全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(3)：243—247 2004年 5月
柱花草 RAPD反应体系的建立及其 ，
8个品种遗传多样性分析
蒋昌顺1，2，葛琴雅1，邹冬梅2，梁英彩3，张义正1
(1．四川大学生命科学学院，四川成都 610064；2．中国热带农业科学院热带作物品种
资源研究所，海南儋州 571737；3．广西畜牧研究所，广西南宁 530001)
摘 要：采用两种不同的方法分别从柱花草嫩叶及种子萌发芽中提取了高质量的DNA，并对柱花草 RAPD
反应中的各组分浓度及热循环因素进行优化，建立了柱花草 RAPD反应的最佳条件。在此基础上，用2O条随
机引物对8个柱花草品种进行了RAPD扩增，结果表明，其多样性达51．9％，品种间的遗传相似系数在0．53
～O．88之间；根据非加权成对平均数法(UPGMA)进行分类，获得了品种聚类树形图，8个柱花草品种均被明
显分开。
关键词：柱花草；RAPD反应体系；遗传多样性
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1OOO一3142(20o4)03—0243-05
Developing RAPD system for Stylosanthes and
· ‘ 1 ● ● J l ● n - l · - · ‘
genetic dlVerSltV analysis or-ei~lat Varieties
JIANG Chang—shun1，2，GE Qin-yaI，ZOU Dong-mei2，
LIANG Ying—cai3，ZHANG Yi—zheng1
(1．College of Life Sciences，Sichuan University，Chengdu 610064，China；2．The Institute of Tropical
Crop Germplasm，Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Danzhou 571737，China；
3．Guangxi Institute of Animal Science，Nanning 530001，China)
Abstract：High quality DNA was extracted from the young leaves and seedlings of Stylosanthes with two dif—
ferent methods。respectively．The RAPD reaction system f0r Stylosanthes was developed after optimizing the
concentrations of MgZ+，dNTPs，Taq DNA polymerase and template DNA．Eight varieties of Stylosanthes
spp．were analyzed by RAPD for genetic diversity．RAPD analysis was performed using twenty primers，and a
5 1_9 level of polymorphism was found．The dendrogram was constructed with UPGMA(unweighted pair
group method of averages)based on the RAPD data，and it showed genetic similarity from 53％ to 88％among
varieties．
Key words：Stylosanthes；RAPD reaction system：genetic diversity
柱花草(Stylosanthes spp．)又名笔花豆，为豆
科柱花草属多年生半直立草本植物，原产中南美洲、
热带北美洲、非洲及东南亚(Edye和 Cameron，
1984)。它们中的许多种是优良的热带豆科牧草，可
用于青饲料和干草粉生产、放牧、水土保持、胶园、果
园覆盖及绿肥作物等。我国于5O年代后期开始从
收稿日期：2003-06—09 修订日期：2003-09-08
基金项目：国家 自然科学基金项 目(30160046)；海南省地方配套基金项目。
作者简介：蒋昌顺(1967-)，男，广西全州人。博士生，副研究员，主要从事植物分子遗传学及基因工程研究。E-mail：changshu~
@yahoo．com．cn
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244 广 西 植 物 24卷
东南亚国家引进该牧草，并通过引种选育，先后培育
了 8个品种(邹冬梅等，2002)，现已在广东、广西、海
南、福建、云南、四川省攀枝花等地大面积种植并利
用(蒋昌顺，1995)。然而，目前对柱花草品种的遗传
变异知之甚少，特别是从分子水平鉴别它们的差异
更是空白。RAPD(Random amplified polymorphic
DNA)技术(wiliams等，1990)与其它分子标记如：
RFLP、SSR、AFLP等相比，具有操作简单、实验周
期短、DNA用量少、检测位点多等优点，已广泛用于
品种鉴定、种群基因分析及遗传图谱构建等方面，尤
