全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(1)：137— 139 2007年 1月
几种中药 DNA提取方法的比较研究
陈 莉 ，魏 莉 *，周 童 ，李敏瑜 ，覃玉斌 ，吴耀生
(广西医科大学 生物化学与分子生物学教研室，南宁 530021)
摘 要：以丹参 、绞股蓝 、三七为材料，分别采取 CTAB法和 SDS法提取基因组 DNA，并通过紫外分光光度法
和琼脂糖凝胶电泳对所提取的 DNA样品进行检测 ，将它们在 DNA产量、质量等方面的优缺点进行总结。结
果表明，CTAB法能从丹参、绞股蓝中提取高质量的DNA，而三七的DNA更适合用 SDS法提取。
关键词：丹参 ；绞股蓝 ；三七 ；基 因组 DNA；DNA提取
中图分类号：Q946．2 文献标识码 ；A 文章编号：1000—3142(2007)01—0137—03
Study on isolation methods of genomic DNA
● 11 ● _ l 1 1 ● ●
in several L二|llneSe herbaI nlem ClIIeS
CHEN Li，WEI Li ，ZHOU Tong ，LI Min-Yu ，
QIN YU-Bin ，WU Yao-Sheng
(Department ofBiochemistry andMolecularBiology，GuangxiMedical University，Nanning 530021，China)
Ai~tract：CTAB method and SDS method were used to extract genomic DNA from Salvia miltiorrhiza Bunge， 一
nostemma pentaphyllum and Panax notoginseng．The DNA samples obt~ned by the above methods were tested by
ultraviolet spectrophotometry and agarose gel electrophoresis．Based on the comparative analysis of yield and quality
of the DNA samples by different methods，CTAB method was found to be optimal to produce high quality DNA from
Salvia miltiorrhiza Bunge and G3mostemma pentaphyllum，SDS method was more effective to Panaxnoto~nseng．
Key words：Salvia railtiorrhiza Bunge；Gynostemma pentaphyllum ；Panax notoginseng；genomic DNA；DNA ex-
traction
获取高质量的DNA样品是进行分子生物学研
究的必要前提，同时也是中药分子诊断技术中的关键
环节。由于不同植物代谢产物尤其是多糖、多酚及其
他未知次级代谢产物种类及含量的不同，基于植物化
学组分 的特异 性，难 以找 到一 种适 合于所 有植 物
DNA提取的方法，即不同化学组分的植物需要相应
的DNA提取方法。绞股蓝、丹参、三七为临床常用中
药，所含成分与药性都不相同。本研究采用 CTAB法
和SDS法提取这三种中药 DNA，探讨这两种方法的
提取效果，确定了分别适合于它们的经济有效的
DNA提取方法，为进一步深入研究奠定了基础。
1 实验材料与设备
1．1实验材料
丹参 (Salvia miltiorrhiza Bunge)、绞 股 蓝
(Gynostemma pentaphyllum)采 自广西药用植物园
药圃，实验时采其新鲜嫩叶和根。三七(Panax no—
toginseng)采自广西靖西县。分离根叶，分装后于
液氮中保存。
1．2主要试剂和仪器
CTAB、SDS、EDTA、PVP、Tris、KAc均购 自上
收稿日期：2005-03-10 修回日期 ：2005-11—13
基金项目：广西科学基金(桂科基 0342003—3，0575065)[Supported by the Science Foundation of Guangxi(0342003．3．0575065)]
作者简介：陈莉(1979·)，女 ，广西柳州人 ，在读硕士 ，从事中药基因工程研究 ，(E-mail)flowerhua
_ 623(~163．COITI。
广西医科大学 2001级本科学生
