全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(4)：455— 458 2009年 7月
药用植物草珊瑚 RAPD扩增条件优化
张志勇1，何 平 ，0
(1．中国科学院 西双版纳热带植物园，云南 勐腊 666303；2．酲南大学 生命科学学院，
重庆 400715；3．三峡库区生态环境教育部重点实验室，重庆 400715)
摘 要：采用 CTAB-DNA提取方法，从草珊瑚植物的嫩叶中提取总 DNA。以此 DNA为模板 ，优化了草珊瑚
RAPD-PCR的反应条 件。结果表 明，PCR扩增体系最适宜 的条件为 ：反应 体积 25 L，内含 2．5 mmol／L
MgZ+、1．0U DNA聚合酶、0．4／*mol／L引物 、6O ng模板 DNA和 0．16 mmol／L dNTP。扩增程序为 ：94℃预
变性 2 min；94℃变性 30 S，37℃复性 30 S，72℃延伸 80 S，40个循环；72℃延伸 10 min；4℃保存 10 min。
关键词：草珊瑚 ；RAPD；条件优化
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2009)04—0455—04
Optimization of RAPD amplified
。
~dicinal plant Sarcandrain metlll b a
conditions
glabra
ZHANG Zhi-Yong ．HE Ping ，0
(1．Xishuangbanna Tropical Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Mengla 666303，China；2．Colege
0厂 fe Sciences，Southwest University，Chongqing 400715，China；3．KeyLaboratory of
Eco-Environment in Three-Gorges Reservior Area，Chongqing 400715，China)
Abstract：The method 一DNA isolation was optimized and used tO extract genomic DNA from the tender leaves
of Sarcandra glabra．Based on the genomic DNA。some essential factors that affect the result of RAPD were com-
pared and the optimal RAPD system for S．glabra was established．The results showed that the optimal concentration
of five important components such as Mg + ，1、aq DNA polymerase，primer，template DNA，and dNTP in 25 L
RAPD reaction system were 2．5 mmol／L，1．0U，0．4／lmol／L，60 ng，0．16 mmol／L respectively．Modified thermal
profile consisted of an initial denaturation step at 94℃ for 2 mins，folowed by 40 cycles of 94℃ for 30s．37℃ for 3O
S，72℃ for 80 S，and a final exposure to 72℃ for 10mins．Then stored in 4℃ for 10 mins．
Key words：Sarcandra glabra；RAPD；optimization
草珊瑚(Sarcandra glabra)，又名九节茶、接骨
金粟兰等，隶属于金粟兰科(Chloranthaceae)草珊瑚
属(Sarcandra)。其全草药用，具活血祛瘀、消肿止
痛、接骨续筋功效，民间常用来治疗跌打损伤，风湿
痹症等 (江 苏新 医学 院，1997；中 国药 典 委员 会 ，
2005)。现代医学研究表明草珊瑚全草含黄酮甙、内
酯、香豆素、挥发油、有机酸及酚类等。黄酮类化合
物为其最主要的活性成分，含量最多(王浴生等，
2000)，是一类纯天然化合物，它的提取工艺仍是研
究热点(罗显华等，2007)。
目前国内外对草珊瑚的研究很多，化学成分方
面，Luo等(2005)从草珊瑚中分离得到两种三萜皂
苷，Lj等(2006)年得到 glabraoside A 和 dihydroch—
alcone，并用光谱分析法阐明了二者结构，郁建生等
(2007)探讨草珊瑚总黄酮提取工艺及其含量动态变
化；药理方面，用动物实验观察表明草珊瑚有明显的
收稿 日期：2007—11-16 修回日期 ：2008-02—28