其在植物种质资源 多样性 和品种鉴定研究 中，
RAPD技术以其快速、低价和较为理想的结果而受
到高度重视。本研究 旨在建立柱花草 RAPD反应
体系并分析我国现已选育的柱花草品种，为今后柱
花草品种鉴定、种质资源开发及育种提供分子证据。
1 材料和方法
1．1植物材料
我国选育的8个柱花草品种(表 1)，并分别由
育成单位提供种子 50 g。
1．2化学试剂
试验所用 Taq DNA聚合酶、dNTPs购自大连
宝生生物工程公司；所用引物(表 2)由上海生物工
程公司合成；电泳级琼脂糖为西班牙公司产品，其它
化学药品均为国内公司生产。
表 1 供试柱花草品种
Table 1 Stylosanthes varieties used in this study
1．3 DNA提取方法
1．3．1柱花草嫩叶总DNA提取法 根据 Weeks等
(1986)建立的CTAB法，并略作修改，具体方法如
下：从 1O株盆栽的柱花草植株上采集嫩叶约 0．40 g
并在液氮中研磨成细粉沫；将研磨后的细粉沫转至
1．5 mL的离心管中；加入 600 L 65℃预热的
DNA抽提缓冲液(2 CTAB，1．4 mol／L NaCI，20
mmol／L EDTA，100 mmol／L Tris—HCI(pH8．0)，
0．2 p一巯基乙醇)，混匀后，在 65℃水浴中放置 3O
min!分别用 600 L的酚 ；氯仿 ：异戊醇(25：24
：1)、氯仿 ：异戊醇(24：1)抽提 ；离心收集上清液
至无菌的eppendorf管中；用等体积的异丙醇和 1／
1O体积的 3 mol／L醋酸钠(pH5．2)沉淀 DNA；离
心收集 DNA，并在室温下凉干；加入 200 L的 TE
缓冲溶液(pH8．0)直至完全溶解 DNA；加入 10t~L
RNase(10 g／ L)，并于 37℃水浴中保温 1 h；用紫
表 2 试验所用引物
Table 2 Primers used in this study
外分光光度计测定DNA的含量；然后用0．8 的琼
脂糖电泳，检测 DNA 的质量，一2O℃条件下保存
DNA。
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3期 蒋昌顺等：柱花草RAPD反应体系的建立及其8个品种遗传多样性分析 245
1．3．2柱花草种子萌发芽DNA提取法 根据 SDS
法(Liu和Musial，1997)，并略作修改。具体方法如
下：取 20粒柱花草种子先用浓硫酸处理 1 min，蒸
馏水冲洗后凉干，然后分别用 3．0 次氯酸钠、70
酒精进行表面灭菌 15 min，再用无菌蒸馏水冲洗3
～ 4次，并将种子放在含有湿润滤纸的培养皿中发
芽生长5～6 d；取约10棵种子萌发芽在液氮中研磨
成细粉沫；将研磨后的细粉沫转至 l-5 mL的离心
管中；加入 600 L 65℃预热的 DNA抽提缓冲液
(2％SDS，0．1 mol／L NaCl，50 mmol／L EDTA，100
mmol／L Tris-HClCpH8．0))并混匀，后续的 DNA
抽提、溶解、检测和保存与嫩叶总 DNA提取方法相
同。
1．4 RAPD扩增反应
(1)扩增反应在 0．5 mL离心管中进行，25 L
的反应体系中含有：10×PCR缓 冲液 2．5 L，25
mmol／L MgCI2 2 L，2．5 mmol／L dNTPs 2 L，
0．2／~mol／L碱基引物 1 L，Taq DNA聚合酶 1．2
U，DNA模板25 ng，其余体积以无菌超纯水补足。
利用 MJ RESEARCH公司的 PTC．1o0TM Program-
mable Thermal Controler扩增仪进行扩增。
(2)扩增反应程序：94℃预变性 5 min，然后 94
℃变性 1 min，39℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，共
35个循环；最后 72℃延伸 10 min。
(3)电泳及照相：取 18 L的 PCR扩增产物与
2 L 10×的加样缓冲液混匀，在1．5 的琼脂糖凝
胶中电泳，5 V／em的条件下电泳 2 h。电泳结束
后，用 0．5 溴化乙锭染色，然后用凝胶成像系统
(GDS)照相。
1．5 RAPD反应条件优化
确定最佳反应条件时，对反应体系的因素设立
不同的梯度水平：M 浓度分别设置为 1、1．5、
2．0、2．5、3．0、4．0 mmol／L；模板 DNA量分别用
25、50、75、100 ng；Taq DNA聚合酶用量分别为
0．8、1．0、1．2、1．5 U；dNTPs浓度分别为 200、250、
300~mol／L；退火温度分别设置为 37、38、39、40
℃；72℃延伸时间分别为 30、60、90、120 s；热循环
数分别为 30、35、40。在整个反应过程中，除对上述
因素进行梯度设置而变动外，其余参数和反应条件
不变，并相应地调整无菌的超纯水量以保证反应体
系为25 L。
I．6 RAPD数据分析
分析 2O对引物对 8个柱花草品种所产生的
RAPD标记，并将每个标记定为独立的性状，有带的
记为1，没有带的记为0。按照以下公式计算品种间
的遗传相似系数：Gs=2N ／(N +N，)，其中Gs代
表两个品种间的遗传相似系数，N 代表两个品种
共有的带谱数，Nx与N，分别代表每个品种总的带
谱数；品种间的遗传距离 D一1一G 。利用 NTSYS-