‘通讯作者(Author for corresp0ndence，E-mail：wuyaosheng03@sina．corn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
138 广 西 植 物 27卷
海生工生物工程技术服务有限公司。其他试剂为国
产分析纯。TGLL一18K台式高速冷冻离心机；UV一
100—40日立分光光度计；DYY—I]I型电泳槽 Bio—Rad
PCR仪 ；el DOC 2000凝胶呈像系统。
2 方 法
2．1植物 DNA提取方法
(1) 法(王珍等，2003)：取嫩叶或根 2．5 g，
置于液氮研磨成粉。加入 7 n 预热的 1．5×CTAB
提 取 缓 冲 液 (1．5 CTAB，75 mmol／L Iris—HC1
(pH8．0)，15 mmol／L EDTA (pH8．0)，1．05 mol／L
NaC1)，混匀后 ，置于 65℃水浴 30 min。冷却至室温，
加入等体积氯仿／异戊醇(24／1)，充分混匀。5 000 r／
min离心20 min。取上清，加 1／lO体积 10 CTAB
和等体积的氯仿／异戊醇(24／1)，充分混匀，放置片
刻。5 000 r／min离心20 min。取上清，加等体积 1
CTAB沉淀 缓 冲液 (1．02，6 CTAB，50 mmol／L Tris-
HC1(pH8．0)，10 mmol／L EDTA(pH8．0))，轻轻颠倒
离心管至形成 DNA絮状沉淀，5 000 r／min离心 10
min使 DNA沉淀于管底。加 1．5～2 n 1 mol／L
NaC1 56℃水浴溶解 DNA，再加入 2～3 n 预冷的
95％乙醇沉淀 DNA，挑出 DNA置于 1．5 mL离心管
中。用 70 9，5乙醇洗涤沉淀两次，挥干后加适量 TE缓
冲液溶解。
(2)SDS法(王关林等，2002，参照文献略加改
进)：嫩叶和根各取 0．5 g，分别置于液氮研磨成粉，加
入提取缓 冲液 (100 mmol／LIris—HC1(pH8．0)，5O
mmol／L EDTA(pH8．0)，0．5 mol／L NaC1，用前加 巯
基乙醇至终浓度为 2 )7 n ，混匀后加入 1 n 109，6
SDS，65℃水浴 10~15 rain(间隔晃动2～3次)。加入
1．85 ml 5 mol／L KAc，混匀后冰浴 30 min。12 000 r／
min离心 15 min。取上清，加入等体积的氯仿／异戊醇
(24／1)，充分混匀，放置片刻。8 000 r／min离心 10
min。取上清，加入2／3体积预冷异丙醇，混匀，室温放
置30 min。8 000 r／min离心 10 min，弃上清。用 70
乙醇洗涤沉淀两次，挥干后加适量 TE缓冲液溶解。
2．2 DNA纯度 、收率检测
(1)纯度测定：将 DNA提取液适当稀释后，用
紫外分光光度计观测在紫外光 260 am和 280 am
的吸收值 Aze。和Az 并以 A。。／Azso的比值鉴定纯
度。采用 1 琼脂糖电泳，溴化乙锭染色，凝胶成像
系统观察并拍照。
(2)收率计算：DNA收取量( g)一A26。×5O×
稀释倍数×原液体积；DNA收率(~g／g)一DNA收
取量( g)／提取样 品量(g)。
3 结果与分析
3．1紫外分光光 度法检测不 同的提取方 法对 提纯
DNA效果的影响
表 1所示，CTAB法提取的丹参根、叶、绞股蓝
叶以及 SDS法提取的三七根 DNA A。。／A。∞在 1．6
～ 1．9之间，表明得到的 DNA较纯。而 CTAB法
提取的三七根 以及 SDS法提取 的丹参根 、叶 DNA
A。。／A。。<1．6，说明样品中有蛋白质和酚等污染。
SDS法提取的绞股蓝叶 DNA A2e。／A。∞>1．9，表 明
有 RNA 污染 (王关林 等，2002)。从 收率 上看，
CTAB法提取的绞股蓝叶最高，SDS法提取的三七
根和绞股蓝叶其次，其余的均在 3～l1之间。
表 1 CrAB法和 SDS法提取不同中药 DNA效果
Table 1 The effect of several Chinese herbal medicine DNA extracted by CTAB method and SDS method
3．2琼脂糖电泳检测不 同提取方 法对提 纯 DNA效
果的影响
电泳检测结果与紫外分光光度法检测结果基本
一 致。如图 1所示，除 SDS法提取的丹参根、叶和
绞股蓝叶外，其他的 DNA样品在电泳凝胶上都呈
现出清晰、迁移率很低的条带，溴酚蓝前无光亮区且
维普资讯 http://www.cqvip.com