基金项目：国家自然科学基金(30070080)[Supported by the National Natural Science Foundation of China(a0070080)]
作者简介：张志勇(1980一)，男，山西左权人，研究实习员，硕士 ，主要从事植物保护生物学与植物分类研究．(E-mail)zzy@xtbg．org．en。
456 广 西 植 物 29卷
抗菌、抗炎和镇痛效果(蒋伟哲等，2000)和抗肿瘤作
用(孙文娟等，2003)；群 落学 方面，对其群落植物物
种多样性 (张志 勇等 ，2007)、群落特征及其主要种
群生态位等进行研究(张益锋等，2007a；2007b)。分
子方面的研究报道极少。
Wiliams等 1990年 创 立 的 RAPD 技 术 是
DNA分子标记技术的一项创新 。它可直接反应染
色体组 DNA多态性，不受环境限制，具操作简单快
捷 、成本低 、通用性好 、灵敏度高，且无需预知基 因组
的相关分子生物学信息等优点而广泛应用于遗传多
样性(邓传良等，2007；张仁波等，2007；Dawson等，
1993)、生物种群划分 (沈曦等，1999；Brauner等，
l992；Buren等，l994)、遗传 图谱构建 (魏伟等，
1999)、基因定位(林菲等 ，2002)等方面的研究 。在
用 RAPD技术进行植物种的遗传多样性分析时，首
先要建立稳定的反应体系，以确保其结果的可靠性、
重复性 (孙丽娜等 ，2007)。为此 ，本 实验就草珊瑚
RAPD反应中的模板 DNA浓度、引物浓度、dNTPs
浓度、Mg 浓度、Taq酶用量等因素进行实验，初步
建立稳定性好、重复性高的 RAPD反应体系，为深
入分析草珊瑚遗传多样性提供了基础资料。
1 材料与方法
1．1材料来源
所用草珊瑚 的幼叶采 自重庆北碚缙云山杉木园
(冰壶中保存)。
1．2主要试剂及仪器
TaqDNA 聚 合 酶 5 U／ L、40个 随 机 引 物
(Sangon公 司 )10× Buffer、MgCI2、2．5 mmol／L
dNTP、80O0bp DNA Ladder Marker、琼脂糖 (西班
牙分装 )、CTAB、PVP、EDTA、Tris碱、核 酸染料一
GoldView。2 CTAB提取缓 冲液 ，TE(pH8．0)缓
冲液灭菌保存，备用等。
仪器：MyCyclerTM PCR仪(B10一RAD)，凝胶
成像系统(Universal Hood 1I，BIO—RAD)，台式高
速冷冻离心机 (TGL一16M)，Smart SpeeTM plus
Spectrophoto—Meter (BIO—RAD， USA )，MDF—
U4086S型三洋超低温冰箱，电泳仪 (PowerPac300，
BIO—RAD)及各种规格电泳槽。
1．3总 DNA提取及浓度测定
总 DNA提取方法为 CTAB法。取 1 g左右的
幼嫩叶片，吸干水分放人预冷的研钵(研钵置于冰
上)，加入 PVP及石英砂，再加入液氮反复研磨至冻
粉状 。迅速转入 5 mL离心管中，加人 4 mL CTAB
(65℃预热)及 100 L 2一疏基乙醇，混匀后于 65℃
水浴 I h(期间轻摇数次)。
吸上清液，加入等体积的抽提液(氯仿 ：异戊醇
一 24：1)，10 000 g离心 10 min，再吸上清液再加人
抽提液反复离心，直至上清液较为透亮。在上清液
中加入 1／10体积的乙酸钠 ，2倍体积的 4℃无水 乙
醇 ，立即有 白色絮状物 出现。
用吸头将絮状物吸到 1 mL离心管中，加入 4
℃无水乙醇离心漂洗 2次 ，倒掉 乙醇 ，置于室温下风
干至半透明。加入 100 L TE溶解 DNA。取 l L
DNA样品稀释 25倍，在 Smart SpecTM plus Spec—
trophoto—Meter上测定浓度、260及 280 nm处 的吸
收值 以及 OD260／280的比值。
1．4 RAPD反应体系的初步优化
1．4．1 RAPD主要成分用量的优化 参照汪小全等
(1996)的方法，RAPD反应体系的 5种主要成分
Mg抖、TaqDNA聚合酶、引物、DNA模板、dNTP的
用量设置 7个浓度梯度(表 1)。以筛选得到的$13
号(5，_TTCCCCCGCT一3 )为随机引物 ，以草珊瑚基
因组 DNA为模板进行 RAPD反应体系的单因优化
实验。当进行某一因素水平实验对，其他因素均固
定在第 3个浓度梯度。所有反应体系均为 25 L。
表 1 RAPD反应体系中 5种成分用量
Table 1 Different amounts of five important
components used in RAPD reaction
1．4．2扩增程序的优化 筛选出各因素的最佳水平
组合后，在基本扩增程序的基础上，主要针对主循环
的变性时间、复性温度、延伸时间设置 6种程序(表
2)，其他参数不变。
1．4．3扩增产物检测 RAPD产物经 1．0％琼脂糖
凝胶(含 GoldView)电泳(10 V／cm，50 mins)分离，
每块凝胶加一个 230~-8 000 bp已知分子量的DNA