pc软件(Version 2．0)(Rohlf，1994)进行品种相似
性分析，选用其中的DICE功能计算相似系数，按照
UPGMA分类法进行聚类，通过软件中的TREE功
能显示出聚类树形图。
2 结果与分析
2．1 DNA提取方法
本试验所改进的柱花草嫩叶 DNA提取法和种
子萌发芽 DNA提取法所提取的 DNA具有纯度高、
质量好、产率高等优点：其 DNA的 A260／A280值
分别为 1．82、1．85；且 DNA没有降解(图版 I：图
1)；上述两种 DNA提取方法的产率分别为 190、210
g。说明这两种DNA提取方法是切实可行的。
2．2 RAPD反应条件比较
RAPD反应条件，主要包括反应体系和热循环。
由于 RAPD对反应体系要求严格，扩增反应中各成
分的变化都可能影响扩增结果。因此，对影响
RAPD反应结果的主要因素：模板 DNA量、Taq
DNA聚合酶用量、M +浓度、dNTP浓度等进行比
较试验，确定最优的反应体系。在热循环条件中，主
要探索了退火温度、延伸时间和热循环数。至于延
伸温度，是由于 Taq DNA聚合酶本身的特性所决
定的，一般不需要调整。
2．2．1 Mg 浓度 Mg 是 RAPD反应中的一个重
要因素，M 为 Taq DNA聚合酶的激活剂，其浓
度不仅影响酶的活性及合成的可靠性，而且还影响
引物与模板的结合效率、模板与PCR产物的解链温
度以及产物的特异性和引物二聚体的形成。在实验
中共设定了 6个 Mg 梯度，从图版 I：图 2一A的扩
增结果可知，Mg 浓度在 1．5～2．0 mM时!能产生
较多的清淅带型，其它 Mg 浓度则出现非特异性
扩增。因此，对于柱花草 PCR扩增，选择 l-5～2．0
mM的Mg 浓度，可获得最佳的扩增效果。
2．2．2 Taq DNA聚合酶浓度 T口q DNA聚合酶浓
度是扩增反应的关键因素，改变 Taq DNA聚合酶
浓度，从低到高共设置4个 Taq DNA聚合酶浓度
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246 广 西 植 物 24卷
梯度。由图版I：图2一B可见，在 25 L的反应体系
中，使用 1．2 U的Taq DNA聚合酶浓度最经济有
效，扩增效果最佳。
2．2．3 DNA模板浓度 不同植物 PCR反应中其
DNA模板浓度有差异，在本试验 25 L的 RAPD
反应中进行了4种模式板浓度的比较(图版 I：图2一
C)，使用 25 ng的模板 DNA所扩增的带最清淅，模
板DNA量过高，会出现弥散不清的带型。
2．2．4 dNTP浓度 三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)作
为PCR反应的原料，其浓度的大小直接影响产物的
产量、特异性及合成的可靠性。实验中共设置 4个
梯度。结果表明，dNTP的浓度在 0．2～0．25 mM
时，产生条带多且清淅；当其浓度达到 0．3 mM时，
出现的条带较少(图版 I：图 2一D)。当 dNTP浓度
过高时，容易与 Mg。 结合而降低游离 M 浓度，
从而影响Taq DNA聚合酶的活性。
2．2．5热循环优化 实验结果表明：PCR扩增时，94
℃先预变性 5 min，然后 94℃变性 1 min，39℃退火
1 min，72℃延伸6O S，共35个循环，扩增效果最好
(图略)。
表 3 八个柱花草品种间的遗传距离
Table 3 Genetic distance among 8 Stylosanthes varieties
品种 格拉姆 热研 1O号 热研5号 q07q07 热研 7号 热研2号 西卡 有钩
Varieties Graham No．10 No．5 ⋯ ’ No．7 No．2 Seca Verano
格拉姆Graham
热研 1O号 No．10
热研5号 No．5
’
907
热研 7号 No．7
热研 2号 No．2
西卡 Seca
有钩 Verano
O
0．407 4
O．367 4
0．411 8
O．518 6
O．411 8
0．463 0
O．532 3
O
0．222 2
0．203 8
O．315 8
O．236 4
O．453 2
0．426 5 O
2．3 8个品种的RAPD分析
2．3．1多态性分析 用 2O条随机引物对 8个柱花
草品种进行了 RAPD扩增 ，建立了 DNA指纹图，所
获得的带型清淅明显。图3表示的是以引物1和引
物 4对 8个柱花草品种扩增产物电泳结果。每条引
物扩增的条带数在 11～14的范围，条带的大小为
300~2500 bp。共获得241条带，其中特异性带105
条，平均多态性为 51．9 。
2．3．2遗传距离 对 8个柱花草品种间的遗传距离
分析表明，有钩柱花草与格拉姆柱花草间的距离最
大，达 0．532 3，其次为西卡柱花草与热研 7号柱花
草，距离为0．523 8，热研 2号柱花草与 907柱花草
的距离最小，为 0．122 4(表 3)。
2．3．3聚类分析 按照 UPGMA法(非加权平均平
均数)对 8个柱花草品种进行聚类分析，获得了的聚
类树形图(图1)，8个品种被明显分开。它们的遗传
相似系数在0．53t0．88之间；西卡与有钩柱花草的
关系密切，聚为一支，其它圭亚那种(格拉姆、热研
1O号、热研 5号、907、热研 2号、热研 7号)构成另
一 分支。热研 1O号与热研 5号、907、热研 2号的关