1期 陈 莉等：几种中药 DNA提取方法的比较研究 139
点样孔内无荧光出现。由此可见，这些方法已基本
将蛋白质、多糖及一些带正电荷的杂质去除，得到了
较纯的 DNA。SDS法提取的丹参根 、叶和绞股蓝叶
点样孔亮且 DNA电泳速度较慢，说明样品所含糖
类较多，特别是 SDS法提取的绞股蓝叶，拖尾现象
明显。SDS法提取的丹参根、叶在溴酚蓝附近有光
亮区，特别是根的 DNA可看到两条较清晰的条带，
且后一条亮度约为前一条的 2倍 ，应为 rRNA(图
2)。说明此种方法在提取 DNA的同时获得了较完
整的 RNA。由此可见 ，无需对试剂和耗材进行特别
处理，将 SDS法 略 加 改 进 可 用 于 提 取 丹 参根 的
RNA
1 2 3 4 5
图 1 两种不同方法提取不同中药 DNA电泳图
Fig．1 The agarose gel electrOphoresis of several
Chinese herbaI medicines DNA extracted
by different methods
CrAB法：泳道 1，丹参根；泳道 2，丹参叶}泳道 3，绞股蓝叶；
泳遒 4，三七根．SOS法 泳道 5，三七根。
CTABmethod：lane1．root of Salviamiltiorrhiza；lane 2，leaf of
Salr]ia miltiorrhiza；lane 3，leaf of Gynostemma penmphyllum #
lane 4，root of Panax notoginseng；SDS method：
lane 5，root of Pa月nz notoginseng．
4 讨论
提取植物基因组 DNA的方法很多，最常见的
提取方法是 CTAB法和 SDS法。这两种方法对多
数植物基因组 DNA的提取均比较有效。但对某些
特定植物，或不同的器官部位，提取效果有明显差
异。有的植物适于用 SDS法(Haymes，1996；Oard，
1992)，有的植物适于用 CTAB法 (Cheng，1997；
Colins，1992；Luro，1995)。SDS和 CTAB都是一
类去污剂，其作用是破坏细胞膜释放 DNA。CTAB
法通过改变盐浓度选择性地沉淀 DNA，可早期去除
色素、多糖类杂质，避免 DNA与它们共沉淀后再难
分离而得到较纯的 DNA。但由于使用盐浓度改变
沉淀DNA会使 DNA沉淀不完全，收率会较低。因
而，对于丹参、绞股蓝等这些富含多糖、酚类、酮类等
次生代谢物的中药，应采用 CTAB法。而 SDS能较
好地使蛋白质变性沉淀，对于三七这类次生代谢产
物较易去除的中药，可采用 SDS法以提高收率。
1 2 3
图 2 SDS法提取的丹参根 、叶和绞股蓝叶 DNA电泳图
Fig．2 The agarose gel electrophoresis of root and
leaf of Salvia miltiorrhiza and leaf of Salvia
miltiorrhiza DNA extracted by SDS method
泳道 1：丹参叶；泳道 2：丹参根；泳道 3：绞股蓝叶。
lane 1：leaf of Salzda miltiorrhiza；lane 2：root of SaZ n
miltiorrhiza；lane 3：leaf of Gynostemma pentaphyllum．
绞股蓝叶富含酚类及多糖(郭锡勇，1999)，SDS
法提取的DNA呈深褐色且电泳拖尾现象严重，我
们对传统的 SDS法进行了改进。(1)提高提取缓冲
液中p一巯基乙醇的浓度至 6 ，并在研磨样品时加
入 2 9，6 PVP。PVP有很强的结合多酚化合物的能
力，可与多酚结合形成复合物，可以在抽提液中加入
PVP以去除多酚的影响(Kim，1997)。丁晓东等
(2000)在细胞裂解液中加入 PVP，解决了酚类、色
素和蛋白质等对荔枝 DNA质量的影响。p一巯基乙
醇作为强还原剂也能防止多酚的氧化，还可以打断
多酚氧化酶的二硫键使之失活。二者协同作用，有
效地抑制酚类物质对 DNA的影响。(2)增加 KAC
选择性沉淀多糖的次数。多糖对总 DNA样品的纯
度影响较大，若提取的样品中含多糖较多，DNA溶
解于 TE缓冲液后会形成粘稠的溶液。此外，多糖
可以抑制多种酶如限制性酶、Taq酶的活性(Fang，
1992)。增加 KAC选择性沉淀多糖的次数可有效
地去除多糖。(3)异丙醇沉淀后，改离心得到 DNA
为挑取絮状 DNA。通过离心得到的 DNA沉淀，常
常会使溶液 中的其它细小杂质沉淀下来而降低
DNA纯度。挑取絮状的 DNA大分子，既可排除杂
质，又可弃去部分小分子的 DNA，使得到的 DNA