4期 张志勇等：药用植物草珊瑚 RAPD扩增条件优化 457
表 2 6种不同的扩增程序
Table 2 Six different amplification programs
号 D 思 N
o．
time(min) temDerature time(min)
1．O
1．0
0．5
0．5
1．0
0．5
35
35
35
37
37
37
4／3
2
2
2
4／3
4／3
2 结果与分析
2．1 RAPD反应体系主要成分的优化
从图 l：A 可看 出，Mg抖在 1．0 mmol／L是无扩
增条带，在 1．5～2．0 mmol／L时扩增产物条带较模
糊 ，在 3．5～4．0 mmol／L时个别扩增产物消失，所
以选择 2．5～3．0 mmol／L，相 比之下 2．5 mmol／L
时扩增产物效果要好些 。引物 的用量对 RAPD体
系有一定的影响(图 1：B)，在 0．40／~mol／L时，扩增
的条带最清晰。TaqDNA聚合酶(图 1：C)对 RAPD
体系有较大的影响，在 1．00U 时条带最亮 ，这也是
从经济角度和实验效果综合考虑。在实验设置的范
围内，模板 DNA的用量 (图 l：D)和 dNTP的用量
(图1：E)对 RAPD体系影响不大，4O～8o ng的模
板 DNA用量、0．12～0．32 mmol／L dNTP均可扩
增出稳定的条带，从扩增效果和经济角度综合考虑，
选用的模板 DNA用量为 60 ng、dNTP浓度为 0．16
mmol／L。因 此，优 化 的 RAPD 反 应 体 系 为：在
25 L反应体系中，Mg抖、TaqDNA聚合酶．引物、模
板 DNA和 dNTP 5种主要成分的适宜浓度或用量
分别为 2．5 mmol／L、1．0U、0．4 ttmol／L、6O ng模板
图 1 5种主要成分和 6种扩增程序对 RAPD反应体系的影响 (A、B、C、D、E巾的1—7见表1；F中的卜6见表2)
Fig．1 Effects of five components and six amplified programmes Oil RAPD reaction(1-7 in A、B 、C、D and E represent
concentration gradients indicated in Table 1；1—6 in F are the same as that in Table 2．A．Mg ：B
． Primer：
C．Taq DNA polymerase；D．Template DNA；E．dNTP；F．Different thermal programmes)
DNA 和 0．16 mmol／L dNTP。
2．2 RAPD扩增程序的优化
在优化的反应体系基础上，用 6种程序(表 2)
进行扩增，以程序 5和 6的效果最好，扩增的条带多
且清晰，但程序 6比5的特异性有所提高；程序 3次
之，扩增条带较多但模糊；程序 1和 2扩增的条带都
很模糊；程序 4最差，扩增效率较低，条带少且弱(图
1：F)。可能是程序 5与 6扩增时间较短，对酶活性
的保持相对会好些。由于程序 6比5的特异性好，
故确定程序 6为优化的程序。
2．3 RAPD扩增产物图
用 2．1中所得到的优化体系和 2．2中的第 6种
O
B
Ⅱ
d
O
a i2
忙
统
系
像
成
胶 。 凝 照
在 拍
n 中
№队
458 广 西 植 物 29卷
扩增程序进行扩增反应。图 2为引物 S13对部分草
珊瑚单株 总 DNA 的扩增 结果 图。从图 2可以看
出，扩增效果好 。
图 2 引物 s13对部分单株总 DNA的扩增结果
Fig．2 Amplification results of the total DNA
templates of a part of plants by S1 3
M：已知大小的标准核酸(23O～8 000 bp)；sm：杉木园
居群，阿拉伯数字表示不同的草珊瑚个体
M ：DNA marker(230— 8 000 bp)；sm：indicates the name
of Fir garden population，Arabic numbers represent
the different Sarcandra glabra individuals．
3 讨论
RAPD反应条件严格，由实验结果可知，Mg抖、
TaqDNA聚合酶、引物、模板 DNA、dNTP、反应缓
冲液及反应程序等因素的变化都会对 RAPD图谱
产生一定的影响，从而影响 RAPD分析 的准确性。
RAPD标记进行遗传多样性分析的前提条件就是首
先要保证 RAPD带谱的准确性和稳定性 。为获得
重复性和稳定性较高的RAPD带谱，在进行某一物
种的 RAPD分析前 ，花适 当时间与精力筛选最适宜
的 RAPD条件是很必要的(李钧敏等 ，2002)。虽然
RAPD反应涉及到诸多因子，但通过严格的控制反
应条件，尽量保证所有反应在同一反应体系下完成，
如使用同一厂家相同批号的 TaqDNA聚合酶，采用
相同的扩增程序，就能获得重复性好、稳定性高的结
果(邹喻苹等，2001)。