系较近，其中热研 2号与 907柱花草的关系最近，两
者的相似系数高达 0．88。
3 结论与讨论
本试验改进了柱花草嫩叶及其种子萌发芽的
DNA提取方法，建立了柱花草的RAPD反应体系
并对其条件进行了优化，同时用该技术分析了 8个
柱花草品种的遗传多态性，如：多态性水平、遗传距
离及其聚类。以 2O条随机引物对 8个柱花草品种
分析结果表明：它们的平均多态性为 51．9 ，遗传
相似系数在0．53～0．88之间，热研 2号柱花草与
907柱花草遗传相似系数最大，为0．88；通过聚类分
析，8个柱花草品种被明显分开。西卡与有钩关系
密切，聚为一支，其它圭亚那种(格拉姆、热研 2号、
热研 5号、907，热研 7号、热研 1O号柱花草)构成另
一 分支。907柱花草是以热研 2号为材料经辐射育
种所得(梁英彩等，1998)，本试验结果也与此相吻
合。柱花草是一类重要的热带豆科牧草，本试验所
建立的 RAPD反应条件及其 8个柱花草品种的
DNA指纹图，对于柱花草品种以及其它柱花草种质
的鉴定有重要意义。
O
5
O
O
3 8
3 O 0 铝 褐
O O
8 8 6
4 3 2 0 ∞
O O O
O 4 O 4
O 2 9 4 0 他
O O O O
9 2 O O O
2 9 O O O ¨ 盯
O O O O O
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3期 蒋昌顺等：柱花草RAPD反应体系的建立及其8个品种遗传多样性分析 247
O．5O n6o n 70 0．80 0
$imi Iai rty ooeffioient
图 1 八个柱花草品种的聚类树形图
Fig．1 Dendrogram obtained from RAPD data of
eight Stylosanthes varieties by UPGMA
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JIANG Chang—shun，et a1．：Developing RAPD system for Stylosanthes and
genetic diversity analysis of eight varieties
M 1 2
M 1 2 3
图 1 两种不同提取方法的柱花草 DNA电泳。
Fig l Stflosanthes DNA extracted with two
methods separated on 0．8 argarose ge1．
M：DNA标准分于量·1．蜮片 DNA提取怯 l
2．种子萌发芽 DNA提取法．
M ：XDNA／Htnd lII㈣ rk r(Sizes shown)I1．Young leaves DNA
isota~ed with CTAB：2 SeedUng DNA isolated with SDS．
4 5 6 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4 M 1 2 3 4
图版 I
PIate T
图 2 柱花草 RAID反应体系的建立
Fig．2 Developing RAPD reaction system for ylosanthes
八不同铣离子椎整条件下的扩增产暂电诛 E】吲r0ph0 Df RAPD produ~s with dlf~ -t M ‘m眦 几t糟tbns(M：1 Kb ladde~F 1=1 5 mMi 2：2．0
mM；3：2．5 raM)4：3．0 mM F 5；3 5mM·6：4．0 raM)}B不同酶漱度条件下的扩增产杼电诛 El~trophortmis of RAPD prod~ts [h diferentTaq
DNA polym~se unit‘M：1 Kbtadde~)1‘0 8u；2 E1 u；3：1．2 U}4一1．S )}C．不同 DNA模式板浓度条件下的扩增产物电诛 Eleetrop．hor~is of
RAPD products th d~fferemDNA c~=centrations(M：DNA~tarker,l：25 ng；2：∞ }3：75 ng)4：100 rig)I13,不同dNTPs拙度蠢件下的扩增产暂
电诛 El~tmpharesls ofIL,YPD prod~ts,dth difcaent dNTP concentrations(M：1 Kbladderl】：0mM1 2：0 21lM1 3：0．25mM1{{O．30mM3。
M 1 2 3 4 5 6 7 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8
图 3 引物 1(A)和引物 4(B)对八个柱托革
品种扩增的RAPD指纹图
Fig．3 RAPD f[ngerprintlng of eight
Stytosanthes varieties
品种编号见表 1，M为 i Kh Ladder．
A．Amplified products with primer 1 I B AmpI[fied products
with p6mer{l The number of varieties【 the e Bs
thatinthe【ahie1 andM Lsf Kh Ladder
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