg／I 时，桃叶珊瑚甙
含量达到最大值。超过这个浓度时，桃叶珊瑚甙的
含量会下降。
2．3 2。4一D与 KT组合对杜仲悬浮细胞生产桃叶珊
瑚甙的影响
以2，4一D最佳浓度 2．0 mg／L为基础，分别加
人不同浓度的 KT。当添加 KT的浓度达到 0．3
mg／L时，细胞生长量比没添加 KT时大，但此时桃
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面 一 一 厘
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402 广 西 植 物 29卷
叶珊瑚甙的含量比未添加 KT时低，当 KT浓度增
加到 0．5 mg／L时，桃叶珊瑚甙的含量迅速增大并
超过未添加 KT前的含量(图 3)，初步说明添加一
定浓度的KT对桃叶珊瑚甙的合成有促进作用。
盘。⋯
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l Uw 。 。 ．。
厂] I
．
0 O．1 0．3 0．5
KT concent rat i on(rag／L)
图 3 2，4-D与KT组合对杜仲悬浮
细胞生产桃叶珊瑚甙的影响
Fig．3 Effect of 2，4-D and KT on aucubin production
from the suspension cell of Eucommia ulmoides
2．4添加物对杜仲悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙的影响
在研究植物细胞生长培养基成分配比时，经常
在培养基中添加水解酪蛋白、酵母提取物或椰乳等。
由于这些物质是一些成分复杂的有机添加剂，可以
增加培养基内部的碳源及氮源的含量，改变不同氮
源的比例，增加调节剂的浓度。因此，一定程度上这
些添加物对细胞生长及次级代谢物的积累有明显的
改善作用(杨世海等，2006)。
2．4．1水解酪蛋 白对杜仲 悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙
的影响 水解酪蛋白(Casein hydrolysis，简称 CH)是
植物细胞培养中常用的培养基添加物，本实验在附加
2．0 mg／L 2，4-D+1．0 mg／L NAA+0．5 mg／L 6-BA
+O．5 mg／LKT的 MS培养基中添加不同浓度的水
解酪蛋白，结果如图 4所示。添加水解酪蛋白后 ，细
胞生长量逐渐增大，当水解酪蛋白浓度为 300 mg／L
时 ，细胞生 长量 最大。而水解 酪蛋 白浓度 为 100
mg／L时，桃叶珊瑚甙含量最高，是添加水解酪蛋白
前的2倍，当超过这个浓度时，桃叶珊瑚甙的含量缓
慢下降，但均高于添加前的含量。
I I Dw
臣2刁 Au concentrat i on
0 1O0 200 300 400
CH concentrat i On(mg／L)
20
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图 4 水解酪蛋白对杜仲悬浮细胞
生产桃叶珊瑚甙的影响
Fig．4 Effect of casein hydrolysis on aucubin production
from the suspension cell of Eucommia ulmoides
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图 5 酵母提取物对杜仲悬浮细胞
生产桃叶珊瑚甙的影响
Fig．5 Effect of yeast extract on aucubin production
from the suspension cell of Eucommia ulmoides
2．4．2酵母提取物对杜仲悬浮细胞 生产桃叶珊瑚甙
的影响 本实验在附加 2．0 mg／L 2，4一D+1．0 mg／L
N．au~+0．5 mg／L 6一BA+0．5 mg／LKT的MS培养基
中添加不同浓度的酵母提取物，结果如图5所示，酵
母提取物对细胞生长影响较大，当浓度为 10 mg／L
时，细胞生长量最大。桃叶珊瑚甙的含量随酵母提
取物浓度的增 加而增大 ，当酵母 提取物浓度为 15
mg／L时，桃叶珊瑚甙含量最高，是添加酵母提取物
前的2倍，当超过这个浓度时，桃叶珊瑚甙的含量缓
慢下降，但均高于添加前的含量。
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3期 叶青华等：影响杜仲悬浮细胞生产桃叶珊瑚甙因素的研究 403
3 讨论
武利勤等(2005)在培养新疆雪莲悬浮细胞和次
生代谢物黄酮的合成中认为不同的植物生长物质组
合可以调节细胞的次生代谢而影响 目的成分的合
成。本实验在2．0 mg／L 2，4-D的培养基中分别添
加 1．0 mg／L NAA、0．5 mg／L 6-BA、0．5mg／L KT
可以提高桃叶珊瑚甙含量；由此可见不同外源激素
配比对次生代谢物合成的影响的确很大。这与作者
在研究单一外源激素对桃叶珊瑚甙含量的影响时所
得结果不太一致(王亚琴等，2007)。在单因素的研
究中，NAA浓度在 2．0 mg／L时 ，桃叶珊瑚甙含量
最高；而在激素组合的研究中，由于其它激素的互作
影响，所需 NAA的含量降低了50 。
在植物细胞培养合成次生代谢产物的研究中，
营养物的添加常作为提高目的产物产量的一种手
段。通过外源营养物的添加，研究杜仲愈伤组织细
胞次生代谢产物的积累和调控 ，有利于杜仲愈伤组
织细胞培养系统走 向工业化。水解酪蛋 白是一种由
多种氨基酸组成的复合营养物，有研究证明它可以
显著提高裂叶茄培养物中澳洲茄胺的含量(Indrzy—
anto&Erawatt，1995)；酵母也是一种成分复杂的
营养物，可以通过活化苯丙烷类途径中的关键酶促
使一些次生代谢物积累(Endress，1994)。本实验研
究了水解酪蛋白、酵母提取物对杜仲悬浮细胞生产
桃叶珊瑚甙的影响。结果表明，在 附加 2．0 mg／L
2，4一D+ 1．0 mg／L NAA十0．5 mg／L 6-BA+ 0．5
mg／LKT的MS培养基中添加 100 mg／L水解酪蛋
白和 15 mg／L酵母提取物对桃叶珊瑚甙的合成有
明显的促进作用。
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