通过扩增条件优化实验，建立了药用植物草
珊瑚 RAPD-PCR扩增 体系最适 宜 的条件 ，即反应
体积 25／,I ，内 含 2．5 mmol／L M 、1．0U DNA
聚合 酶、0．4#mol／L引物、6O ng模板 DNA 和
0．1 6 mmol／L dNTP。扩增程序为：94℃预变性 2
mins；94℃变性 30 s，37℃复性3O s，72℃延伸 8O
s，40个 循 环 ；72℃ 延 伸 10 mins；4℃ 保 存 10
rains。为进一步进行草珊瑚种质 资源 的 RAPD分
析及其亲缘关 系、遗传 多样性研 究提供 了可靠 的
实验方法。
参考文献：
江苏新医学院．1997．中药大辞典(上册)[M]．上海 ：上海科学
技术出版社 ，42
王浴生，邓文龙，薛春生．2000．中药药理与应用[M]．北京：人
民卫生出版社，7】4
邹喻苹 ，葛颂 ，王晓东．2001．系统与进化植物学中的分子标记
EM]．北京 ：科学出版社，30—5O
中国药典委员会．2005．中国药典[M]．北京 ：化学工业出版社
出版，533
Brauner S，Crawford DJ，Stuessy TF．1992．Ribosomal DNA and
RAPD variation in the rare plant family Lactoridaceae[J]．Amer
J Bot，79：1 436—1 439
Buren RV，Andersen W R，Harper KT，et a1．1994．Evaluation the
relationship of autumn butercup(Ramunculus acriJbrmis var．
aesti~ lis)to some close congeners using random amplified poly—
morphic DNA[J]．Am r J Bot，81：514—519
Dawson IK，Chalmers KJ，Waugh R，et a1．1993．Detection and a—
nalysis of genetic variation in Hordeum spontaneum population
from Israel using RAPD markers[J]．Mol Ecol。2：151——159
Deng CL(邓传 良)，Liu J(刘建)，Zhou J(周坚 )．2007．Analysis
of population genetic diversity of Lycoris longituba (Amarylli-
daceae)by RAPD(长筒石蒜居群遗传多样性RAPD分析)口]．
Guihaia(广西植物)，27(3)：401—405
Jiang WZ(蒋伟哲)，Kong XL(孔晓龙)，Huang RB(黄仁彬)，ela1．
2O00．Studies on anti-inflammatory and antibacterial efects of ta-
belae Sarcandrae(肿节风片 的抗 茵和抗炎作 用研究)[J]．J
()uangxi Trod Chin Med iv(广西中医学院学报)，3：5O一52
Li JM(李钧敏)，Jin ZX(金则新)，Ke SX(柯世省)，et a1．2002．
Optimal choice for compo sitions in RAPD analysis of Heptaco—
diummiconioides(濒危植物七子花 RAPD条件的优化)EJ]．
C^ in Bull Bot(植物学通报)，19(4)：452—456
Li Y，Zhang DM ，Yu SS，et a1． 2006． A novel phenylpropanoid-
substituted cateehin glycoside and a new dihydrochalcone from
Sarcandra glabra[J~．Chinese Chonical Letters，17(2)：207-210
Lin F(林菲)，Li JB(李进斌)，Li CY(李成云)．et a1．2002．Iden—
tification of two avirulence genes in the rice blast fungus Magtm-
porthe grisea using random amplified polymorphic DNA(RAPD)
markers(利用 RAPD分子标记定位 2个水稻稻瘟病菌非致病性
基因)[J]．SciAgric Sin(中国农业科学)，35(9)：1 o79—1 084
Luo XH(罗显华)，Yu JS(郁建生)．2007．Separation and purifi—
cation of the flavonoids from Sarcandrae glabra with macro-
porous resin(大孔吸附树脂 分离纯化草珊瑚总黄酮的工艺研
究，[J]．Lishizhenivied and Mat ivied尺 (时珍 国医国药)，18