较完整 。经过处理后得到的 DNA呈半透明状 ，电
(下转第 136页 Continue on page 136)
维普资讯 http://www.cqvip.com
136 广 西 植 物 27卷
杆菌仅将左右边界序列 RB和 LB之间的DNA序列
整合到植物染色体中。pGreen0029载体在 pSoup质
粒的协助下，在农杆菌 GV31Ol内的复制速度快，转
化植物的范围广，多克隆位点多，操作方便(Helens
等，2000)。因此，整个含 VP1基因的表达调控元件
(启动子 、增强子 、外源基因和 DHA)通过酶切连接，
构建在植物双元载体 pGreen0029的左右边界序列之
间，由于构建的VP1表达为独立的表达单元，因此不
需要鉴别其方向，左右边界序列之间还包含一个
NPTI基因，也是一个独立的表达单元，其表达产物
能够磷酸化卡那霉素及其衍生物，作为筛选转基因植
株的抗性基因。
本研究所构建 的 pGreen0029-VP1一DHA植物表
达载体，可用于烟草、马铃薯、玉米、番茄等植物的转
化，从而为用植物作为生物反应器生产口服疫苗提供
依据。
参考文献：
萨姆布鲁克 J，拉塞尔 DW．黄培堂，等(译)．2002．分子克隆实验
指南EM]．北京：科学出版社：27—29
Carrillo C，Wigdomvitz A。Olieros JC，et a1．1998．Protective immune
response to foot-mouth disease virus with VP1 expressed in trans—
genic plants[J]．J Virol，72(2)：1 688—1 690
Dus Santos MI，Wi【gdorovitz A，Trono K，eta1．2002．A novel meth—
odolngy to develop a fot and mouth disease virus(FMDV)pepati—
de-based vaccine in transgenic plants[J]．Vacin，20：1 141-1 147
Guo HC(郭慧琛)，Liu ZX(刘在新)，Sun SQ(孙世珞)，et a1．2003．
The latest pmgress of genetics vacc es against fo t-mouth disease
(IEI蹄疫基因疫苗研究进展)EJ]．
cine(动物医学进展)，24(4)：1—5
Helens RP。Edwards EA，Leyland NR，et a1．2000．pGreen ：a veJ-sa-
tile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant
transformation[J]．Plant Mol Biol，42(6)：819-832
Li C(李昌)，Jin NY(金宁一)，Wang G(王罡)，et a1．2003．On con—
structing expressing vectors for genetics engineering vaccine(植物
基因工程疫苗高效表达载体的构建)D-1．J Jilin Agric Univ
(吉林农业大学学报)，25(3)：253-256
Liu Y(刘铀)，Bi YZ(毕英佐 )，Ma JY(马静云)，et a1．2004．Con-
struction of VP1 plant expression vector of fo t-mouth disease viru s
(口蹄疫病毒 VP1植物表达载体的构建)EJ]．J Zha iang 0-
c~o．n Univ(湛江海洋大学学报)，24(4)：59-62
Mason H& 1992．Expression of hepatitis B surface antigen in trans—
genic plants[J]．Pro Natl Acad Sci USA，89，11 745—11 749
Mason PW，Grubman MJ．2001．Co ntroling fot and mouth disease
with vaccine[J]．Australian Veterinary Journal。79(5)：342-343
Peng ZO(彭志强)，Yu SY(俞守义)，Yu DQ(余迪求)，et a1．2002．
Co nstruction of plant expression vector containing the gene enco —
ding cholera toxin B subunit(编码霍乱肠毒索B亚单位基因植物