(11)：2703—2706
Luo YM，Liu AH，Zhang DM ．et a1．2005．Two new triterpenoid
saponins from Sarcandra glabra EJ]．J Asian Nat Pro Res，7
(6)：829—834
Shen X(沈曦)。Zhou KY(周开亚)，Wang YQ(王义权)，et a1．
1999．RAPD analysis of the genus Agkistrodon in China(中国
(下转第513页 Continue on page 513)
4期 曹红星等 ：应用 电导率法及 Logistic方程测试椰子耐寒性研究 513
参考文献 ：
Bao SW(鲍思伟)．2005．The adaptation of rhododendron fortu—
neis semi lethal temperature to natural temperature falling(云锦
杜鹃低温半致死温度对 自然降温 的适 应)EJ3．J Southwest
Univ Nationalities(西南 民族大学学报)，31(1)：99—102
Chan CL(陈长兰)，Jia JX(贾敬贤)，Gong X(龚欣)．1991．The ini—
tial study on the identification of coldness on Pear(Pyrm)(梨属植
物抗寒性鉴定初报)[J]．,Northern Hort(~方园艺)，1：1—3
Feng ML(冯美利)，Liu LY(刘立云)，Li J(李杰)．2008．Investi-
gation and analysis of coldness on dehiscent fruit and fruit-drop—
ping of coconut in Hainan(海南椰子寒害落 (裂)果调查初报)
rJ]．SouthChina Fruits(中国南方果树)，37(5)：49—51
Guo HL(郭海林 )，Liu JX(刘 建 秀)，Zhu XH(朱 雪 花)，et a1．
2006．Evaluation of cold resistance of Zoysia hybrids(结缕草属
杂交后代抗寒性评价)[J]．Acta Agrestia Sin(草地学报)，14
(1)：24—28
Gao HQ(高和琼)，Zhuang NS(庄南生 )，Wang Y(王英)．2007．
Research survey of coeonul breeding(椰子及其育种研究概况)
[J]．China Trop Agric-(中国热带农业)，1：24—25
Han LJ(韩联健)，Xu YF(徐月发)．2006．Investigation and A—
nalysis of situation dehiscent fruit and fruit-dropping of coconut
under coldness in Hainan(海南岛椰子寒 害落裂果情况 的调查
(上接第 458页 Continue from pa 458)
与分析)[J]．ChinJ Trop Agric(热带农业科学)，6：1—2
Li JC(李俊才)，Iju C(刘成)，Wang JZ(王家珍)．2007．Study on the
semi-lethal temperatures for European pear cultivars(洋梨枝条的低
温半致死温度)[J]．J Fruit s矗(果树学报)，24(4)：529-532
Sun CX(孙程旭)，Cao HX(曹红 星)，Chen ST(陈思婷)，el a1．
2009．Study on cold resistance of snake fruit by application of e—
lectrical conductivity and Logistic Equation(应用 电 导率 法及
Logistic方程测试蛇皮果抗寒性研究)[J]．Acta Agrie Jian—
gxi(江西农业学报)，21(4)：33—35
Wang CY．1986．Physioslgical and biochemical responses of plants
to chilling stressEJ]．Hortscience，21(1)：172—175
wang GH(王国烘)．1990．The present condition and potential of
coconut production in our country(我 国的椰子生产现状 与潜
力)r-j3．J Trop Crops (热带作物科技)，6：39-40
Xu Y(许瑛)，Chen FD(陈发棣 )．2008．The LI s0 and cold toler—
ance adaptability of Chrysanthemum during fl natural drop in