表达载体的构建)[J]．J First Military Medical Univ(第一军医
大学学报)，22(8)：736—738
Samuel AR，Knowles NJ．2001．Fot and mouth disease sevirus：
Cause of the recent crisis for the UK livestock industry[J]．Trends
ingenetics，17(8)：421—424．
Wang J(王捷)，Guo Y(郭 勇)．1999．Vaccine production in trans-
genic plant(疫苗生 产的新途径——转基 因植物)EJq．Guiha／a
(广西植物)，19(3)：26O一262
Wigdomvim A，Ca rri1o C，Dus Santos MJ，et a1．1999．Induction of a
protective antibody response tofo t andmouthdisease virusinmice
folowing oral or parenteral immunization with alfalfa transgenic
plants expressing the viral structure protein VP1 EJq．Virology，
255(2)：347—353
(上接第 139页 Continue from page 139)
泳拖尾现象消失。
参考文献：
王关林，方宏筠．2002．植物基因工程EM]．北京：科学出版社：742
— 744。755
郭锡勇，曹宇浩．1999．黔产绞股蓝 中多糖的含量测定EJq．贵阳
中医学院学报，21(3)：59-60
Cheng FS，Broun SK，Weeden NF．1997．A DNA extraction protocol
from various tisues in woody speies[J]．Hortscience，32(5)：921—
922
Co lins GG，Symon SRH．1992．Extraction of nuclear DINA from
grapevinel~ves by amodifned procedureFJG．P／amMolRep，10：
233- 235
Ding XD(丁晓东)，Lu LX(吕柳新)．2000．Study on genomic DNA
extraction from recalcitrant litchi(从顽拗植物荔枝中提取基因组
DNA技术的研究)[J]．Chin．，Appl Environ Biol(应用与环境
生物学报)，6(2)：142—145
Fang G，Hammar S。Grumet R．1992．A quick and inexpensive meth—
od for removing polysaccharides from plant genemic DNAEJ]．Bio-
techniques，13(1)：52—56
Haymes KM．1996．Mini—prep method suitable for a plant breeding
progran~J]．PlantMol Biol Rep，14(3)：280-284
Kim C S，Lee C H，Shin J S，et a1．1997．A simple and rapid method
for isolation of high quality genomic DNA from fruit tree and eoni—
fers using PVP[J]．NucleicAcid Res，25：1 O85—1 086
Luro F，Laigret F． 1995． Preparation of high molecular weight ge-
nornic DNA from nucleic of woody plants[J-]．Biotechniques，19：
388——392
Oard J H．Dronavalh S．1992．Rapid isolation of rice and maize DNA
for analysis by random-primer PCREJ]．Plant Mol Biol Rep，10：
236——241
Wang z(王珍)；Fang XJ(方宣钧)．2003．Plant DNA isolation(植物
DNA分离)[J]．Mol Plant Breeding(分子植物育种)，1(2)：281
— — 288
维普资讯 http://www.cqvip.com