temperature(菊花 8个品种的低温半致死温度及其抗寒适应
性)l-J3．Acta Hort Sin(园艺学报)，35(4)：559—564
Zhu GH(朱根海)，Zhu PR(朱培仁)．1984．Seasonal variations of
cold hardiness under natural conditions and the effects of temper—
ature on dehardening in wheat(小麦抗冻性的季节变化以及温
度对脱锻炼的效应)[J]．J Nunjing Agric Univ(南京农业大
学学报)，2(2)：9—16
蝮属蛇类的RM D分析)EJ]．Acta Zoologic“Sin(动物学报)，
45(1)：40—48
Sun LN(孙 丽娜)，Yan YZ(严 一 字)，Wu JR(吴基 日)，et a1．
2007．Optimization of RAPD co nditions of Platycodon grand—
florus(桔梗 RAPD反应体系的优化)[J]．Guihaia(广西植物)，
27(5)：410—413
Sun WJ(孙 文娟)。Li J(李晶)，Lan FY(兰风英 )，et a1．2003．
Antitumor effect of Zhongjiefeng injection on mice liver cancer
Hep-A-22 and its toxicity(肿 节风 注射液抗小 鼠肝癌 Hep_A．
22的作用及毒性)I-J]．Chin Trad Patent Med(中成药)，25
(4)：313— 315
Wang XQ(汪小全)，Zou YP(fig喻苹)，Zhang DM(张大明)，eta1．
1 996．Problems in the use of RAPD the study of genetic diversi—
ty and systemctics(RAPD应用于遗传多样性和系统学研究中
的问题)[J]．Acta Bot Sin(Ca物学报)，38(12)：954—962
Wei w(魏伟)．Wang HX(王 洪 新 )，Hu ZA(胡 志 昂)，et a1．
1999．Primary studies on molecular ecology of Caragana spp．
populations distribution over Maowusu sandy grassland：from
RAPD data(毛乌素沙地柠条群体分子生态学初步研究：
DAPD证据)[J]．ActaEcol Sin(生态学报)，19(1)：16—22
Yu JS(郁建生)，Yu JP(郁建平)．2007．Study on extraction tech—
nics and variety trends of the flavonoids in Sarcandrae glabra
(草珊瑚总黄 酮提 取工 艺及其 含量 动态 变化)I-J]．Chin J
ChinMatMed(中国中药杂志)，32(4)：307—309
Zhang RB(张仁波)，Dou QL(窦全丽)，He P(何平)，et a1．2007．
Analysis of genetic diversity in Thuja sutchuenensis populations
as revealed by morphological and molecular data(濒危植物崖柏
遗传多样性研究)I-J]．Guihaia(广西植物)，27(5)：687—691
Zhang YF(张益 锋)。He P(何 平)，Wang F(王芳 )，et a1．2007．
Study on the community characteristics of Sarcandra glabra in
Mt．Jinyun(缙云山草珊瑚群落特征研究)[J]．J Southwest Univ
(Nat Sc E )(西南大学学报 ·自然科学版)，29(10)：87—91
Zhang YF(张益锋)，He P(何平)，Wang F(王芳)，et a1．2007．A
study of the niches of main species in communities with Sarcan—
draglabra populated in Mt．jinyun(缙 云山草珊瑚群落主要种
群生态位研究)[J]．J Southwest Univ(NatSci Edi)(西南大学
学报 ·自然科学版 )，29(8)：102—106
Zhang ZY(张志勇)，He P(何平 )，ji HC(冀花存)，et a1．2007．A
study of plant species diversity of Sarc~ndra glabra communities
in the Jinyun Mountains(缙云山草珊瑚 群落植物物种 多样性
研究)[J]．J Southwest Univ(Nat Sci Edi)(西南大学学报 ·自
然科学版)，29(2)：86—90